快速进展性牙周炎患者龈沟液中的弹性蛋白酶活性
作者：刘荣坤 曹采方
单位：刘荣坤 曹采方(100081 北京医科大学口腔医学院)
关键词：牙周炎；中性白细胞；弹性蛋白酶
中华口腔医学杂志990114 【摘要】 目的 探讨中性多形核白细胞与快速进展性牙周炎的关系。方法 检测22例快速进展性牙周炎患者共102个位点(其中28个位点进行治疗前后的对比)的龈沟液弹性蛋白酶活性，将人多形核白细胞弹性蛋白酶特异底物——S2484与龈沟液反应,测吸光度值,以反映龈沟液弹性蛋白酶活性。结果 快速进展性牙周炎龈沟液中的弹性蛋白酶活性[(0.63±0.38)Abs/位点]明显高于健康对照组[(0.07±0.05)Abs/位点]，差异有显著性；弹性蛋白酶活性的高低与龈沟液体积、探诊深度、附着丧失和出血指数呈正相关关系；治疗后龈沟液体积和各临床指数显著降低，弹性蛋白酶活性也从治疗前的(0.73±0.36)Abs/位点下降为(0.11±0.17)Abs/位点，差异有显著性。结论 快速进展性牙周炎患者的中性多形核白细胞并不是趋化反应不足，而是过度浸润与释放溶酶体酶，起协同致炎作用。
, 百拇医药
The elastase activity in gingival crevicular fluid
from rapidly progressive periodontitis
LIU Rongkun, CAO Caifang.
School of Stomatology, Beijing Medical University, Beijing 100081
【Abstract】 Objective It is now generally accepted that polymorphonuclear neutrophil (PMN) chemotactic defect increases the patient's susceptibility to early-onset periodontitis. However, some reports including ours have failed to show defective PMN chemotaxis in rapidly progressive periodontitis( RPP) patients. The purpose of the study was to survey the role of PMN in the progression of RPP. Methods The elastase activity in gingival crevicular fluid from 22 RPP patients and 11 healthy controls were studied. For the control group and 12 RPP patients, 30 s GCF and clinical data were obtained at the first visit. For other 10 RPP patients, 30 s GCF and clinical data were collected prior to treatment and 4 weeks after scaling and root-planing. The elastase activity was measured with a low molecular weight substrate (L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-valine-p-nitroaniline, S2484) specific for granulocyte elastase. Results The pre-treatment elastase activity was much higher (0.63±0.38，Abs/site)in RPP patients than that in control subjects (0.07±0.05, Abs/site). The elastase activity was positively correlated with GCF volume,probing depth,attachment loss and gingival bleeding. Scaling and root-planing resulted in decrease of both clinical data and elastase activity. Conclusion These results suggested that PMN with the increased accumulation or the increased release of lysosomal enzymes may play a role in the pathogenesis of RPP.
, 百拇医药
【Key words】 Periodontitis Neutrophils Elastase
中性多形核白细胞(polymorphonuclear neutrophil, PMN)以防御细胞和炎症细胞的双重身份参与牙周炎的发生和发展。有研究表明，PMN的趋化功能缺陷可能是部分快速进展性牙周炎(rapidly progressive periodontitis, RPP)较为重要的易感因素[1]。我们及其他一些学者的研究，均未能发现RPP存在PMN的趋化功能异常[2，3]。体外实验研究表明，部分早发性牙周炎患者的外周血PMN可过度释放溶酶体酶或超氧离子[4]。但PMN是否在RPP患者的炎症部位过度浸润或释放溶酶体酶，尚不清楚。我们通过检测RPP患者龈沟液中的PMN特异酶——弹性蛋白酶的活性，以期揭示PMN与RPP的关系。
, 百拇医药 材料与方法
1. 病例选择：参考Page 1983年提出的诊断标准选择22例RPP患者，男9例，女13例，年龄21～36岁，平均27.7岁。其中10例行基础治疗前后的对比，另12例检测过外周血PMN的趋化功能。所有患者均为初诊病例，就诊前无牙周治疗史及正畸史，口内无修复体，无明显咬创伤及错畸形，无其他明显的局部刺激因素, 并且口内存留牙不少于24颗,有附着丧失的累及牙≥20颗,至少有1个位点的牙周袋≥6mm的牙数不少于16颗。健康对照组11名，女5名，男6名，年龄19～35岁，平均29.3岁，牙周组织健康。所有受检者均为汉族，无系统性疾病，近1个月内未服用过抗生素及对白细胞有明显毒性的药物或免疫抑制剂，无吸烟史，女性未妊娠且为非月经期。
2.龈沟液取样位点的选择：RPP受检位点102个。选择标准：附着丧失(attachment loss, AL)≥2mm，探诊深度(probing depth, PD)≥4mm，出血指数(bleeding index, BI)≥2；对其中28个位点进行治疗前后对比。健康对照组32个位点。所有取样位点的临床指标见表1。
, http://www.100md.com
表1 取样位点的临床指标 组别
位点数
探诊深度(mm)
附着丧失(mm)
出血指数
快速进展
性牙周炎
102
5.3±1.5
5.2±1.9
3.2±0.8
健康对照
, 百拇医药
32
<3
0
<2
3.龈沟液的取样及定量：用探针去除龈上菌斑，清水漱口，棉球隔湿后轻轻吹干牙面，将已称重的Whatman 3# 滤纸条(2 mm×10 mm)插入牙周袋内(袋内法)，30 s后取出，称重，-70℃冷存备用。受试者的基础治疗(超声洁治和根面平整)均由1名有经验的洁治员完成。基础治疗后4周，按同法在相同位点取龈沟液并检查和记录所选位点的临床指数：PD、AL和BI。根据取样前、后滤纸条重量之差换算出龈沟液的体积。
4.弹性蛋白酶活性的检测——底物法：复温后的滤纸条，每管加含0.1%Tween 20 的PBS液(PBS-T,PH 7.4)170 μl,采用离心法获取龈沟洗提液。于96孔酶标板中每孔加28 μl底物工作液(L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-valine-p-nitroaniline ，S2484, 2 mmol/L，Sigma 公司)，再于每孔加42 μl龈沟液样本，于37℃下恒温孵育2 小时后，用BR450酶标仪，在405 nm波长下读A值，此A值即代表2小时内每样本龈沟液中弹性蛋白酶的总活性，记作Abs(absorbance)/位点。
, 百拇医药
5.统计分析：治疗前RPP组弹性蛋白酶活性与健康组的比较采用t检验，与龈沟液体积和临床指数的相关性采用Spearman相关检验，治疗前后弹性蛋白酶活性及临床指数的比较采用配对t检验。
结果
1. RPP组和健康对照组取样位点的临床情况见表1。
2. RPP组的弹性蛋白酶活性(0.63±0.38,Abs/位点)显著高于健康对照组(0.07±0.05，Abs/位点)，P<0.01；弹性蛋白酶活性与龈沟液体积和各临床指数(AL、PD和BI)均呈正相关关系，其中弹性蛋白酶活性与BI间的P值<0.05，与其他各临床指数间的P值均<0.01。
3.治疗后临床指数和弹性蛋白酶活性均显著降低，见表2。
表2 治疗前后弹性蛋白酶活性及
, 百拇医药
各临床指数的变化(
±s，n=28) 项目
治疗前
治疗后
弹性蛋白酶活性
0.73±0.36
0.11±0.17
龈沟液体积(μl)
0.90±0.38
0.32±0.23
探诊深度(mm)
5.6±1.5
, 百拇医药
3.5±1.0
附着丧失(mm)
5.7±1.6
4.4±1.2
出血指数
3.1±0.6
1.9±0.9
注：治疗前后各项指标相比P值均<0.01
讨论
PMN在其吞噬与杀菌过程中，可释放多种溶酶体酶，包括胶原酶、组织蛋白酶G、碱性磷酸酶、弹性蛋白酶、β-葡萄糖醛酸酶和髓过氧化物酶等。在慢性成人牙周炎的龈沟液中，这些酶的活性显著升高，且与炎症的程度有关，故常被作为牙周炎的活动性指标[5]。由于弹性蛋白酶和髓过氧化物酶只来源于人的PMN，因此其活性的高低或量的多少与PMN有关。Gustafsson等[6]及曹剑宁等[7]的研究结果均显示，龈沟液中的弹性蛋白酶、髓过氧化物酶活性与龈沟液PMN计数呈显著正相关。因此，龈沟液中的弹性蛋白酶活性可作为PMN在局部浸润的间接指征。
, 百拇医药
曾有多种底物用于检测龈沟液中的弹性蛋白酶，但有些底物因缺乏特异性，除被弹性蛋白酶水解外，还被其他蛋白酶水解，或因弹性蛋白酶水解的敏感性太低而被淘汰。本实验采用的底物是一种特异性底物，有研究显示这种底物只能被来自人PMN的弹性蛋白酶所水解，且有较高的敏感性[8，9]。用这种底物法所检测到的弹性蛋白酶是PMN释放出来的有活性的部分，由于弹性蛋白酶不仅降解弹性蛋白，还能降解胶原和糖蛋白[10]，因此龈沟液中有活性的弹性蛋白酶还是一种炎症介质。PMN正是通过过多地释放有活性的弹性蛋白酶和其他一些溶酶体酶至周围组织而发挥其致炎作用。
因此，炎症部位弹性蛋白酶活性的高低不仅反映PMN在局部的浸润情况，还可提示PMN潜在的致炎作用。本实验结果显示，RPP炎症位点的弹性蛋白酶活性显著高于健康对照组，表明炎症部位有大量PMN的存在，而且释放了较高活性的弹性蛋白酶。从炎症位点弹性蛋白酶活性与龈沟液体积和临床指数呈显著正相关、治疗后其活性显著降低等结果来看，PMN与炎症是协同关系。
, 百拇医药
本组22例RPP患者中，12例经过外周血PMN的趋化功能检测，结果并无异常，但这些患者的龈沟液中却检出了较高活性的弹性蛋白酶，而且与炎症是协同关系。结合Shapira等[4]的研究结果可以推论，RPP患者PMN的过度浸润或过度释放弹性蛋白酶等溶酶体酶可能构成了RPP的另一种病理机制。
高等院校博士学科点专项科研基金资助课题(9501020)
参考文献
[1] Page RC, Sims TJ, Geissler F, et al. Defective neutrophil and monocyte motility in patients with early onset periodontitis. Infect Immun, 1985, 47: 169-175.
, http://www.100md.com [2] Katsuragi Y, Matsuda N, Nakamura M, et al. Neutrophil functions in patients with severe periodontal disease. Adv Dent Res, 1988, 2: 359-363.
[3] Mouynet P, Delamaire M ，le Goff MC, et al. Ex vivo studies of polymorphonuclear neutrophils from patients with early-onset forms of periodontitis.(Ⅰ).Chemotactic assessment using the under agarose method. J Clin Periodontol, 1994, 21: 177-183.
[4] Shapira L, Gordon B, Warbington M, et al. Priming effect of Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide on superoxide production by neutrophils from healthy and rapidly progressive periodontitis subjects. J Periodontol, 1994, 65: 129-133.
, http://www.100md.com
[5] Page RC. Host response tests for diagnosing periodontal diseases. J Periodontol, 1992, 63(4 Suppl): 356-366.
[6] Gustafsson A, Asman B，Bergstrom K, et al. Granulocyte elastase in gingival crevicular fluid. A possible discriminator between gingivitis and periodontitis. J Clin Periodontol, 1992, 19: 535-540 .
[7] 曹剑宁,曹采方,张雪玲,等. 龈沟白细胞数及龈沟液髓过氧化物酶水平与临床指标的相关性. 北京医科大学学报, 1989,21:45-47.
[8] Kramps JA. van Twisk C, van der Linden AC. L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-valine-p-nitroanilide,a highly specific substrate for granulocyte elastase. Scand J Clin Lab Invest, 1983, 43: 427-432.
, 百拇医药
[9] Tanaka H, Shimazu T, Sugimoto H, et al. A sensitive and specific assay for granulocyte elastase in inflammatory tissue fluid using L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-valine-p-nitroanilide. Clin Chim Acta, 1990, 187: 173-180.
[10] Janoff A. Elastase in tissue injury. Annu Rev Med, 1985, 36: 207-216.
(收稿：1998-05-08 修回：1998-07-10), 百拇医药
单位：刘荣坤 曹采方(100081 北京医科大学口腔医学院)
关键词：牙周炎；中性白细胞；弹性蛋白酶
中华口腔医学杂志990114 【摘要】 目的 探讨中性多形核白细胞与快速进展性牙周炎的关系。方法 检测22例快速进展性牙周炎患者共102个位点(其中28个位点进行治疗前后的对比)的龈沟液弹性蛋白酶活性，将人多形核白细胞弹性蛋白酶特异底物——S2484与龈沟液反应,测吸光度值,以反映龈沟液弹性蛋白酶活性。结果 快速进展性牙周炎龈沟液中的弹性蛋白酶活性[(0.63±0.38)Abs/位点]明显高于健康对照组[(0.07±0.05)Abs/位点]，差异有显著性；弹性蛋白酶活性的高低与龈沟液体积、探诊深度、附着丧失和出血指数呈正相关关系；治疗后龈沟液体积和各临床指数显著降低，弹性蛋白酶活性也从治疗前的(0.73±0.36)Abs/位点下降为(0.11±0.17)Abs/位点，差异有显著性。结论 快速进展性牙周炎患者的中性多形核白细胞并不是趋化反应不足，而是过度浸润与释放溶酶体酶，起协同致炎作用。
, 百拇医药
The elastase activity in gingival crevicular fluid
from rapidly progressive periodontitis
LIU Rongkun, CAO Caifang.
School of Stomatology, Beijing Medical University, Beijing 100081
【Abstract】 Objective It is now generally accepted that polymorphonuclear neutrophil (PMN) chemotactic defect increases the patient's susceptibility to early-onset periodontitis. However, some reports including ours have failed to show defective PMN chemotaxis in rapidly progressive periodontitis( RPP) patients. The purpose of the study was to survey the role of PMN in the progression of RPP. Methods The elastase activity in gingival crevicular fluid from 22 RPP patients and 11 healthy controls were studied. For the control group and 12 RPP patients, 30 s GCF and clinical data were obtained at the first visit. For other 10 RPP patients, 30 s GCF and clinical data were collected prior to treatment and 4 weeks after scaling and root-planing. The elastase activity was measured with a low molecular weight substrate (L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-valine-p-nitroaniline, S2484) specific for granulocyte elastase. Results The pre-treatment elastase activity was much higher (0.63±0.38，Abs/site)in RPP patients than that in control subjects (0.07±0.05, Abs/site). The elastase activity was positively correlated with GCF volume,probing depth,attachment loss and gingival bleeding. Scaling and root-planing resulted in decrease of both clinical data and elastase activity. Conclusion These results suggested that PMN with the increased accumulation or the increased release of lysosomal enzymes may play a role in the pathogenesis of RPP.
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【Key words】 Periodontitis Neutrophils Elastase
中性多形核白细胞(polymorphonuclear neutrophil, PMN)以防御细胞和炎症细胞的双重身份参与牙周炎的发生和发展。有研究表明，PMN的趋化功能缺陷可能是部分快速进展性牙周炎(rapidly progressive periodontitis, RPP)较为重要的易感因素[1]。我们及其他一些学者的研究，均未能发现RPP存在PMN的趋化功能异常[2，3]。体外实验研究表明，部分早发性牙周炎患者的外周血PMN可过度释放溶酶体酶或超氧离子[4]。但PMN是否在RPP患者的炎症部位过度浸润或释放溶酶体酶，尚不清楚。我们通过检测RPP患者龈沟液中的PMN特异酶——弹性蛋白酶的活性，以期揭示PMN与RPP的关系。
, 百拇医药 材料与方法
1. 病例选择：参考Page 1983年提出的诊断标准选择22例RPP患者，男9例，女13例，年龄21～36岁，平均27.7岁。其中10例行基础治疗前后的对比，另12例检测过外周血PMN的趋化功能。所有患者均为初诊病例，就诊前无牙周治疗史及正畸史，口内无修复体，无明显咬创伤及错畸形，无其他明显的局部刺激因素, 并且口内存留牙不少于24颗,有附着丧失的累及牙≥20颗,至少有1个位点的牙周袋≥6mm的牙数不少于16颗。健康对照组11名，女5名，男6名，年龄19～35岁，平均29.3岁，牙周组织健康。所有受检者均为汉族，无系统性疾病，近1个月内未服用过抗生素及对白细胞有明显毒性的药物或免疫抑制剂，无吸烟史，女性未妊娠且为非月经期。
2.龈沟液取样位点的选择：RPP受检位点102个。选择标准：附着丧失(attachment loss, AL)≥2mm，探诊深度(probing depth, PD)≥4mm，出血指数(bleeding index, BI)≥2；对其中28个位点进行治疗前后对比。健康对照组32个位点。所有取样位点的临床指标见表1。
, http://www.100md.com
表1 取样位点的临床指标 组别
位点数
探诊深度(mm)
附着丧失(mm)
出血指数
快速进展
性牙周炎
102
5.3±1.5
5.2±1.9
3.2±0.8
健康对照
, 百拇医药
32
<3
0
<2
3.龈沟液的取样及定量：用探针去除龈上菌斑，清水漱口，棉球隔湿后轻轻吹干牙面，将已称重的Whatman 3# 滤纸条(2 mm×10 mm)插入牙周袋内(袋内法)，30 s后取出，称重，-70℃冷存备用。受试者的基础治疗(超声洁治和根面平整)均由1名有经验的洁治员完成。基础治疗后4周，按同法在相同位点取龈沟液并检查和记录所选位点的临床指数：PD、AL和BI。根据取样前、后滤纸条重量之差换算出龈沟液的体积。
4.弹性蛋白酶活性的检测——底物法：复温后的滤纸条，每管加含0.1%Tween 20 的PBS液(PBS-T,PH 7.4)170 μl,采用离心法获取龈沟洗提液。于96孔酶标板中每孔加28 μl底物工作液(L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-valine-p-nitroaniline ，S2484, 2 mmol/L，Sigma 公司)，再于每孔加42 μl龈沟液样本，于37℃下恒温孵育2 小时后，用BR450酶标仪，在405 nm波长下读A值，此A值即代表2小时内每样本龈沟液中弹性蛋白酶的总活性，记作Abs(absorbance)/位点。
, 百拇医药
5.统计分析：治疗前RPP组弹性蛋白酶活性与健康组的比较采用t检验，与龈沟液体积和临床指数的相关性采用Spearman相关检验，治疗前后弹性蛋白酶活性及临床指数的比较采用配对t检验。
结果
1. RPP组和健康对照组取样位点的临床情况见表1。
2. RPP组的弹性蛋白酶活性(0.63±0.38,Abs/位点)显著高于健康对照组(0.07±0.05，Abs/位点)，P<0.01；弹性蛋白酶活性与龈沟液体积和各临床指数(AL、PD和BI)均呈正相关关系，其中弹性蛋白酶活性与BI间的P值<0.05，与其他各临床指数间的P值均<0.01。
3.治疗后临床指数和弹性蛋白酶活性均显著降低，见表2。
表2 治疗前后弹性蛋白酶活性及
, 百拇医药
各临床指数的变化(
±s，n=28) 项目治疗前
治疗后
弹性蛋白酶活性
0.73±0.36
0.11±0.17
龈沟液体积(μl)
0.90±0.38
0.32±0.23
探诊深度(mm)
5.6±1.5
, 百拇医药
3.5±1.0
附着丧失(mm)
5.7±1.6
4.4±1.2
出血指数
3.1±0.6
1.9±0.9
注：治疗前后各项指标相比P值均<0.01
讨论
PMN在其吞噬与杀菌过程中，可释放多种溶酶体酶，包括胶原酶、组织蛋白酶G、碱性磷酸酶、弹性蛋白酶、β-葡萄糖醛酸酶和髓过氧化物酶等。在慢性成人牙周炎的龈沟液中，这些酶的活性显著升高，且与炎症的程度有关，故常被作为牙周炎的活动性指标[5]。由于弹性蛋白酶和髓过氧化物酶只来源于人的PMN，因此其活性的高低或量的多少与PMN有关。Gustafsson等[6]及曹剑宁等[7]的研究结果均显示，龈沟液中的弹性蛋白酶、髓过氧化物酶活性与龈沟液PMN计数呈显著正相关。因此，龈沟液中的弹性蛋白酶活性可作为PMN在局部浸润的间接指征。
, 百拇医药
曾有多种底物用于检测龈沟液中的弹性蛋白酶，但有些底物因缺乏特异性，除被弹性蛋白酶水解外，还被其他蛋白酶水解，或因弹性蛋白酶水解的敏感性太低而被淘汰。本实验采用的底物是一种特异性底物，有研究显示这种底物只能被来自人PMN的弹性蛋白酶所水解，且有较高的敏感性[8，9]。用这种底物法所检测到的弹性蛋白酶是PMN释放出来的有活性的部分，由于弹性蛋白酶不仅降解弹性蛋白，还能降解胶原和糖蛋白[10]，因此龈沟液中有活性的弹性蛋白酶还是一种炎症介质。PMN正是通过过多地释放有活性的弹性蛋白酶和其他一些溶酶体酶至周围组织而发挥其致炎作用。
因此，炎症部位弹性蛋白酶活性的高低不仅反映PMN在局部的浸润情况，还可提示PMN潜在的致炎作用。本实验结果显示，RPP炎症位点的弹性蛋白酶活性显著高于健康对照组，表明炎症部位有大量PMN的存在，而且释放了较高活性的弹性蛋白酶。从炎症位点弹性蛋白酶活性与龈沟液体积和临床指数呈显著正相关、治疗后其活性显著降低等结果来看，PMN与炎症是协同关系。
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本组22例RPP患者中，12例经过外周血PMN的趋化功能检测，结果并无异常，但这些患者的龈沟液中却检出了较高活性的弹性蛋白酶，而且与炎症是协同关系。结合Shapira等[4]的研究结果可以推论，RPP患者PMN的过度浸润或过度释放弹性蛋白酶等溶酶体酶可能构成了RPP的另一种病理机制。
高等院校博士学科点专项科研基金资助课题(9501020)
参考文献
[1] Page RC, Sims TJ, Geissler F, et al. Defective neutrophil and monocyte motility in patients with early onset periodontitis. Infect Immun, 1985, 47: 169-175.
, http://www.100md.com [2] Katsuragi Y, Matsuda N, Nakamura M, et al. Neutrophil functions in patients with severe periodontal disease. Adv Dent Res, 1988, 2: 359-363.
[3] Mouynet P, Delamaire M ，le Goff MC, et al. Ex vivo studies of polymorphonuclear neutrophils from patients with early-onset forms of periodontitis.(Ⅰ).Chemotactic assessment using the under agarose method. J Clin Periodontol, 1994, 21: 177-183.
[4] Shapira L, Gordon B, Warbington M, et al. Priming effect of Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide on superoxide production by neutrophils from healthy and rapidly progressive periodontitis subjects. J Periodontol, 1994, 65: 129-133.
, http://www.100md.com
[5] Page RC. Host response tests for diagnosing periodontal diseases. J Periodontol, 1992, 63(4 Suppl): 356-366.
[6] Gustafsson A, Asman B，Bergstrom K, et al. Granulocyte elastase in gingival crevicular fluid. A possible discriminator between gingivitis and periodontitis. J Clin Periodontol, 1992, 19: 535-540 .
[7] 曹剑宁,曹采方,张雪玲,等. 龈沟白细胞数及龈沟液髓过氧化物酶水平与临床指标的相关性. 北京医科大学学报, 1989,21:45-47.
[8] Kramps JA. van Twisk C, van der Linden AC. L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-valine-p-nitroanilide,a highly specific substrate for granulocyte elastase. Scand J Clin Lab Invest, 1983, 43: 427-432.
, 百拇医药
[9] Tanaka H, Shimazu T, Sugimoto H, et al. A sensitive and specific assay for granulocyte elastase in inflammatory tissue fluid using L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-valine-p-nitroanilide. Clin Chim Acta, 1990, 187: 173-180.
[10] Janoff A. Elastase in tissue injury. Annu Rev Med, 1985, 36: 207-216.
(收稿：1998-05-08 修回：1998-07-10), 百拇医药