转染骨形成蛋白2基因对细胞凋亡影响的实验观察
作者：司晓辉 杨连甲 金 岩
单位：第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032
关键词：骨形成蛋白；基因转染；凋亡
转染骨形成蛋白2基因对细胞凋亡影响的实验观察 摘要 目的：探讨骨形成蛋白(BMP)与细胞凋亡的关系及意义。方法：利用脂质体转染方法将BMP2真核表达载体pBK-B2导入NIH3T3 细胞，通过G-418筛选获得阳性细胞克隆。细胞原位杂交和免疫组化检测BMP2基因的稳定转染及表达，并利用TUNEL法观察细胞凋亡情况。结果：BMP2基因成功导入NIH3T3细胞并得到表达。转染细胞的凋亡细胞阳性率与未转染细胞相比有显著性差异。结论：BMP2能够诱导细胞凋亡，且这种作用与细胞所处的生长分化状态密切相关。
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0063-03
, 百拇医药
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999；9(1)：63]
Effects of BMP2 gene transfection on cell apoptosis
Si Xiaohui, Yang Lianjia, Jin Yan
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aim: To elucidate the relationship between Bone Morphogenetic Protein (BMP) and cell apoptosis. Methods: Eukaryonic expression vector (pBK-B2) for BMP-2 was transduced into NIH3T3 cells by using LipofectAMINE. Positive cell clones were selected with G-418. The stably transfection and expression of BMP2 in the NIH3T3 cells were determined by in situ hybridization and immunohistochemistry methods. Cell apoptosis was also observed by TUNEL methods. Results: BMP2 gene was successfully transfected and expressed in NIH3T3 cells. There was significant difference in the rate of apoptosis between transfected cells and non-transfected cells. Conclusions: BMP2 can induce cell apoptosis and this effects are closely related to the state of cells.
, 百拇医药
Key words bone morphogenetic protein；gene transfection；apoptosis
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999;9(1):63]
细胞凋亡是从低等动物到高等动物整个生物界中一个共有的规律性现象，是由内在基因编码的主动编程性死亡，同时还包含着不同的启动机制和运行通路。越来越多的证据表明，程序性细胞死亡受到一些因子的控制，这些因子同时也控制着细胞的转化、分化及细胞周期等[1]。其中BMP在细胞凋亡中也扮演了重要的角色[1]。目前的研究认为，BMP不再是单纯的骨诱导因子，而是具有多种生物学功能的分化蛋白。为了进一步探讨BMP与细胞凋亡的关系，本实验将BMP2真核表达载体转染至成纤维细胞内，观察它对细胞凋亡的影响并探讨其意义。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 主要材料
BMP2真核表达质粒pBK-B2由本室构建[2]。小鼠成纤维细胞株NIH3T3由本校免疫学教研室金伯泉教授惠赠。LipofectAMINE转染试剂盒购自北京东方科技公司。DMEM、G-418为美国Gibco公司产品。细胞甩片机Cytospin 3 为英国Shandon公司产品。TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) kit购自美国Oncor公司。
1.2 基因转染和克隆筛选
采用脂质体载体(LipofectAMINE)将pBK-B2转染NIH3T3细胞。转染3d后，弃去原培养液，加入含G-418 500mg/L 的DMEM培养液(含100ml/L FCS)，在标准环境下培养，15d后绝大多数细胞死亡，收集G-418抗性的细胞克隆，扩大培养并制备细胞爬片，固定于40g/L多聚甲醛(PFA)/PBS (pH 7.4)中。
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1.3 原位杂交[3]
细胞爬片经3ml/L Triton X-100/ PBS、0.2、0.1mol/L HCl及蛋白酶K处理，40g/L PFA后固定及逐级酒精脱水干燥后，滴加热变性后的含地高辛标记BMP2探针的杂交液(不含BMP2探针的杂交液作空白对照)，42℃杂交过夜。2×SSC、1×SSC、0.5×SSC充分漂洗，正常羊血清封闭，然后滴加标记碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(Anti-DIG-AP)37℃温育2h。BufferⅠ、BufferⅢ充分漂洗后，NBT/ BCIP暗处显色20h。TE终止反应，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
1.4 免疫组化[4]
细胞爬片经10ml/L 过氧化氢/ PBS、3ml/L Triton X-100/ PBS处理后，滴加正常羊血清37℃温育30min，弃去血清后滴加鼠抗人BMP2单抗(以PBS替代BMP2单抗作为空白对照)，4℃过夜。滴加生物素化的羊抗鼠IgG，37℃温育30min，滴加ABC复合物37℃温育30min，上述各步之间均以PBS充分振洗。最后浸入新鲜配制的DAB显色液，室温10min，蒸馏水洗终止反应，苏木精衬染，逐级酒精脱水后二甲苯透明，中性树胶封片。
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1.5 制备细胞甩片
分别培养转染细胞和未转染细胞至对数生长期，2.5g/L胰酶消化后，用细胞甩片机以1000r/min离心3min，40g/L PFA/ PBS (pH7.4)固定40min，4℃保存备用。
1.6 细胞凋亡检测(TUNEL法)
细胞甩片在3ml/L Triton X-100/ PBS中，37℃孵育15min；PBS (0.05mol/L, pH 7.5)洗涤后，在30ml/L过氧化氢/PBS中37℃孵育5min； PBS洗涤后擦干切片周围，加25μl 平衡buffer，37℃孵育1min，擦干切片周围，加25μl TdT酶(以PBS替代TdT酶作为空白对照)，37℃孵育2h后，加入37℃预热的中止buffer，37℃孵育30min，每10min更换中止buffer 1次；buffer Ⅰ洗涤，正常羊血清37℃封闭30min；加Anti-DIG-AP 37℃孵育2h，bufferⅠ洗涤后buffer Ⅲ洗涤5min，NBT/ BCIP显色4h，蒸馏水中止反应，脱水、透明、中性树胶封片。在40×光镜下，随机选取6个视野(向同一方向移动切片，不重复不重叠)进行阳性细胞计数并计算阳性细胞率，利用统计学软件(Statgraphics Version 3.0)进行二组间统计学分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 原位杂交
在转染细胞的胞浆中有蓝色颗粒样阳性杂交信号(图1)，而亲本细胞为阴性，证明pBK-B2成功导入细胞，并有mRNA的较高表达。
图1 转染细胞胞浆呈BMP2 mRNA 阳性
(原位杂交 ×200)
2.2 免疫组化
在转染细胞的胞浆中有棕色阳性信号(图2)，而亲本细胞为阴性，证明人BMP2基因在NIH3T3细胞中得到表达。
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图2 转染细胞胞浆呈BMP2阳性
(免疫组化，苏木精衬染 ×200)
2.3 凋亡检测
经消化离心后的细胞呈圆形，在部分转染细胞和未转染细胞的胞核中可观察到蓝紫色颗粒(图 3)。阳性细胞率见附表。
图3 部分转染细胞胞核内可见蓝紫色颗
(TUNEL染色 ×100)
附表 转染细胞和未转染细胞的凋亡阳性率比较
, http://www.100md.com 阳性细胞数
阴性细胞数
合计
阳性率(%)
转染细胞
33
289
322
10.2
未转染细胞
20
331
351
, http://www.100md.com
5.7
χ2检验 P<0.05
3 讨论
细胞凋亡是正常组织细胞更新的过程，是同增殖、分化机制一起共同维持机体内环境稳定的重要因素，它为机体正常细胞的更新和异常细胞的清除提供了手段。在发育过程中，通过凋亡控制细胞数目和组织形状，如在侧腭突中嵴上皮细胞的融合过程中可观察到细胞凋亡的发生[5，6]。此外，它还在肿瘤的发生等病理过程中发挥重要作用。
在早期面部原基的发育过程中，BMP2和BMP7是未分化肢芽中胚层的潜在性的凋亡信号[7]。当把BMP珠植入趾间区域时，程序性细胞死亡和趾的游离速度均加快[7]。虽然细胞凋亡是细胞本身基因控制的自主过程，细胞外种种因素也可以通过多样的信息传递来影响细胞内调节细胞凋亡的基因，进而决定某个细胞的存亡。例如趾间细胞的凋亡，不仅依赖于BMP4和Msx2基因的表达，而且同时不能有FGFs的存在[8]。在小鼠牙齿的釉结中，BMP4能够诱导p21的表达，进一步使已分化的釉结细胞凋亡[9]。这些研究表明，细胞凋亡是由不同生长因子所介导的死亡和生存信号之间的平衡来决定的。
, 百拇医药
检测细胞凋亡的方法有电镜观察、流式细胞仪检测、琼脂糖凝胶电泳法和原位TUNEL法等，其中TUNEL法最为常用。TUNEL即末端脱氧核苷酸(TdT)介导的dUTP-X切口末端标记，由Gavrieli等[10]于1992年首先提出。TdT是一种DNA修饰酶，它可催化在DNA片段3'-OH末端合成多核苷酸聚合物的反应，即DNA片段加尾。在此过程中，带有地高辛等标记物的单核苷酸(dUTP)掺入到加尾聚合物中，完成对DNA断裂缺口的标记。TUNEL法可在常规固定的细胞或脱矿的组织切片上进行原位标记，是一种简便、快速、灵敏度和特异性都较高的标记方法。本实验利用此检测方法在正常细胞和转染BMP2的细胞内均观察到凋亡细胞，但是两种细胞的凋亡率都较低，说明细胞均处于生长状态。
通过基因转染方法研究某一外源基因在细胞中的作用是目前分子生物学常用的技术手段。本实验将BMP2真核表达载体转染至成纤维细胞后，一方面观察到细胞的增殖受到抑制，而细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素含量增加(详见另文报道)；另一方面可见发生凋亡的细胞数也增加，这一点与细胞增殖抑制相一致。BMP2既促进细胞分化又诱导细胞凋亡，看似矛盾，其实不然。我们认为，BMP2的这两种作用依赖于细胞所处的生长分化状态，正是由于BMP2对细胞生长分化和凋亡的精确调控，使细胞处于一种动态平衡，而不至于无休止地生长或死亡。这一点对于前体细胞群的调节很有意义，在前体细胞生长分化的同时不断通过凋亡而死亡，以避免前体细胞的过多积累和增殖。
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细胞内部的基因直接控制着凋亡的发生和发展，细胞外部因素通过信号传递而影响这些基因的表达从而间接地调节凋亡。对于凋亡的研究可以增进对细胞存活、死亡、分化和增殖分子机制的更深认识。关于BMP对细胞凋亡作用的分子机制的研究还有待于进一步深化。
参考文献
1 石运伯，王若翔，时玉舫. 细胞凋亡的分子机理. 生命科学, 1996, 8(3): 8
2 司晓辉，杨连甲，金岩等. 人骨形成蛋白2噬菌粒表达载体的构建与鉴定. 细胞与分子免疫学杂志，1998, 17(2): 141
3 Si XH, Jin Y, Yang LJ et al. Expression of BMP-2 and TGF-β mRNA during healing of the rabbit mandible. Eur J Oral Sci, 1997, 105 (4): 325
, 百拇医药
4 司徒镇强，吴军正. 细胞培养. 西安：世界图书出版公司，1996.202
5 Jacobson MD, Weil M, Raff MC. Programmed cell death in animal development. Cell, 1997, 88: 347
6 Taniguchi K, Sato N, Uchiyama Y. Apoptosis and heterophagy of medical edge epithelial cells of the secondary palatine shelves during fusion. Arch Histol Cytol, 1995, 58(2): 191
7 Macias D, Ganan Y, Sampath TK et al. Role of BMP-2 and OP-1(BMP-7) in programmed cell death and skeletogenesis during chick limb development. Development, 1997, 124: 1109
, 百拇医药
8 Ganan Y, Macias D, Duterque-Coquillaud M et al. Role of TGFβ and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development, 1996, 122: 2349
9 Jernvall J, Aberg T, Kettunen P et al. The life history of an embryonic signaling center: BMP4 induces p21 and is associated with apoptosis in the mouse tooth enamal knot. Development, 1998, 125(2): 161
10 Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992, 119(3): 493
收稿日期：1998-08-31
修回日期：1998-10-25
, 百拇医药
单位：第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032
关键词：骨形成蛋白；基因转染；凋亡
转染骨形成蛋白2基因对细胞凋亡影响的实验观察 摘要 目的：探讨骨形成蛋白(BMP)与细胞凋亡的关系及意义。方法：利用脂质体转染方法将BMP2真核表达载体pBK-B2导入NIH3T3 细胞，通过G-418筛选获得阳性细胞克隆。细胞原位杂交和免疫组化检测BMP2基因的稳定转染及表达，并利用TUNEL法观察细胞凋亡情况。结果：BMP2基因成功导入NIH3T3细胞并得到表达。转染细胞的凋亡细胞阳性率与未转染细胞相比有显著性差异。结论：BMP2能够诱导细胞凋亡，且这种作用与细胞所处的生长分化状态密切相关。
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0063-03
, 百拇医药
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999；9(1)：63]
Effects of BMP2 gene transfection on cell apoptosis
Si Xiaohui, Yang Lianjia, Jin Yan
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aim: To elucidate the relationship between Bone Morphogenetic Protein (BMP) and cell apoptosis. Methods: Eukaryonic expression vector (pBK-B2) for BMP-2 was transduced into NIH3T3 cells by using LipofectAMINE. Positive cell clones were selected with G-418. The stably transfection and expression of BMP2 in the NIH3T3 cells were determined by in situ hybridization and immunohistochemistry methods. Cell apoptosis was also observed by TUNEL methods. Results: BMP2 gene was successfully transfected and expressed in NIH3T3 cells. There was significant difference in the rate of apoptosis between transfected cells and non-transfected cells. Conclusions: BMP2 can induce cell apoptosis and this effects are closely related to the state of cells.
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Key words bone morphogenetic protein；gene transfection；apoptosis
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999;9(1):63]
细胞凋亡是从低等动物到高等动物整个生物界中一个共有的规律性现象，是由内在基因编码的主动编程性死亡，同时还包含着不同的启动机制和运行通路。越来越多的证据表明，程序性细胞死亡受到一些因子的控制，这些因子同时也控制着细胞的转化、分化及细胞周期等[1]。其中BMP在细胞凋亡中也扮演了重要的角色[1]。目前的研究认为，BMP不再是单纯的骨诱导因子，而是具有多种生物学功能的分化蛋白。为了进一步探讨BMP与细胞凋亡的关系，本实验将BMP2真核表达载体转染至成纤维细胞内，观察它对细胞凋亡的影响并探讨其意义。
1 材料和方法
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1.1 主要材料
BMP2真核表达质粒pBK-B2由本室构建[2]。小鼠成纤维细胞株NIH3T3由本校免疫学教研室金伯泉教授惠赠。LipofectAMINE转染试剂盒购自北京东方科技公司。DMEM、G-418为美国Gibco公司产品。细胞甩片机Cytospin 3 为英国Shandon公司产品。TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) kit购自美国Oncor公司。
1.2 基因转染和克隆筛选
采用脂质体载体(LipofectAMINE)将pBK-B2转染NIH3T3细胞。转染3d后，弃去原培养液，加入含G-418 500mg/L 的DMEM培养液(含100ml/L FCS)，在标准环境下培养，15d后绝大多数细胞死亡，收集G-418抗性的细胞克隆，扩大培养并制备细胞爬片，固定于40g/L多聚甲醛(PFA)/PBS (pH 7.4)中。
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1.3 原位杂交[3]
细胞爬片经3ml/L Triton X-100/ PBS、0.2、0.1mol/L HCl及蛋白酶K处理，40g/L PFA后固定及逐级酒精脱水干燥后，滴加热变性后的含地高辛标记BMP2探针的杂交液(不含BMP2探针的杂交液作空白对照)，42℃杂交过夜。2×SSC、1×SSC、0.5×SSC充分漂洗，正常羊血清封闭，然后滴加标记碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(Anti-DIG-AP)37℃温育2h。BufferⅠ、BufferⅢ充分漂洗后，NBT/ BCIP暗处显色20h。TE终止反应，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
1.4 免疫组化[4]
细胞爬片经10ml/L 过氧化氢/ PBS、3ml/L Triton X-100/ PBS处理后，滴加正常羊血清37℃温育30min，弃去血清后滴加鼠抗人BMP2单抗(以PBS替代BMP2单抗作为空白对照)，4℃过夜。滴加生物素化的羊抗鼠IgG，37℃温育30min，滴加ABC复合物37℃温育30min，上述各步之间均以PBS充分振洗。最后浸入新鲜配制的DAB显色液，室温10min，蒸馏水洗终止反应，苏木精衬染，逐级酒精脱水后二甲苯透明，中性树胶封片。
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1.5 制备细胞甩片
分别培养转染细胞和未转染细胞至对数生长期，2.5g/L胰酶消化后，用细胞甩片机以1000r/min离心3min，40g/L PFA/ PBS (pH7.4)固定40min，4℃保存备用。
1.6 细胞凋亡检测(TUNEL法)
细胞甩片在3ml/L Triton X-100/ PBS中，37℃孵育15min；PBS (0.05mol/L, pH 7.5)洗涤后，在30ml/L过氧化氢/PBS中37℃孵育5min； PBS洗涤后擦干切片周围，加25μl 平衡buffer，37℃孵育1min，擦干切片周围，加25μl TdT酶(以PBS替代TdT酶作为空白对照)，37℃孵育2h后，加入37℃预热的中止buffer，37℃孵育30min，每10min更换中止buffer 1次；buffer Ⅰ洗涤，正常羊血清37℃封闭30min；加Anti-DIG-AP 37℃孵育2h，bufferⅠ洗涤后buffer Ⅲ洗涤5min，NBT/ BCIP显色4h，蒸馏水中止反应，脱水、透明、中性树胶封片。在40×光镜下，随机选取6个视野(向同一方向移动切片，不重复不重叠)进行阳性细胞计数并计算阳性细胞率，利用统计学软件(Statgraphics Version 3.0)进行二组间统计学分析。
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2 结果
2.1 原位杂交
在转染细胞的胞浆中有蓝色颗粒样阳性杂交信号(图1)，而亲本细胞为阴性，证明pBK-B2成功导入细胞，并有mRNA的较高表达。
图1 转染细胞胞浆呈BMP2 mRNA 阳性
(原位杂交 ×200)
2.2 免疫组化
在转染细胞的胞浆中有棕色阳性信号(图2)，而亲本细胞为阴性，证明人BMP2基因在NIH3T3细胞中得到表达。
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图2 转染细胞胞浆呈BMP2阳性
(免疫组化，苏木精衬染 ×200)
2.3 凋亡检测
经消化离心后的细胞呈圆形，在部分转染细胞和未转染细胞的胞核中可观察到蓝紫色颗粒(图 3)。阳性细胞率见附表。
图3 部分转染细胞胞核内可见蓝紫色颗
(TUNEL染色 ×100)
附表 转染细胞和未转染细胞的凋亡阳性率比较
, http://www.100md.com 阳性细胞数
阴性细胞数
合计
阳性率(%)
转染细胞
33
289
322
10.2
未转染细胞
20
331
351
, http://www.100md.com
5.7
χ2检验 P<0.05
3 讨论
细胞凋亡是正常组织细胞更新的过程，是同增殖、分化机制一起共同维持机体内环境稳定的重要因素，它为机体正常细胞的更新和异常细胞的清除提供了手段。在发育过程中，通过凋亡控制细胞数目和组织形状，如在侧腭突中嵴上皮细胞的融合过程中可观察到细胞凋亡的发生[5，6]。此外，它还在肿瘤的发生等病理过程中发挥重要作用。
在早期面部原基的发育过程中，BMP2和BMP7是未分化肢芽中胚层的潜在性的凋亡信号[7]。当把BMP珠植入趾间区域时，程序性细胞死亡和趾的游离速度均加快[7]。虽然细胞凋亡是细胞本身基因控制的自主过程，细胞外种种因素也可以通过多样的信息传递来影响细胞内调节细胞凋亡的基因，进而决定某个细胞的存亡。例如趾间细胞的凋亡，不仅依赖于BMP4和Msx2基因的表达，而且同时不能有FGFs的存在[8]。在小鼠牙齿的釉结中，BMP4能够诱导p21的表达，进一步使已分化的釉结细胞凋亡[9]。这些研究表明，细胞凋亡是由不同生长因子所介导的死亡和生存信号之间的平衡来决定的。
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检测细胞凋亡的方法有电镜观察、流式细胞仪检测、琼脂糖凝胶电泳法和原位TUNEL法等，其中TUNEL法最为常用。TUNEL即末端脱氧核苷酸(TdT)介导的dUTP-X切口末端标记，由Gavrieli等[10]于1992年首先提出。TdT是一种DNA修饰酶，它可催化在DNA片段3'-OH末端合成多核苷酸聚合物的反应，即DNA片段加尾。在此过程中，带有地高辛等标记物的单核苷酸(dUTP)掺入到加尾聚合物中，完成对DNA断裂缺口的标记。TUNEL法可在常规固定的细胞或脱矿的组织切片上进行原位标记，是一种简便、快速、灵敏度和特异性都较高的标记方法。本实验利用此检测方法在正常细胞和转染BMP2的细胞内均观察到凋亡细胞，但是两种细胞的凋亡率都较低，说明细胞均处于生长状态。
通过基因转染方法研究某一外源基因在细胞中的作用是目前分子生物学常用的技术手段。本实验将BMP2真核表达载体转染至成纤维细胞后，一方面观察到细胞的增殖受到抑制，而细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素含量增加(详见另文报道)；另一方面可见发生凋亡的细胞数也增加，这一点与细胞增殖抑制相一致。BMP2既促进细胞分化又诱导细胞凋亡，看似矛盾，其实不然。我们认为，BMP2的这两种作用依赖于细胞所处的生长分化状态，正是由于BMP2对细胞生长分化和凋亡的精确调控，使细胞处于一种动态平衡，而不至于无休止地生长或死亡。这一点对于前体细胞群的调节很有意义，在前体细胞生长分化的同时不断通过凋亡而死亡，以避免前体细胞的过多积累和增殖。
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细胞内部的基因直接控制着凋亡的发生和发展，细胞外部因素通过信号传递而影响这些基因的表达从而间接地调节凋亡。对于凋亡的研究可以增进对细胞存活、死亡、分化和增殖分子机制的更深认识。关于BMP对细胞凋亡作用的分子机制的研究还有待于进一步深化。
参考文献
1 石运伯，王若翔，时玉舫. 细胞凋亡的分子机理. 生命科学, 1996, 8(3): 8
2 司晓辉，杨连甲，金岩等. 人骨形成蛋白2噬菌粒表达载体的构建与鉴定. 细胞与分子免疫学杂志，1998, 17(2): 141
3 Si XH, Jin Y, Yang LJ et al. Expression of BMP-2 and TGF-β mRNA during healing of the rabbit mandible. Eur J Oral Sci, 1997, 105 (4): 325
, 百拇医药
4 司徒镇强，吴军正. 细胞培养. 西安：世界图书出版公司，1996.202
5 Jacobson MD, Weil M, Raff MC. Programmed cell death in animal development. Cell, 1997, 88: 347
6 Taniguchi K, Sato N, Uchiyama Y. Apoptosis and heterophagy of medical edge epithelial cells of the secondary palatine shelves during fusion. Arch Histol Cytol, 1995, 58(2): 191
7 Macias D, Ganan Y, Sampath TK et al. Role of BMP-2 and OP-1(BMP-7) in programmed cell death and skeletogenesis during chick limb development. Development, 1997, 124: 1109
, 百拇医药
8 Ganan Y, Macias D, Duterque-Coquillaud M et al. Role of TGFβ and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development, 1996, 122: 2349
9 Jernvall J, Aberg T, Kettunen P et al. The life history of an embryonic signaling center: BMP4 induces p21 and is associated with apoptosis in the mouse tooth enamal knot. Development, 1998, 125(2): 161
10 Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992, 119(3): 493
收稿日期：1998-08-31
修回日期：1998-10-25
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