丙型肝炎肝组织和血清HCV RNA含量及其关系的研究
作者：张复春 蔡晓莉 黄己实 冼超 吴婉芬
单位：510060 广州市第八人民医院传染病研究所
关键词：肝炎病毒，丙型；定量聚合酶链反应；活组织检查
中华传染病杂志990104 【摘要】 目的 了解丙型肝炎肝组织和血清中丙型肝炎病毒(HCV) RNA的含量及其相互关系。方法 采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测24例慢性丙型肝炎患者肝组织和血清HCV RNA含量。结果 肝组织中HCV RNA含量(108至1012拷贝/克)与血清病毒含量(105至109.2拷贝/毫升)呈显著正相关(P<0.01)。每克感染肝组织HCV RNA含量高于每毫升血清的102至104拷贝。慢性活动性肝炎肝组织和血清中HCV RNA含量显著高于慢性迁延性肝炎。动态结果显示，血清HCV RNA含量与ALT水平呈显著正相关。结论 提示慢性丙型肝炎病变程度与肝组织中HCV RNA含量有关，血清中HCV RNA含量可作为监测肝内HCV RNA复制程度的一个指标。
, 百拇医药
Study on the relationship of HCV RNA between serum and liver tissue of hepatitis C
ZHANG Fuchun, CAI Xiaoli, HUANG Jishi, et al.
Institute of Infectious Diseases, The Eighth People's Hospital of Guangzhou, Guangzhou 510060
【Abstract】 Objective In order to study the amounts of the hepatitis C viral RNA in the serum associated with that in the liver tissue.Methods The concentrations of HCV RNA were detected in 24 patients with chronic hepatitis C by quantitative polymerase chain reaction which was based on a Amplisensor assay. Results The amounts of HCV RNA (105 to 109.2 copies/ml) in the serum correlated with that in the liver tissue (108 to 1012 copies/g) (P<0.01). One gram of the infected liver tissue contained 102 to 104 times as many copies of the viral RNA as that of 1ml serum. Liver tissue of chronic aggressive hepatitis contained significantly higher amounts of the viral RNA than those of chronic persistent hepatitis. There was a positive correlation between the titer of HCV RNA in the serum and ALT level. Conclusion These results suggested that a significant correlation between the quantity of HCV RNA in the liver and histological acti-vity of chronic hepatitis C, and the serum HCV RNA levels could be considered as a marker for monitoring intrahepatic viral RNA.
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【Key words】 Hepatitis C virus Quantitative PCR Biopsy
血清HCV RNA定量检测可直接反映丙型肝炎(丙肝)的病毒血症水平，对预测和评价干扰素治疗效果有重要作用[1]。国外研究报道HCV血症水平与肝组织中HCV复制活跃程度相关[2]，国内有关研究报道甚少。为了解丙肝肝组织中HCV RNA含量变化，我们采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测24例慢丙肝患者肝组织中HCV RNA含量，并与血清中HCV RNA含量的关系进行了探讨。
材料和方法
一、研究对象
24例慢性丙肝(慢丙肝)均为1992年10月至1996年12月我院住院患者，平均年龄40.3(18～60)岁，其中15例为男性，9例为女性。所有病例进行肝组织穿刺活检，病理诊断为慢性活动性肝炎(CAH)14例，慢性迁延性肝炎(CPH)10例。以上病例血清抗-HCV和HCV RNA阳性，ALT升高持续半年以上，除外甲、乙、丁及戊型肝炎病毒感染。有输血史者16例。5例患者接受干扰素治疗6个月，其中2例进行治疗前后两次肝活检。取部分肝组织冻存于-70°C备用，同时收集血清标本，置-20°C保存，统一检测。健康献血员血清为阴性对照。
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二、肝组织和血清HCV RNA提取
按异硫氰酸胍一步法[3]提取RNA。取冷冻肝组织20毫克，在裂解溶液中剪碎，研磨匀浆，然后提取RNA。所有血清和肝组织标本与阴性对照标本同时进行RNA提取。
三、HCV RNA定量检测
采用荧光定量PCR技术[4]。已知量的HCV RNA阳性标准为纯化的病毒RNA。引物序列：在HCV RNA的5′末端非编码区内选择内、外引物。将抽提RNA溶于DEPC溶液中，待溶解后即刻取上清液5微升进行逆转录反应合成cDNA，然后分别加入不对称扩增引物和信号扩增引物等，进行荧光PCR检测。同时将已知量的纯化HCV RNA同步进行PCR扩增，建立外参标准曲线。PCR结束后，应用计算机软件即可算出样品中HCV RNA的含量。每次实验均设空白、阳性、阴性及峰值对照，每份标本取两孔均值计算结果。
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结果
一、慢丙肝患者肝组织和血清中HCV RNA的含量
见表1，结果显示血清HCV RNA含量在105至109.2拷贝/毫升之间，肝组织HCV RNA含量在108～1012拷贝/克。对19例未接受抗病毒治疗的慢丙肝患者进行分析，结果显示CAH肝组织及血清中HCV RNA的含量均显著高于CPH(P<0.01)。
表1 慢丙肝患者肝组织和血清HCV RNA含量结果 病例
ALT(U/L)
组织学诊断
HCV RNA含量
肝组织(拷贝/克)
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血清(拷贝/毫升)
1
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CPH
108
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2
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6
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108.9
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1012
109.1
23
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23*
23
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阴性
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24
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24*
34
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阴性
24**
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注：血清ALT测定的时间与肝活检一致；*：干扰素治疗停药后结果；**：随访半年后结果
二、肝组织和血清中HCV RNA含量的相互关系
肝组织HCV RNA含量明显高于血清中的含量，每克感染肝组织HCV RNA含量高于每毫升血清的102至104拷贝。相关分析显示，肝组织与血清中HCV RNA含量呈显著正相关(r=0.85,P<0.01)。1例(病例23)干扰素持续有效患者，在治疗结束时检测血清及肝组织中HCV RNA均阴性，随访一年ALT仍在正常范围。而另1例部分有效的患者(病例24)，治疗结束时ALT复常，血清HCV RNA阴转，而肝组织HCV RNA仍阳性(其含量较治疗前显著下降)，随访半年后ALT升高，血清HCV RNA阳转。
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三、丙肝患者血清HCV RNA含量与ALT水平的关系
对19例未接受干扰素治疗慢丙肝患者进行血清HCV RNA含量动态观察(至少4次以上)，同时检测血清ALT变化，对以上两指标进行相关分析，结果显示血清HCV RNA含量与ALT水平呈显著正相关(r=0.740,P<0.01)。
讨论
丙肝发病机制十分复杂，至今尚未完全阐明。HCV是嗜肝病毒，主要在肝内复制，肝内HCV RNA的含量可能与肝炎病情轻重有关[5]。我们研究发现，CAH患者血清和肝组织中HCV RNA水平明显高于CPH，结果提示进展性肝病感染细胞的数量可能增多，或者HCV基因复制活跃，且HCV对肝细胞有直接细胞毒作用，与国外报道相似[6]。本研究显示，慢丙肝患者肝组织中HCV RNA含量显著高于血清中的含量，每克感染肝组织HCV RNA水平高于102～104拷贝/毫升，相关分析显示血清与肝组织中HCV RNA含量呈显著正相关，这一结果表明循环中HCV病毒颗粒主要从肝组织中释放入血液中的，尽管肝外组织如某些淋巴细胞等也能进行HCV复制，但仅占极少一部分[7]。因此，检测肝组织HCV RNA含量更能准确反映HCV在人体内的复制程度。
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干扰素治疗能有效抑制HCV复制，降低血清转氨酶，促进肝细胞恢复[8]。我们研究发现，血清中HCV RNA阴性并不一定表明HCV从患者体内完全清除。部分有效患者在干扰素治疗期间，肝内HCV被抑制，复制程度降低或处于静止期，没有病毒颗粒释放入血液，使血清HCV RNA不能检出。停药后，HCV重新复制活跃，致使在随访期间，血清中HCV RNA再次出现，转氨酶反跳。而持续有效的患者则血清及肝组织中HCV RNA均阴性。所以在评价药物抗病毒疗效方面，检测肝组织HCV RNA含量有重要的参考价值。
本研究发现慢丙肝血清HCV RNA含量与ALT水平呈正相关，表明肝细胞损害程度与病毒血症水平有关，因此，定量检测血清和肝组织中HCV RNA含量对认识丙肝的发病机制及评价干扰素疗效有重要意义，血清中HCV RNA含量可作为监测肝内HCV RNA复制程度的一个指标。
本课题为广东省重点科技攻关项目(编号94062)获广州市医药卫生青年基金资助(编号95004)
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参考文献
1 Yamada G, Takahashi M, Tsuji T. Quantitative HCV RNA and effect of interferon therapy in chronic hepatitis C. Dig Dis Sci, 1992, 12:1926-1927.
2 Nakagawa H, Shimomura H, Hasui T, et al. Quantitative detection of hepatitis C virus genome in liver tissue and circulation by competitive reverse transcription polymerase chain reaction. Dig Dis Sci, 1994,39:225-233.
3 Chomczynski P, Sacchi N. Singl-step method of RNA isolation by acid guanidinium shiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem,1987,162:156-159.
, 百拇医药
4 张复春，吴婉芬，董惠卿，等.定量聚合酶链反应检测血清中HBV DNA及其临床应用.中华传染病杂志，1997，15：24-27.
5 Fong Tl, Shindo M, Feinstone SM, et al. Detection of replicative intermediates of hepatitis C. Viral RNA in liver and serum of patients with chronic hepatitis C. J Clin Invest, 1991,88:1058-1060.
6 Kumar U, Thomas HC, Monjardino J. Serum HCV RNA levels in chronic HCV hepatitis measured by quantitative PCR assay; correlation with serum AST. J Virol Methods, 1994, 47:95-102.
, 百拇医药
7 Shimizu YK, Iqamoto A, Hijikata M, et al. Evidence for in vitro replication of hepatitis C virus genome in a human T-cell line. Proc Natl Acad Sci USA, 1992,89:5477-5481.
8 Hagiwara H, Hayashi N, Mita E, et al. Detection of hepatitis C virus RNA in serum of patients with chronic hepatitis C treated with interferon. Hepatology, 1992,15:37-41.
(收稿：1997-08-04 修回：1998-06-26), 百拇医药
单位：510060 广州市第八人民医院传染病研究所
关键词：肝炎病毒，丙型；定量聚合酶链反应；活组织检查
中华传染病杂志990104 【摘要】 目的 了解丙型肝炎肝组织和血清中丙型肝炎病毒(HCV) RNA的含量及其相互关系。方法 采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测24例慢性丙型肝炎患者肝组织和血清HCV RNA含量。结果 肝组织中HCV RNA含量(108至1012拷贝/克)与血清病毒含量(105至109.2拷贝/毫升)呈显著正相关(P<0.01)。每克感染肝组织HCV RNA含量高于每毫升血清的102至104拷贝。慢性活动性肝炎肝组织和血清中HCV RNA含量显著高于慢性迁延性肝炎。动态结果显示，血清HCV RNA含量与ALT水平呈显著正相关。结论 提示慢性丙型肝炎病变程度与肝组织中HCV RNA含量有关，血清中HCV RNA含量可作为监测肝内HCV RNA复制程度的一个指标。
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Study on the relationship of HCV RNA between serum and liver tissue of hepatitis C
ZHANG Fuchun, CAI Xiaoli, HUANG Jishi, et al.
Institute of Infectious Diseases, The Eighth People's Hospital of Guangzhou, Guangzhou 510060
【Abstract】 Objective In order to study the amounts of the hepatitis C viral RNA in the serum associated with that in the liver tissue.Methods The concentrations of HCV RNA were detected in 24 patients with chronic hepatitis C by quantitative polymerase chain reaction which was based on a Amplisensor assay. Results The amounts of HCV RNA (105 to 109.2 copies/ml) in the serum correlated with that in the liver tissue (108 to 1012 copies/g) (P<0.01). One gram of the infected liver tissue contained 102 to 104 times as many copies of the viral RNA as that of 1ml serum. Liver tissue of chronic aggressive hepatitis contained significantly higher amounts of the viral RNA than those of chronic persistent hepatitis. There was a positive correlation between the titer of HCV RNA in the serum and ALT level. Conclusion These results suggested that a significant correlation between the quantity of HCV RNA in the liver and histological acti-vity of chronic hepatitis C, and the serum HCV RNA levels could be considered as a marker for monitoring intrahepatic viral RNA.
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【Key words】 Hepatitis C virus Quantitative PCR Biopsy
血清HCV RNA定量检测可直接反映丙型肝炎(丙肝)的病毒血症水平，对预测和评价干扰素治疗效果有重要作用[1]。国外研究报道HCV血症水平与肝组织中HCV复制活跃程度相关[2]，国内有关研究报道甚少。为了解丙肝肝组织中HCV RNA含量变化，我们采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测24例慢丙肝患者肝组织中HCV RNA含量，并与血清中HCV RNA含量的关系进行了探讨。
材料和方法
一、研究对象
24例慢性丙肝(慢丙肝)均为1992年10月至1996年12月我院住院患者，平均年龄40.3(18～60)岁，其中15例为男性，9例为女性。所有病例进行肝组织穿刺活检，病理诊断为慢性活动性肝炎(CAH)14例，慢性迁延性肝炎(CPH)10例。以上病例血清抗-HCV和HCV RNA阳性，ALT升高持续半年以上，除外甲、乙、丁及戊型肝炎病毒感染。有输血史者16例。5例患者接受干扰素治疗6个月，其中2例进行治疗前后两次肝活检。取部分肝组织冻存于-70°C备用，同时收集血清标本，置-20°C保存，统一检测。健康献血员血清为阴性对照。
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二、肝组织和血清HCV RNA提取
按异硫氰酸胍一步法[3]提取RNA。取冷冻肝组织20毫克，在裂解溶液中剪碎，研磨匀浆，然后提取RNA。所有血清和肝组织标本与阴性对照标本同时进行RNA提取。
三、HCV RNA定量检测
采用荧光定量PCR技术[4]。已知量的HCV RNA阳性标准为纯化的病毒RNA。引物序列：在HCV RNA的5′末端非编码区内选择内、外引物。将抽提RNA溶于DEPC溶液中，待溶解后即刻取上清液5微升进行逆转录反应合成cDNA，然后分别加入不对称扩增引物和信号扩增引物等，进行荧光PCR检测。同时将已知量的纯化HCV RNA同步进行PCR扩增，建立外参标准曲线。PCR结束后，应用计算机软件即可算出样品中HCV RNA的含量。每次实验均设空白、阳性、阴性及峰值对照，每份标本取两孔均值计算结果。
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结果
一、慢丙肝患者肝组织和血清中HCV RNA的含量
见表1，结果显示血清HCV RNA含量在105至109.2拷贝/毫升之间，肝组织HCV RNA含量在108～1012拷贝/克。对19例未接受抗病毒治疗的慢丙肝患者进行分析，结果显示CAH肝组织及血清中HCV RNA的含量均显著高于CPH(P<0.01)。
表1 慢丙肝患者肝组织和血清HCV RNA含量结果 病例
ALT(U/L)
组织学诊断
HCV RNA含量
肝组织(拷贝/克)
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血清(拷贝/毫升)
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注：血清ALT测定的时间与肝活检一致；*：干扰素治疗停药后结果；**：随访半年后结果
二、肝组织和血清中HCV RNA含量的相互关系
肝组织HCV RNA含量明显高于血清中的含量，每克感染肝组织HCV RNA含量高于每毫升血清的102至104拷贝。相关分析显示，肝组织与血清中HCV RNA含量呈显著正相关(r=0.85,P<0.01)。1例(病例23)干扰素持续有效患者，在治疗结束时检测血清及肝组织中HCV RNA均阴性，随访一年ALT仍在正常范围。而另1例部分有效的患者(病例24)，治疗结束时ALT复常，血清HCV RNA阴转，而肝组织HCV RNA仍阳性(其含量较治疗前显著下降)，随访半年后ALT升高，血清HCV RNA阳转。
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三、丙肝患者血清HCV RNA含量与ALT水平的关系
对19例未接受干扰素治疗慢丙肝患者进行血清HCV RNA含量动态观察(至少4次以上)，同时检测血清ALT变化，对以上两指标进行相关分析，结果显示血清HCV RNA含量与ALT水平呈显著正相关(r=0.740,P<0.01)。
讨论
丙肝发病机制十分复杂，至今尚未完全阐明。HCV是嗜肝病毒，主要在肝内复制，肝内HCV RNA的含量可能与肝炎病情轻重有关[5]。我们研究发现，CAH患者血清和肝组织中HCV RNA水平明显高于CPH，结果提示进展性肝病感染细胞的数量可能增多，或者HCV基因复制活跃，且HCV对肝细胞有直接细胞毒作用，与国外报道相似[6]。本研究显示，慢丙肝患者肝组织中HCV RNA含量显著高于血清中的含量，每克感染肝组织HCV RNA水平高于102～104拷贝/毫升，相关分析显示血清与肝组织中HCV RNA含量呈显著正相关，这一结果表明循环中HCV病毒颗粒主要从肝组织中释放入血液中的，尽管肝外组织如某些淋巴细胞等也能进行HCV复制，但仅占极少一部分[7]。因此，检测肝组织HCV RNA含量更能准确反映HCV在人体内的复制程度。
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干扰素治疗能有效抑制HCV复制，降低血清转氨酶，促进肝细胞恢复[8]。我们研究发现，血清中HCV RNA阴性并不一定表明HCV从患者体内完全清除。部分有效患者在干扰素治疗期间，肝内HCV被抑制，复制程度降低或处于静止期，没有病毒颗粒释放入血液，使血清HCV RNA不能检出。停药后，HCV重新复制活跃，致使在随访期间，血清中HCV RNA再次出现，转氨酶反跳。而持续有效的患者则血清及肝组织中HCV RNA均阴性。所以在评价药物抗病毒疗效方面，检测肝组织HCV RNA含量有重要的参考价值。
本研究发现慢丙肝血清HCV RNA含量与ALT水平呈正相关，表明肝细胞损害程度与病毒血症水平有关，因此，定量检测血清和肝组织中HCV RNA含量对认识丙肝的发病机制及评价干扰素疗效有重要意义，血清中HCV RNA含量可作为监测肝内HCV RNA复制程度的一个指标。
本课题为广东省重点科技攻关项目(编号94062)获广州市医药卫生青年基金资助(编号95004)
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参考文献
1 Yamada G, Takahashi M, Tsuji T. Quantitative HCV RNA and effect of interferon therapy in chronic hepatitis C. Dig Dis Sci, 1992, 12:1926-1927.
2 Nakagawa H, Shimomura H, Hasui T, et al. Quantitative detection of hepatitis C virus genome in liver tissue and circulation by competitive reverse transcription polymerase chain reaction. Dig Dis Sci, 1994,39:225-233.
3 Chomczynski P, Sacchi N. Singl-step method of RNA isolation by acid guanidinium shiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem,1987,162:156-159.
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4 张复春，吴婉芬，董惠卿，等.定量聚合酶链反应检测血清中HBV DNA及其临床应用.中华传染病杂志，1997，15：24-27.
5 Fong Tl, Shindo M, Feinstone SM, et al. Detection of replicative intermediates of hepatitis C. Viral RNA in liver and serum of patients with chronic hepatitis C. J Clin Invest, 1991,88:1058-1060.
6 Kumar U, Thomas HC, Monjardino J. Serum HCV RNA levels in chronic HCV hepatitis measured by quantitative PCR assay; correlation with serum AST. J Virol Methods, 1994, 47:95-102.
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7 Shimizu YK, Iqamoto A, Hijikata M, et al. Evidence for in vitro replication of hepatitis C virus genome in a human T-cell line. Proc Natl Acad Sci USA, 1992,89:5477-5481.
8 Hagiwara H, Hayashi N, Mita E, et al. Detection of hepatitis C virus RNA in serum of patients with chronic hepatitis C treated with interferon. Hepatology, 1992,15:37-41.
(收稿：1997-08-04 修回：1998-06-26), 百拇医药