大蒜、 枸椽酸和双氧水对口腔厌氧菌的超微结构影响*
作者：李德懿 陆卫青
单位：李德懿 陆卫青 210011上海，上海第二医科大学附属第九人民医院
关键词：大蒜；枸椽酸；双氧水；口腔厌氧菌；超微结构
大 蒜 提 要 目的 探讨大蒜、枸椽酸和双氧水对口腔厌氧菌的杀菌机制。方法 采用透射电镜，观察药物对核梭杆菌、牙龈卟啉菌和脆弱类杆菌的直接影响。结果 观察到3种药物对各种细菌作用的超微结构改变不尽相同，药物在37℃作用15分钟后，可破坏细菌的胞壁结构，可见壁破裂、变薄或消失，胞浆变性，核糖体聚集成块状沉淀，或胞浆内容物溶解呈空泡变性等。结论 观察药物对细菌的超微结构影响，可为研究口腔厌氧菌的生理、病理关系以及药物的解毒杀菌机制等提供实验依据。
The effects of garlic, hydrogen peroxide and citric acid on the ultrastructure of oral anaerobes Li Deyi, etal. The Ninth Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai(200011)
, http://www.100md.com
Abstract Aim In order to investigate the bactericidal mechanism of garlic (G), hydrogen peroxide (H) and citric acid (C). Methods Their effects on the ultrastructure of porphyromonas gingivalis (Pg), Bacteroides fragilis (Bf) and Fusobacterium nucleatum (Fu) were observed by scanning electron microscopy. Resuts After oral anaerobes were exposed to G, H and C at 37℃ for 15 minutes, the ultrastructure changes of anaerobes differed in degree. Their cell wall, membrane were ruptured, thinned or disappeared, and the cell plasma was degenerated, such as ribosome aggregation, enzyme precipitation or plasma solution etc. Conclusions This study observed the effects of G, H and C on the ultrastructure of oral anareobes and supplied bactericidal mechanisms of drug.
, http://www.100md.com
Key words garlic hydrogen peroxide citric acid oral anaerobe ultrastrcture
大量研究表明牙周病是一种感染性疾病，革兰阴性厌氧菌是其重要病原菌，一些抗菌药物或防腐消毒剂如枸椽酸、双氧水和大蒜等处理牙周袋或病变根面，在牙周病领域受到高度评价和广泛应用〔1～3〕。但它们的杀菌机制,特别是对口腔厌氧菌超微结构的直接影响却报道极少。本研究采用透射电镜观察它们对核梭杆菌、牙龈卟啉菌和脆弱类杆菌的超微结构影响，旨在探讨药物解毒杀菌机制。
材料与方法
1. 实验菌株和培养条件
选择与牙周病关系密切的3种口腔厌氧菌，为标准化起见，均采用国际参考菌株作为试验菌株，包括：
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核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum, 简称Fn) ATCC 10953；
牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis, 简称Pg) ATCC 33277；
脆弱类杆菌(Bacteriodes fragilis, 简称Bf) ATCC 25285。
各菌株活化鉴定后，分别接种于CDC厌氧血琼脂平皿上，其主要成分为胰蛋白胨、大豆胨、氯化钠、酵母浸出粉、L—半胱氨酸、氯化血红素、维生素K1和琼脂，放入厌氧手套箱中，36℃厌氧培养72小时，用棉签将细菌移入生理盐水，洗涤2次(3000rpm, 离心10分钟)， 弃去上清液，细菌沉淀备用。
2. 实验药物
大蒜：取去皮新鲜大蒜(山东省龙口市复发中记工业园)1000g，用双蒸水选2遍，粉碎机榨汁,4层消毒纱布过滤，再用滤纸过滤，得淡黄色澄清的大蒜汁(pH5.5),放入4℃冰箱备用。
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50%枸橼酸：天平称取药用枸橼酸50g，加入100ml双蒸水(pH1.0)
3%双氧水：上海桃浦化工厂(沪卫药准字95第0490号—098)
3. 药物处理
洗涤干净的3种纯菌，当即用生理盐水制备成109/ml的细菌悬液，每种菌分装4根试管，每管菌液10ml，3000rpm离心10分钟，弃去上清液，在细菌沉淀中分别加入50%枸橼酸、3%双氧水和大蒜汁10ml，对照管加生理盐水10ml，37℃下混匀，处理15分钟。
4. 电镜标本制备
上述药物处理组和对照组菌液，3000rpm,离心10分钟，弃去上清液，将细菌立即放入2%戊二醛前固定，二甲胂酸钠缓冲液漂洗，1%锇酸后固定，酒精系列脱水后常规包埋，作超薄切片，在HITACHI H—500透射电镜下观察并摄片。
, 百拇医药
结 果
1. 实验菌株特性和扫描电镜下形态
3种国际参考菌株进行复苏、纯培养后，经菌落形态、菌体染色及生化反应鉴定，结果均符合VPI厌氧菌手册鉴定特性〔4〕，对照组3种细菌的超薄切片，在透射电镜下可观察到细胞壁(CW)和细胞膜(CM)：因为这3种菌均为G-菌，细胞壁结构较为复杂，可见2～4个致密层及中间透明区结构，Pg菌表面还可见到毛状外膜；细胞浆和核区(P，Nr)：大部分细菌在均质结构中可见散在的核糖体颗粒，有的细菌在中心部分可见核区，无核膜核仁(图1～3)。
2. 药物处理后细菌的超微结构变化
黑色的Pg经50%枸橼酸处理后变为淡褐色，经3%双氧水处理，黑色的Pg很快变为白色，并可见大量气泡，而经大蒜汁处理Pg仍为黑色，Fn和Bf在3种药物处理前后颜色未见明显变化。在透射电镜下的超微结构改变(表1)(图3～12)。
, 百拇医药
表1 药物处理组的细菌超微结构变化
组别细菌
Fn
Pg
Bf
大蒜组
胞壁失去原有结构而明显变薄，大部分胞浆溶解消化，少数变性，可见黑色沉淀(图4)
许多细菌破碎崩解，有的胞浆变性，有的出现空泡(图5)
胞壁消失或变薄，胞浆高度变性，核糖体聚集成深黑色团块沉淀，少数细胞内容物破坏出现空泡(图6)
50%枸橼酸组
, 百拇医药
细胞变形，胞壁变薄失去原有结构，有的胞浆内可见黑色沉淀，有的消化呈空泡(图7)
可见细胞集聚融合成片和空泡变性，有些胞浆内可见黑色沉淀颗粒(图8)
大部分胞壁不完整，破裂呈不连续状态，胞浆内可见大量颗粒样黑色沉淀(图9)
3%双氧水组
胞壁与胞浆间隙明显扩大，胞浆内容物溶解漏出呈空泡，少量变性(图10)
细胞可融合聚集成片，胞壁与胞浆间隙明显扩大，胞浆萎缩，出现较多空泡(图11)
可见细胞破裂，部分胞浆内容物溶解呈空泡(图12)
讨 论
, http://www.100md.com 1. 药物对口腔G-厌氧菌的超微结构影响
G-厌氧菌的胞壁结构较为复杂，它在较薄的粘肽层外面还有脂蛋白、外膜和脂多糖内毒素。它是细菌对外界的物理性、功能性保护屏障，一切生物活性物质的功能如物质运转、能量转换和信息传递，均在生物膜上进行。从药物作用细菌后的超微结构变化来看，大蒜、枸橼酸、双氧水可不同程度地破坏Fn、Pg和Bf这3种口腔厌氧菌表面结构，表现为细胞壁和细胞膜破裂、变薄，有的甚至消失，这与我们以前证实这3种药物有降解内毒素作用相一致〔1〕。此外，还可观察到这些药物可影响到菌体内的胞浆，在胞浆内出现高电子密度呈深黑色团块或颗粒样沉淀，或使胞浆溶解出现空泡。这些内部结构变化，可导至细菌的死亡。
2. 药物作用的可能机制
大蒜系百合科葱属植物，是我国民间常用中药之一，味辛、性温，有杀虫、消肿、抗菌及消炎等作用，因此大蒜被誉为“天然广谱抗生素”。它的抗菌机制可能是由于：①大蒜含有的大蒜辣素分子中的氧原子，可与细菌生长繁殖所必需的半胱氨酸分子中的-SH结构；③大蒜汁pH为5.5，偏酸性；③大蒜中所含的蒜酶、过氧化酶、磷酸酯酶及水解酶等，有氧化和水解作用〔5〕。因此大蒜作用下的3种细菌变形及破裂较明显，可见胞壁消失或变薄，核糖体聚集成团块(图4～6)，对Bf作用较强。
, 百拇医药
50%枸橼酸，其pH为1.0， 呈强酸性，可与细菌表面的P0-33，OH-1等基团作用，破坏组织结构，使胞壁不完整或破裂，增强通透性、干扰分解代谢，可溶解胞浆或使菌体蛋白和酶变性或沉淀〔6〕(图7～9)，以Pg和Bf较为典型。
3%双氧水为一种常用的强氧化剂，是一种非特异性的抗菌物质，具防腐、灭菌、除臭及清洁等作用，它与Pg接触，能很快氧化其黑色素，使菌体变成白色。双氧水可与细菌的—SH、—NH2作用，破坏组织结构，增强通透性，加之其分子量小，易透入菌体使蛋白质或酶变性，或使胞浆内容物氧化溶解，出现较多空泡(图10～12)，对Fn、Pg作用较Bf明显。
透射电镜观察证实不同药物对各种细菌的超微结构影响不尽相同，提示它们的抗菌机制也不相同。
, 百拇医药
图1 核梭杆菌(TEM×20000)
图2 牙龈卟啉菌(TEM×20000)
图3 脆弱类杆菌(TEM×20000)
图4 大蒜处理的核梭杆菌(TEM×20000)
图5 大蒜处理的牙龈卟啉菌(TEM×20000)
图6 大蒜处理的脆弱类杆菌(TEM×20000)
图7 枸橼酸处理的核梭杆菌(TEM×20000)
图8 枸橼酸处理的牙龈卟啉菌(TEM×20000)
图9 枸橼酸处理的脆弱类杆菌菌(TEM×20000)
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图10 双氧水处理的核梭杆菌(TEM×20000)
图11 双氧水处理的脆弱类杆菌(TEM×20000)
图12 双氧水处理的脆弱类杆菌(TEM×20000)
*国家自然科学基金资助课题，(39570763)
参 考 文 献
[1] 李德懿、黄宗仁.病变牙骨质内毒素的研究.中华口腔医学杂志，1985，20(4)：193～196
[2] Chaves E, Cox CF, Morrison E, et al. The effect of citric acid application on periodontally involved root surfaces. II. An in vitro scanning eectron microscopic study. Int J Periodontics Restorative Dent. 1993;13(2): 188～196
, 百拇医药
[3] Kersten BG, Chamberlain AD, Khorsandis, et al. Healing of the intrabony periodontal lesion following rootconditioning with citric acid and wound closure insluding an expanded PTFE membrane. J Periodontol 1992, 63(11): 876～882
[4] Holdeman LV: Anaerobe Laboratory Manual, ed4. Virginia Polytechnic Institute and state University. Blackshurg Vorginia Southern Printing Co, 1977.
[5] 阴健、郭力弓主编.中药现代研究与临床应用，第1版，北京、学苑出版社，1994；86～90
[6] 李德懿.“牙周病微生物学”，第1版 天津科技翻译出版公司，1994：167
(收稿：1998—08—02), http://www.100md.com
单位：李德懿 陆卫青 210011上海，上海第二医科大学附属第九人民医院
关键词：大蒜；枸椽酸；双氧水；口腔厌氧菌；超微结构
大 蒜 提 要 目的 探讨大蒜、枸椽酸和双氧水对口腔厌氧菌的杀菌机制。方法 采用透射电镜，观察药物对核梭杆菌、牙龈卟啉菌和脆弱类杆菌的直接影响。结果 观察到3种药物对各种细菌作用的超微结构改变不尽相同，药物在37℃作用15分钟后，可破坏细菌的胞壁结构，可见壁破裂、变薄或消失，胞浆变性，核糖体聚集成块状沉淀，或胞浆内容物溶解呈空泡变性等。结论 观察药物对细菌的超微结构影响，可为研究口腔厌氧菌的生理、病理关系以及药物的解毒杀菌机制等提供实验依据。
The effects of garlic, hydrogen peroxide and citric acid on the ultrastructure of oral anaerobes Li Deyi, etal. The Ninth Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai(200011)
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Abstract Aim In order to investigate the bactericidal mechanism of garlic (G), hydrogen peroxide (H) and citric acid (C). Methods Their effects on the ultrastructure of porphyromonas gingivalis (Pg), Bacteroides fragilis (Bf) and Fusobacterium nucleatum (Fu) were observed by scanning electron microscopy. Resuts After oral anaerobes were exposed to G, H and C at 37℃ for 15 minutes, the ultrastructure changes of anaerobes differed in degree. Their cell wall, membrane were ruptured, thinned or disappeared, and the cell plasma was degenerated, such as ribosome aggregation, enzyme precipitation or plasma solution etc. Conclusions This study observed the effects of G, H and C on the ultrastructure of oral anareobes and supplied bactericidal mechanisms of drug.
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Key words garlic hydrogen peroxide citric acid oral anaerobe ultrastrcture
大量研究表明牙周病是一种感染性疾病，革兰阴性厌氧菌是其重要病原菌，一些抗菌药物或防腐消毒剂如枸椽酸、双氧水和大蒜等处理牙周袋或病变根面，在牙周病领域受到高度评价和广泛应用〔1～3〕。但它们的杀菌机制,特别是对口腔厌氧菌超微结构的直接影响却报道极少。本研究采用透射电镜观察它们对核梭杆菌、牙龈卟啉菌和脆弱类杆菌的超微结构影响，旨在探讨药物解毒杀菌机制。
材料与方法
1. 实验菌株和培养条件
选择与牙周病关系密切的3种口腔厌氧菌，为标准化起见，均采用国际参考菌株作为试验菌株，包括：
, http://www.100md.com
核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum, 简称Fn) ATCC 10953；
牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis, 简称Pg) ATCC 33277；
脆弱类杆菌(Bacteriodes fragilis, 简称Bf) ATCC 25285。
各菌株活化鉴定后，分别接种于CDC厌氧血琼脂平皿上，其主要成分为胰蛋白胨、大豆胨、氯化钠、酵母浸出粉、L—半胱氨酸、氯化血红素、维生素K1和琼脂，放入厌氧手套箱中，36℃厌氧培养72小时，用棉签将细菌移入生理盐水，洗涤2次(3000rpm, 离心10分钟)， 弃去上清液，细菌沉淀备用。
2. 实验药物
大蒜：取去皮新鲜大蒜(山东省龙口市复发中记工业园)1000g，用双蒸水选2遍，粉碎机榨汁,4层消毒纱布过滤，再用滤纸过滤，得淡黄色澄清的大蒜汁(pH5.5),放入4℃冰箱备用。
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50%枸橼酸：天平称取药用枸橼酸50g，加入100ml双蒸水(pH1.0)
3%双氧水：上海桃浦化工厂(沪卫药准字95第0490号—098)
3. 药物处理
洗涤干净的3种纯菌，当即用生理盐水制备成109/ml的细菌悬液，每种菌分装4根试管，每管菌液10ml，3000rpm离心10分钟，弃去上清液，在细菌沉淀中分别加入50%枸橼酸、3%双氧水和大蒜汁10ml，对照管加生理盐水10ml，37℃下混匀，处理15分钟。
4. 电镜标本制备
上述药物处理组和对照组菌液，3000rpm,离心10分钟，弃去上清液，将细菌立即放入2%戊二醛前固定，二甲胂酸钠缓冲液漂洗，1%锇酸后固定，酒精系列脱水后常规包埋，作超薄切片，在HITACHI H—500透射电镜下观察并摄片。
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结 果
1. 实验菌株特性和扫描电镜下形态
3种国际参考菌株进行复苏、纯培养后，经菌落形态、菌体染色及生化反应鉴定，结果均符合VPI厌氧菌手册鉴定特性〔4〕，对照组3种细菌的超薄切片，在透射电镜下可观察到细胞壁(CW)和细胞膜(CM)：因为这3种菌均为G-菌，细胞壁结构较为复杂，可见2～4个致密层及中间透明区结构，Pg菌表面还可见到毛状外膜；细胞浆和核区(P，Nr)：大部分细菌在均质结构中可见散在的核糖体颗粒，有的细菌在中心部分可见核区，无核膜核仁(图1～3)。
2. 药物处理后细菌的超微结构变化
黑色的Pg经50%枸橼酸处理后变为淡褐色，经3%双氧水处理，黑色的Pg很快变为白色，并可见大量气泡，而经大蒜汁处理Pg仍为黑色，Fn和Bf在3种药物处理前后颜色未见明显变化。在透射电镜下的超微结构改变(表1)(图3～12)。
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表1 药物处理组的细菌超微结构变化
组别细菌
Fn
Pg
Bf
大蒜组
胞壁失去原有结构而明显变薄，大部分胞浆溶解消化，少数变性，可见黑色沉淀(图4)
许多细菌破碎崩解，有的胞浆变性，有的出现空泡(图5)
胞壁消失或变薄，胞浆高度变性，核糖体聚集成深黑色团块沉淀，少数细胞内容物破坏出现空泡(图6)
50%枸橼酸组
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细胞变形，胞壁变薄失去原有结构，有的胞浆内可见黑色沉淀，有的消化呈空泡(图7)
可见细胞集聚融合成片和空泡变性，有些胞浆内可见黑色沉淀颗粒(图8)
大部分胞壁不完整，破裂呈不连续状态，胞浆内可见大量颗粒样黑色沉淀(图9)
3%双氧水组
胞壁与胞浆间隙明显扩大，胞浆内容物溶解漏出呈空泡，少量变性(图10)
细胞可融合聚集成片，胞壁与胞浆间隙明显扩大，胞浆萎缩，出现较多空泡(图11)
可见细胞破裂，部分胞浆内容物溶解呈空泡(图12)
讨 论
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G-厌氧菌的胞壁结构较为复杂，它在较薄的粘肽层外面还有脂蛋白、外膜和脂多糖内毒素。它是细菌对外界的物理性、功能性保护屏障，一切生物活性物质的功能如物质运转、能量转换和信息传递，均在生物膜上进行。从药物作用细菌后的超微结构变化来看，大蒜、枸橼酸、双氧水可不同程度地破坏Fn、Pg和Bf这3种口腔厌氧菌表面结构，表现为细胞壁和细胞膜破裂、变薄，有的甚至消失，这与我们以前证实这3种药物有降解内毒素作用相一致〔1〕。此外，还可观察到这些药物可影响到菌体内的胞浆，在胞浆内出现高电子密度呈深黑色团块或颗粒样沉淀，或使胞浆溶解出现空泡。这些内部结构变化，可导至细菌的死亡。
2. 药物作用的可能机制
大蒜系百合科葱属植物，是我国民间常用中药之一，味辛、性温，有杀虫、消肿、抗菌及消炎等作用，因此大蒜被誉为“天然广谱抗生素”。它的抗菌机制可能是由于：①大蒜含有的大蒜辣素分子中的氧原子，可与细菌生长繁殖所必需的半胱氨酸分子中的-SH结构；③大蒜汁pH为5.5，偏酸性；③大蒜中所含的蒜酶、过氧化酶、磷酸酯酶及水解酶等，有氧化和水解作用〔5〕。因此大蒜作用下的3种细菌变形及破裂较明显，可见胞壁消失或变薄，核糖体聚集成团块(图4～6)，对Bf作用较强。
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50%枸橼酸，其pH为1.0， 呈强酸性，可与细菌表面的P0-33，OH-1等基团作用，破坏组织结构，使胞壁不完整或破裂，增强通透性、干扰分解代谢，可溶解胞浆或使菌体蛋白和酶变性或沉淀〔6〕(图7～9)，以Pg和Bf较为典型。
3%双氧水为一种常用的强氧化剂，是一种非特异性的抗菌物质，具防腐、灭菌、除臭及清洁等作用，它与Pg接触，能很快氧化其黑色素，使菌体变成白色。双氧水可与细菌的—SH、—NH2作用，破坏组织结构，增强通透性，加之其分子量小，易透入菌体使蛋白质或酶变性，或使胞浆内容物氧化溶解，出现较多空泡(图10～12)，对Fn、Pg作用较Bf明显。
透射电镜观察证实不同药物对各种细菌的超微结构影响不尽相同，提示它们的抗菌机制也不相同。
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图1 核梭杆菌(TEM×20000)
图2 牙龈卟啉菌(TEM×20000)
图3 脆弱类杆菌(TEM×20000)
图4 大蒜处理的核梭杆菌(TEM×20000)
图5 大蒜处理的牙龈卟啉菌(TEM×20000)
图6 大蒜处理的脆弱类杆菌(TEM×20000)
图7 枸橼酸处理的核梭杆菌(TEM×20000)
图8 枸橼酸处理的牙龈卟啉菌(TEM×20000)
图9 枸橼酸处理的脆弱类杆菌菌(TEM×20000)
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图10 双氧水处理的核梭杆菌(TEM×20000)
图11 双氧水处理的脆弱类杆菌(TEM×20000)
图12 双氧水处理的脆弱类杆菌(TEM×20000)
*国家自然科学基金资助课题，(39570763)
参 考 文 献
[1] 李德懿、黄宗仁.病变牙骨质内毒素的研究.中华口腔医学杂志，1985，20(4)：193～196
[2] Chaves E, Cox CF, Morrison E, et al. The effect of citric acid application on periodontally involved root surfaces. II. An in vitro scanning eectron microscopic study. Int J Periodontics Restorative Dent. 1993;13(2): 188～196
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[3] Kersten BG, Chamberlain AD, Khorsandis, et al. Healing of the intrabony periodontal lesion following rootconditioning with citric acid and wound closure insluding an expanded PTFE membrane. J Periodontol 1992, 63(11): 876～882
[4] Holdeman LV: Anaerobe Laboratory Manual, ed4. Virginia Polytechnic Institute and state University. Blackshurg Vorginia Southern Printing Co, 1977.
[5] 阴健、郭力弓主编.中药现代研究与临床应用，第1版，北京、学苑出版社，1994；86～90
[6] 李德懿.“牙周病微生物学”，第1版 天津科技翻译出版公司，1994：167
(收稿：1998—08—02), http://www.100md.com