慢性乙型肝炎肝组织表达FasL蛋白、mRNA及Fas的实验研究
作者：胡瑾华 张玲霞 朱克顺 王松山 赵景民 程云 王慧芬 王琳杰
单位：100039 北京，解放军第302医院
关键词：细胞凋亡；FasL；肝炎，乙型；m核糖核酸；原位杂交
中华传染病杂志990105 【摘要】 目的 研究FasL、Fas在慢性乙型肝炎(CHB)肝组织中的表达及意义。方法 采用FasL多克隆抗体、人工合成FasL寡核苷酸探针对CHB及HBV慢性携带者肝组织进行免疫组化和原位杂交检测。部分组织同时检测Fas抗原。结果 肝组织浸润单个核细胞及肝细胞都不同程度检测出FasL蛋白及其mRNA，表达程度随肝脏炎症坏死程度加重而增加。FasL、Fas阳性肝细胞分布及表达程度有一致性。结论 经FasL、Fas介导的细胞凋亡机制在CH致病中起重要作用，不仅存在CTLs介导的细胞免疫作用，肝细胞也可能通过表达FasL发生细胞自杀和同胞相杀。
, 百拇医药
Study on Fas ligand(FasL) protein and FasL mRNA in liver tissues of patients with chronic hepatitis B
HU Jinghua, ZHANG Lingxia, ZHU Keshun, et al.
The 302th Hospital of PLA, Beijing 100039
【Abstract】 Objective In order to study the expression of Fas ligand(FasL) protein and FasL mRNA in liver tissues of CHB and to evaluate the possible pathogenetic role of apoptosis mediated by Fas system in chronic hepatitis B.Methods FasL protein were detected in eighty liver biopsy samples from 68 cases of CHB and 12 cases of HBV carriers immunohistochemically. Some of them were immunostained for Fas antigen. Nine cases of CHB were investigated FasL mRNA by in situ hybridization.Results FasL protein and its mRNA were observed both in liver-infiltrating mononuclear cells(MNCs,including lymphocytes, monocytes and plasmacytes) and in cytoplasm of hepatocytes. The expression of FasL protein were closely linked to the degree of liver lesion. Among those liver tissues with CHB, FasL-positive hepatocytes were essentially consistent both in expression degree and in location with Fas-positive hepatocytes; but they were inconsistent among those liver tissues of HBV carriers.Conclusion The results emphasize that apoptosis caused by CTL through Fas-mediated pathway may play an important role in CHB. FasL-positive plasmacytes suggest that free FasL was also responsible for liver lesion. Most notably, FasL-positive hepatocytes might express cytotoxic activity and eliminate Fas-positive hepatocytes by both “fratricide” and “suicide”.
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【Key words】 Apoptosis FasL Hepatitis B mRNA In situ hybridization
CTLs(细胞毒性T细胞)介导的细胞免疫在慢性乙型肝炎的发病机制中起着重要作用。体外实验已证实，CTLs的主要作用机制之一是通过Fas ligand(FasL)介导Fas阳性的靶细胞凋亡(Apoptosis)[1]。我们利用免疫组化及核酸分子原位杂交技术对慢性病毒性肝炎(CH)活检肝组织进行了FasL蛋白及其mRNA的定位检测，了解FasL在慢性乙型肝炎(CHB)肝组织中的表达状况，同时对部分肝组织进行FasL、Fas连续切片免疫组化检测以探讨Fas系统与CHB肝损害的关系。
材料和方法
一、肝组织
肝穿刺活检组织取自80例1990～1997年北京解放军第302医院住院患者，10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋切片。其中慢性乙型肝炎68例，男57例，女11例，平均年龄(28.75±10.94)岁，HBV慢性携带者12例，男9例，女4例，平均年龄28.25(11～42)岁。临床及组织病理诊断按1995年第五次全国传染病寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎防治方案。
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二、免疫组化
染色步骤见参考文献[2，3]。结果判断：“—”无阳性细胞，“+”阳性细胞占同类细胞比例<1/3，“++”阳性细胞占同类细胞比例1/3～2/3，“+++”阳性细胞占同类细胞比例>2/3。
三、原位杂交
取上述标本中乙型肝炎9例(免疫组化肝细胞FasL阴性1例，“+”2例，“+ +”4例，“+ + +”2例)进行核酸原位杂交。FasL寡核苷酸探针序列为：5′-ATGTTTCAGCTCTTCC ACCTACAGAAG-GAGCTGGCAGAACTCCGAGAG-3′，由中国医学科学院微生物所人工合成，Dig标记和检测试剂盒(Boehringger Mannheim, Germany)标记探针。石蜡切片5μm，探针浓度1μg/ml，42°C杂交20小时。杂交后染色抗Dig抗体(1∶800)37°C 30分钟，室温2小时，NBT/BCIP显色5小时。肝组织甲基绿复染。
, 百拇医药
杂交阳性对照设大鼠淋巴结冰冻切片；阴性对照设：(1) 杂交液不加探针，(2) 用RNA酶预处理后再行杂交。
四、统计学方法
采用似然比χ2检验。
结果
一、FasL蛋白在CHB肝组织中的表达
免疫组化染色显示，CHB肝组织内碎屑及桥样坏死区可见部分单个核细胞浆FasL阳性，阳性率51.47%；但更多的肝组织(94.12%)肝细胞胞浆不同程度表达FasL，阳性细胞主要分布在炎症坏死区周围。CHB肝组织中FasL表达程度随肝组织炎症坏死加重而增加[2]。
其中48例CHB及12例HBV慢性携带者肝组织同时进行了FasL、Fas免疫组化检测，连续切片观察显示：CHB肝组织中FasL、Fas阳性肝细胞在炎症坏死区附近分布有很大程度的一致性(图1a,1b)，两者在肝细胞中表达程度基本一致的组织29例，占60.42%(表1，P=0.01);同时对照的12例HBV携带者FasL、Fas表达程度不一致(表1，P>0.05)，携带者肝细胞FasL阳性率为41.67%(5/12)。
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图1 肝组织内FasL、Fas阳性肝细胞分布一致(1a)FasL阳性肝细胞(1b)Fas阳性肝细胞DAB显色，苏木素复染200×
表1 CHB患者及HBV慢性携带者
肝细胞表达FasL/Fas比较 Fas
表达程度
CHB患者FasL表达
HBV携带者FasL表达
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似然比χ2=16.941 P=0.01；似然比χ2=10.755 P=0.096
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二、原位杂交结果
4例免疫组化阳性肝组织中碎屑样、灶状坏死周围单个核细胞及肝细胞胞浆有显著的FasL mRNA阳性杂交信号(图2a,2b)；肝细胞内可见有高拷贝量和低拷贝量两种表达方式，以低拷贝量表达更多见。部分窦细胞也表达FasL mRNA。对照大鼠淋巴结内较多淋巴细胞胞浆呈FasL mRNA较强表达，阴性对照无阳性杂交信号。
图2 肝组织碎屑样坏死区附近浸润单个核细胞及周围肝细胞FasL mRNA阳性(部分肝细胞内低拷贝量表达FasL mRNA↑)×NBT/BCIP显色，甲基绿复染图2a:200× 2b：400×
讨论
, 百拇医药 目前证实CTLs可通过FasL介导Fas阳性靶细胞凋亡，这是CTLs主要作用机制之一[1，4]，而细胞免疫损伤与CHB发病有着密切的交联，肝病时细胞坏死与凋亡并存[5]。本实验51.9%CHB肝组织碎屑、灶状坏死区内浸润单个核细胞FasL阳性，其中包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，表达程度与肝脏炎症程度一致。说明经FasL、Fas的细胞凋亡机制确实参与慢性肝炎的致病过程，一方面通过CTL细胞免疫作用，另一方面浆细胞FasL阳性提示分泌型可溶性FasL可能在肝损伤中也起一定作用。
免疫组化检测显示CHB肝细胞大量表达FasL，原位杂交进一步在肝细胞内检出FasL mRNA，证实CHB肝细胞能自身合成表达FasL。本次实验FasL mRNA检出率为44%，低于免疫组化FasL蛋白阳性率，其原因可能为：(1) 实验标本采用石蜡包埋切片；(2) 标本留取前后间隔7年，可能影响部分组织中mRNA的检出；(3) 实验发现较多肝细胞FasL mRNA低拷贝量表达，影响检出率。今后拟采用冰冻切片，原位PCR方法，效果将更理想。
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CHB肝细胞大量表达FasL意义何在?Galle等[6]在发现酒精性肝病肝细胞表达FasL时曾提出“细胞自杀”和“同胞相杀”的假设。FasL免疫组化结果分析初步提示FasL阳性肝细胞与CHB肝组织炎症损害有关。进一步对部分肝组织FasL/Fas的对照研究，结果发现FasL、Fas肝细胞在组织炎症坏死区附近分布基本上一致，统计学分析显示表达程度也有极显著的一致性。提示表达FasL的肝细胞可能充当效应细胞，诱导邻近Fas阳性肝细胞凋亡，也就是“同胞相杀(Fratricide)”。肝细胞还可能同时表达FasL和Fas发生“细胞自杀(suicide)”。肝细胞间经Fas系统介导的细胞凋亡可能是CHB的重要致病机制之一，而FasL、Fas相伴表达则是这一机制作用的关键。
本实验观察到FasL/Fas与CHB肝组织炎症坏死密切相关。同时也注意到部分组织表达FasL量与肝损害不一致，应考虑FasL蛋白有功能缺陷或其他抑制因素作用可能。对Fas系统介导的细胞凋亡与CHB的关系研究仅仅是一个开端，还须大量体内外模型实验的进一步证实，这将为进一步探讨肝炎发病机制及治疗提供新的途径。
, 百拇医药
参考文献
1 Kaga D, Vignaux F, Ledermann B, et al. Fas and perforin pathways as major mechanisms of T cell-mediated cytotoxity. Science, 1994,265:528-531.
2 胡瑾华，张玲霞，王慧芬，等.慢性乙型肝炎肝组织FasL的免疫组化研究.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12：64-66.
3 朱克顺，张玲霞，王慧芬，等.Fas抗原介导的细胞凋亡在乙型肝炎肝组织中表达状况初探.中华实验和临床病毒学杂志，1997，11：336-339.
4 Nagata S, Golstein P. The fas death factor. Science, 1995,267:1449-1455.
5 Patel T, Gores GJ. Apoptosis and hepatobiliary disease. Hepatology, 1995,21:1725-1741.
6 Galle PR, Hofmann WJ, Walczak H, et al. Involvement of the CD95(Apo-1/Fas) receptor and ligand in liver damage. Exp Med, 1995,182:1223-1230.
(收稿：1997-12-15 修回：1998-05-04), 百拇医药
单位：100039 北京，解放军第302医院
关键词：细胞凋亡；FasL；肝炎，乙型；m核糖核酸；原位杂交
中华传染病杂志990105 【摘要】 目的 研究FasL、Fas在慢性乙型肝炎(CHB)肝组织中的表达及意义。方法 采用FasL多克隆抗体、人工合成FasL寡核苷酸探针对CHB及HBV慢性携带者肝组织进行免疫组化和原位杂交检测。部分组织同时检测Fas抗原。结果 肝组织浸润单个核细胞及肝细胞都不同程度检测出FasL蛋白及其mRNA，表达程度随肝脏炎症坏死程度加重而增加。FasL、Fas阳性肝细胞分布及表达程度有一致性。结论 经FasL、Fas介导的细胞凋亡机制在CH致病中起重要作用，不仅存在CTLs介导的细胞免疫作用，肝细胞也可能通过表达FasL发生细胞自杀和同胞相杀。
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Study on Fas ligand(FasL) protein and FasL mRNA in liver tissues of patients with chronic hepatitis B
HU Jinghua, ZHANG Lingxia, ZHU Keshun, et al.
The 302th Hospital of PLA, Beijing 100039
【Abstract】 Objective In order to study the expression of Fas ligand(FasL) protein and FasL mRNA in liver tissues of CHB and to evaluate the possible pathogenetic role of apoptosis mediated by Fas system in chronic hepatitis B.Methods FasL protein were detected in eighty liver biopsy samples from 68 cases of CHB and 12 cases of HBV carriers immunohistochemically. Some of them were immunostained for Fas antigen. Nine cases of CHB were investigated FasL mRNA by in situ hybridization.Results FasL protein and its mRNA were observed both in liver-infiltrating mononuclear cells(MNCs,including lymphocytes, monocytes and plasmacytes) and in cytoplasm of hepatocytes. The expression of FasL protein were closely linked to the degree of liver lesion. Among those liver tissues with CHB, FasL-positive hepatocytes were essentially consistent both in expression degree and in location with Fas-positive hepatocytes; but they were inconsistent among those liver tissues of HBV carriers.Conclusion The results emphasize that apoptosis caused by CTL through Fas-mediated pathway may play an important role in CHB. FasL-positive plasmacytes suggest that free FasL was also responsible for liver lesion. Most notably, FasL-positive hepatocytes might express cytotoxic activity and eliminate Fas-positive hepatocytes by both “fratricide” and “suicide”.
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【Key words】 Apoptosis FasL Hepatitis B mRNA In situ hybridization
CTLs(细胞毒性T细胞)介导的细胞免疫在慢性乙型肝炎的发病机制中起着重要作用。体外实验已证实，CTLs的主要作用机制之一是通过Fas ligand(FasL)介导Fas阳性的靶细胞凋亡(Apoptosis)[1]。我们利用免疫组化及核酸分子原位杂交技术对慢性病毒性肝炎(CH)活检肝组织进行了FasL蛋白及其mRNA的定位检测，了解FasL在慢性乙型肝炎(CHB)肝组织中的表达状况，同时对部分肝组织进行FasL、Fas连续切片免疫组化检测以探讨Fas系统与CHB肝损害的关系。
材料和方法
一、肝组织
肝穿刺活检组织取自80例1990～1997年北京解放军第302医院住院患者，10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋切片。其中慢性乙型肝炎68例，男57例，女11例，平均年龄(28.75±10.94)岁，HBV慢性携带者12例，男9例，女4例，平均年龄28.25(11～42)岁。临床及组织病理诊断按1995年第五次全国传染病寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎防治方案。
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二、免疫组化
染色步骤见参考文献[2，3]。结果判断：“—”无阳性细胞，“+”阳性细胞占同类细胞比例<1/3，“++”阳性细胞占同类细胞比例1/3～2/3，“+++”阳性细胞占同类细胞比例>2/3。
三、原位杂交
取上述标本中乙型肝炎9例(免疫组化肝细胞FasL阴性1例，“+”2例，“+ +”4例，“+ + +”2例)进行核酸原位杂交。FasL寡核苷酸探针序列为：5′-ATGTTTCAGCTCTTCC ACCTACAGAAG-GAGCTGGCAGAACTCCGAGAG-3′，由中国医学科学院微生物所人工合成，Dig标记和检测试剂盒(Boehringger Mannheim, Germany)标记探针。石蜡切片5μm，探针浓度1μg/ml，42°C杂交20小时。杂交后染色抗Dig抗体(1∶800)37°C 30分钟，室温2小时，NBT/BCIP显色5小时。肝组织甲基绿复染。
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杂交阳性对照设大鼠淋巴结冰冻切片；阴性对照设：(1) 杂交液不加探针，(2) 用RNA酶预处理后再行杂交。
四、统计学方法
采用似然比χ2检验。
结果
一、FasL蛋白在CHB肝组织中的表达
免疫组化染色显示，CHB肝组织内碎屑及桥样坏死区可见部分单个核细胞浆FasL阳性，阳性率51.47%；但更多的肝组织(94.12%)肝细胞胞浆不同程度表达FasL，阳性细胞主要分布在炎症坏死区周围。CHB肝组织中FasL表达程度随肝组织炎症坏死加重而增加[2]。
其中48例CHB及12例HBV慢性携带者肝组织同时进行了FasL、Fas免疫组化检测，连续切片观察显示：CHB肝组织中FasL、Fas阳性肝细胞在炎症坏死区附近分布有很大程度的一致性(图1a,1b)，两者在肝细胞中表达程度基本一致的组织29例，占60.42%(表1，P=0.01);同时对照的12例HBV携带者FasL、Fas表达程度不一致(表1，P>0.05)，携带者肝细胞FasL阳性率为41.67%(5/12)。
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图1 肝组织内FasL、Fas阳性肝细胞分布一致(1a)FasL阳性肝细胞(1b)Fas阳性肝细胞DAB显色，苏木素复染200×
表1 CHB患者及HBV慢性携带者
肝细胞表达FasL/Fas比较 Fas
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HBV携带者FasL表达
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二、原位杂交结果
4例免疫组化阳性肝组织中碎屑样、灶状坏死周围单个核细胞及肝细胞胞浆有显著的FasL mRNA阳性杂交信号(图2a,2b)；肝细胞内可见有高拷贝量和低拷贝量两种表达方式，以低拷贝量表达更多见。部分窦细胞也表达FasL mRNA。对照大鼠淋巴结内较多淋巴细胞胞浆呈FasL mRNA较强表达，阴性对照无阳性杂交信号。
图2 肝组织碎屑样坏死区附近浸润单个核细胞及周围肝细胞FasL mRNA阳性(部分肝细胞内低拷贝量表达FasL mRNA↑)×NBT/BCIP显色，甲基绿复染图2a:200× 2b：400×
讨论
, 百拇医药 目前证实CTLs可通过FasL介导Fas阳性靶细胞凋亡，这是CTLs主要作用机制之一[1，4]，而细胞免疫损伤与CHB发病有着密切的交联，肝病时细胞坏死与凋亡并存[5]。本实验51.9%CHB肝组织碎屑、灶状坏死区内浸润单个核细胞FasL阳性，其中包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，表达程度与肝脏炎症程度一致。说明经FasL、Fas的细胞凋亡机制确实参与慢性肝炎的致病过程，一方面通过CTL细胞免疫作用，另一方面浆细胞FasL阳性提示分泌型可溶性FasL可能在肝损伤中也起一定作用。
免疫组化检测显示CHB肝细胞大量表达FasL，原位杂交进一步在肝细胞内检出FasL mRNA，证实CHB肝细胞能自身合成表达FasL。本次实验FasL mRNA检出率为44%，低于免疫组化FasL蛋白阳性率，其原因可能为：(1) 实验标本采用石蜡包埋切片；(2) 标本留取前后间隔7年，可能影响部分组织中mRNA的检出；(3) 实验发现较多肝细胞FasL mRNA低拷贝量表达，影响检出率。今后拟采用冰冻切片，原位PCR方法，效果将更理想。
, http://www.100md.com
CHB肝细胞大量表达FasL意义何在?Galle等[6]在发现酒精性肝病肝细胞表达FasL时曾提出“细胞自杀”和“同胞相杀”的假设。FasL免疫组化结果分析初步提示FasL阳性肝细胞与CHB肝组织炎症损害有关。进一步对部分肝组织FasL/Fas的对照研究，结果发现FasL、Fas肝细胞在组织炎症坏死区附近分布基本上一致，统计学分析显示表达程度也有极显著的一致性。提示表达FasL的肝细胞可能充当效应细胞，诱导邻近Fas阳性肝细胞凋亡，也就是“同胞相杀(Fratricide)”。肝细胞还可能同时表达FasL和Fas发生“细胞自杀(suicide)”。肝细胞间经Fas系统介导的细胞凋亡可能是CHB的重要致病机制之一，而FasL、Fas相伴表达则是这一机制作用的关键。
本实验观察到FasL/Fas与CHB肝组织炎症坏死密切相关。同时也注意到部分组织表达FasL量与肝损害不一致，应考虑FasL蛋白有功能缺陷或其他抑制因素作用可能。对Fas系统介导的细胞凋亡与CHB的关系研究仅仅是一个开端，还须大量体内外模型实验的进一步证实，这将为进一步探讨肝炎发病机制及治疗提供新的途径。
, 百拇医药
参考文献
1 Kaga D, Vignaux F, Ledermann B, et al. Fas and perforin pathways as major mechanisms of T cell-mediated cytotoxity. Science, 1994,265:528-531.
2 胡瑾华，张玲霞，王慧芬，等.慢性乙型肝炎肝组织FasL的免疫组化研究.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12：64-66.
3 朱克顺，张玲霞，王慧芬，等.Fas抗原介导的细胞凋亡在乙型肝炎肝组织中表达状况初探.中华实验和临床病毒学杂志，1997，11：336-339.
4 Nagata S, Golstein P. The fas death factor. Science, 1995,267:1449-1455.
5 Patel T, Gores GJ. Apoptosis and hepatobiliary disease. Hepatology, 1995,21:1725-1741.
6 Galle PR, Hofmann WJ, Walczak H, et al. Involvement of the CD95(Apo-1/Fas) receptor and ligand in liver damage. Exp Med, 1995,182:1223-1230.
(收稿：1997-12-15 修回：1998-05-04), 百拇医药