大鼠正常牙髓和炎症牙髓中Bcl-2，Bax的表达及其意义
作者：余 擎 吴补领 肖明振 史俊南 赵书芳
单位：第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032
关键词：Bcl-2；Bax；牙髓炎；大鼠
牙体牙髓牙周病学杂志CHINESE JOURNAL OF CONSERVATIVE DENTISTRY1999年 第9卷 第1期 Vol 摘要 目的：建立大鼠实验性牙髓炎模型；原位观察大鼠正常牙髓和炎症牙髓中Bcl-2和Bax的表达情况，探讨两者在牙髓炎病理变化中的作用。方法：利用 SD大鼠的下颌第一磨牙采用内毒素化学诱导法建立牙髓炎模型，用免疫组织化学染色的方法研究Bcl-2和Bax的表达及其意义。结果: 正常牙髓中Bcl-2在成牙本质细胞层表达阳性，牙髓中央区域弱阳性, Bax在成牙本质细胞层表达强阳性，牙髓中央区域阳性。在牙髓中央的表达弱于牙髓外周，Bcl-2的表达在相应部位弱于Bax。在炎症牙髓中炎细胞浸润区Bcl-2表达强阳性，纤维包饶区和充血反应区表达分别为阳性和弱阳性, Bax在炎症牙髓中着色较均匀。结论：成牙本质细胞凋亡与Bcl-2和Bax的表达量有关，正常牙髓中存在细胞凋亡，这与该部位Bax表达量较高有关；Bcl-2和Bax是牙髓炎时炎细胞凋亡的重要调控因素之一。
, 百拇医药
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0055-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(1)：55]
Immunohistochemical demonstration of bcl-2 Protein and baxProtein in rat normal and inflammatory pulp
Yu Qing, Wu Buling, Xiao Mingzhen et al
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aims: To establish a model of rat endotoxic pulpitis. To observe the expression of Bcl-2 and Bax in rat normal and inflammatory dental pulp in situ, and to explore the impact of Bcl-2 and Bax on pulpitis. Methods: Sixteen rat molars by application of LPS were removed from the jaws after 24h、72h、120h and 168h respectively. The expression of Bcl-2 and Bax was assessed with immunohistochemical technique. Results: Many Bcl-2 and Bax positive cells were observed in odontoblasts of rat normal pulp, and few of them were in the middle of pulp. The positive rate and staining intensity of Bax were significantly higher than the Bcl-2 in the same area. Conclusions:The apoptosis of odontoblasts was related to the expression of Bcl-2 and Bax. Apoptosis in dental pulp was accompanied with a higher expression of Bax. Bcl-2 was one of the important modulated factors of apoptosis in pulpitis, and Bax was more stable.
, 百拇医药
Key words Bcl-2；Bax；pulpitis；rat
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(1):55]
bcl-2是B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2, Bcl-2)基因的缩写形式，是最早在人类细胞中发现的凋亡调控癌基因。Bax是在人前白细胞基因文库中发现的一种凋亡相关基因。研究表明，Bcl-2的抗凋亡作用及Bax的促凋亡作用是通过二聚体的形式来实现的，两者在组织细胞中的表达量与细胞凋亡的调控紧密相关[1，2]。正常牙髓和炎症牙髓中存在细胞调亡[3]，那么Bcl-2和Bax在其中有什么作用，本文就此作一报道。
1 材料和方法
1.1 动物模型的制备
, 百拇医药
参照余擎报道[4]，选用LPS法的模型。
1.2 免疫组织化学染色
参照德国宝灵曼公司SP免疫组化试剂盒的方法，脱蜡至水后行微波抗原修复，用30ml/L H2O2消除内源性过氧化物酶的活性，100ml/L正常山羊血清(多抗)封闭37℃20min，倾去血清，分别滴加1:50的Bcl-2和Bax多抗工作液，4℃过夜。次日复温1h，滴加1:100的生物素标记二抗37℃30min，再滴加1:100的辣根酶标记链霉卵白素37℃30min，最后DAB显色15min，苏木精复染，脱水透明，中性树胶封片。(所用试剂均购自北京中山生物技术有限公司，各步骤间均用0.01mol/L的PBS振洗，阴性对照用PBS代替一抗。)
2 结果
正常牙髓中Bcl-2和Bax均有表达，两者均定位于细胞的胞浆，Bcl-2在部分胞膜上也有表达，表现为棕黄色着色。Bcl-2在成牙本质细胞层表达阳性，在牙髓中央区域弱阳性表达(图1)； Bax在成牙本质细胞层表达强阳性，在牙髓中央区域呈阳性表达(图2)。从阳性染色的强度来看，两者在牙髓中央的表达弱于牙髓外周，尤其是成牙本质细胞层，而Bcl-2的表达在相应部位又弱于Bax。
, http://www.100md.com
图1 正常牙髓中Bcl-2的表达 (10×10)
图2 正常牙髓成牙本质细胞Bax表达阳性 (40×10)
通过LPS化学诱导，各实验组呈现出较典型的牙髓炎症性组织病理学改变，从穿髓点以下依次出现坏死区、炎细胞浸润区、纤维包饶区和充血反应区。在炎症牙髓中我们观察到，炎细胞浸润区Bcl-2表达强阳性，纤维包饶区和充血反应区表达分别为阳性和弱阳性(图3)；Bax在炎症牙髓中的表达也是阳性，但着色较均匀(图4)。此外，我们还注意到在1d组、3d组、5d组、7d组中，Bcl-2和Bax在炎症区域的表达是逐渐减弱的。
图3 Bcl-2在炎症牙髓中的表达 (10×10)
, 百拇医药
图4 Bax在炎症牙髓中的表达 (10×10)
3 讨论
bcl-2是一种凋亡抑制基因，其编码的蛋白能抑制细胞发生凋亡，延长细胞的存活时间。Bcl-2蛋白抗凋亡作用的机制尚不明确，但至少与以下因素有关：①Bcl-2蛋白羧基端19个氨基酸构成疏水的跨膜整合区或称信号锚定顺序(signal anchor sequence)是Bcl-2发挥作用的结构基础。②Bcl-2通常以同源二聚体或异源二聚体的形式发挥作用。Bcl-2可与同家族的Bax、Bcl-x(s)、AL基因、Bad及非同家族的Bag-1形成异源二聚体。③Bcl-2的作用受其它基因的影响，如p53、c-myc等。Bax的基本生物学功能是促进细胞凋亡，其促凋亡作用也是通过同源二聚体或异源二聚体来调节的，其促凋亡作用受Bcl-2、Bcl-x(l)和Bad调节，均以二聚体形式发挥作用。Bcl-2和Bax的表达具有一定的组织特异性和细胞分化阶段特异性。Bcl-2基因在哺乳动物胚胎组织中广泛表达，在人成熟组织中主要表达于长寿细胞和/或具有增殖活性的细胞，Bax的表达则更为广泛[1，2，5]。
, 百拇医药
成牙本质细胞是终末分化细胞，是牙髓组织中的一种长寿细胞，本研究结果表明正常牙髓的成牙本质细胞Bcl-2表达阳性，提示成牙本质细胞在牙髓组织中较其它细胞存活时间长的机理可能是由于Bcl-2抑制成牙本质细胞凋亡，延长了它们的存活时间。本实验结果表明：正常牙髓中成牙本质细胞层和牙髓中央Bcl-2和Bax均有表达，且在牙髓中央的表达弱于牙髓外周，尤其是成牙本质细胞层，而Bcl-2的表达在相应部位又弱于Bax。因此我们认为，正常牙髓中Bcl-2和Bax均有表达，两者在同一细胞中表达的高低可能决定着该细胞的生死存亡。由于同一区域Bax的表达强于Bcl-2，而牙髓外周又强于中央，说明牙髓中细胞无论是中央还是外周都发生着细胞凋亡，且外周多于中央。这说明Bcl-2/Bax是牙髓组织中细胞凋亡的重要调控因素之一。
我们选用了内毒素诱导法建立大鼠实验性牙髓炎模型，观察了4个时间点。从时空上说LPS的毒素是自穿髓点向根方和四周逐渐渗透和扩散的，组织细胞的坏死分解产物及致炎因子也是向根方和四周逐渐渗透和扩散的，因而同一时间点的各实验组中依次出现坏死区、炎细胞浸润区、纤维包饶区和充血反应区，充分反映了牙髓炎的发生发展过程和牙髓的自身防御能力。免疫组化结果表明：炎细胞浸润区Bcl-2表达强阳性，纤维包饶区和充血反应区表达分别为阳性和弱阳性，Bax在炎症牙髓中的表达也是阳性，但着色较均匀。从而提示在大鼠实验性牙髓炎中大量的炎细胞由于Bcl-2的高表达而不能及时发生细胞凋亡，从而不能被及时清除，最终走向细胞坏死，这样一来其坏死分解产物、释放的毒性内容物或产生的趋化因子就能加重局部组织的损害，使得牙髓炎症不易控制，最后牙髓坏死。此外，由于Bax在牙髓炎各部位的表达较均匀，可以推测牙髓炎中机体对细胞凋亡的调控主要是通过改变Bcl-2的表达量和表达部位而实现的。
, 百拇医药
炎症灶内的炎症细胞和其它增生细胞通过凋亡机制有效清除，一方面可以限制炎症反应的发展，另一方面可以防止炎症后纤维增生和瘢痕形成。本研究发现，Bcl-2是牙髓炎时炎细胞凋亡的重要调控因素之一，那么在去除外界刺激因素的前提下，能否通过改变Bcl-2的局部表达量，促进炎细胞及增生细胞发生细胞凋亡，使其被有效清除，从而达到限制炎症发展，治疗牙髓炎的目的。这是牙髓病研究的新课题，尚待进一步研究和探讨。
参考文献
1 Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved hemology, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell, 1993，74:609
2 Boise LM, Gonzalez-Garcia M, Postema CE et al. A bcl-2 ralated gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell, 1993，74:597
, 百拇医药
3 余擎，吴补领，肖明振等. 大鼠正常牙髓和炎症牙髓中的细胞凋亡. 牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(1)：52
4 余擎，吴补领，肖明振等. 内毒素脂多糖等方法刺激大鼠牙髓的组织病理学反应. 牙体牙髓牙周病学杂志, 1999，9(1)：49
5 Krajewski S, Krajewska M, Shabaik A et al. Immunohistochemical determination of in vivo distribution of Bax, a dominant inhibitor of Bcl-2. Am J Pathol, 1994，1323
收稿日期：1998-10-12
修回日期：1998-12-20, http://www.100md.com
单位：第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032
关键词：Bcl-2；Bax；牙髓炎；大鼠
牙体牙髓牙周病学杂志CHINESE JOURNAL OF CONSERVATIVE DENTISTRY1999年 第9卷 第1期 Vol 摘要 目的：建立大鼠实验性牙髓炎模型；原位观察大鼠正常牙髓和炎症牙髓中Bcl-2和Bax的表达情况，探讨两者在牙髓炎病理变化中的作用。方法：利用 SD大鼠的下颌第一磨牙采用内毒素化学诱导法建立牙髓炎模型，用免疫组织化学染色的方法研究Bcl-2和Bax的表达及其意义。结果: 正常牙髓中Bcl-2在成牙本质细胞层表达阳性，牙髓中央区域弱阳性, Bax在成牙本质细胞层表达强阳性，牙髓中央区域阳性。在牙髓中央的表达弱于牙髓外周，Bcl-2的表达在相应部位弱于Bax。在炎症牙髓中炎细胞浸润区Bcl-2表达强阳性，纤维包饶区和充血反应区表达分别为阳性和弱阳性, Bax在炎症牙髓中着色较均匀。结论：成牙本质细胞凋亡与Bcl-2和Bax的表达量有关，正常牙髓中存在细胞凋亡，这与该部位Bax表达量较高有关；Bcl-2和Bax是牙髓炎时炎细胞凋亡的重要调控因素之一。
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中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0055-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(1)：55]
Immunohistochemical demonstration of bcl-2 Protein and baxProtein in rat normal and inflammatory pulp
Yu Qing, Wu Buling, Xiao Mingzhen et al
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aims: To establish a model of rat endotoxic pulpitis. To observe the expression of Bcl-2 and Bax in rat normal and inflammatory dental pulp in situ, and to explore the impact of Bcl-2 and Bax on pulpitis. Methods: Sixteen rat molars by application of LPS were removed from the jaws after 24h、72h、120h and 168h respectively. The expression of Bcl-2 and Bax was assessed with immunohistochemical technique. Results: Many Bcl-2 and Bax positive cells were observed in odontoblasts of rat normal pulp, and few of them were in the middle of pulp. The positive rate and staining intensity of Bax were significantly higher than the Bcl-2 in the same area. Conclusions:The apoptosis of odontoblasts was related to the expression of Bcl-2 and Bax. Apoptosis in dental pulp was accompanied with a higher expression of Bax. Bcl-2 was one of the important modulated factors of apoptosis in pulpitis, and Bax was more stable.
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Key words Bcl-2；Bax；pulpitis；rat
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(1):55]
bcl-2是B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2, Bcl-2)基因的缩写形式，是最早在人类细胞中发现的凋亡调控癌基因。Bax是在人前白细胞基因文库中发现的一种凋亡相关基因。研究表明，Bcl-2的抗凋亡作用及Bax的促凋亡作用是通过二聚体的形式来实现的，两者在组织细胞中的表达量与细胞凋亡的调控紧密相关[1，2]。正常牙髓和炎症牙髓中存在细胞调亡[3]，那么Bcl-2和Bax在其中有什么作用，本文就此作一报道。
1 材料和方法
1.1 动物模型的制备
, 百拇医药
参照余擎报道[4]，选用LPS法的模型。
1.2 免疫组织化学染色
参照德国宝灵曼公司SP免疫组化试剂盒的方法，脱蜡至水后行微波抗原修复，用30ml/L H2O2消除内源性过氧化物酶的活性，100ml/L正常山羊血清(多抗)封闭37℃20min，倾去血清，分别滴加1:50的Bcl-2和Bax多抗工作液，4℃过夜。次日复温1h，滴加1:100的生物素标记二抗37℃30min，再滴加1:100的辣根酶标记链霉卵白素37℃30min，最后DAB显色15min，苏木精复染，脱水透明，中性树胶封片。(所用试剂均购自北京中山生物技术有限公司，各步骤间均用0.01mol/L的PBS振洗，阴性对照用PBS代替一抗。)
2 结果
正常牙髓中Bcl-2和Bax均有表达，两者均定位于细胞的胞浆，Bcl-2在部分胞膜上也有表达，表现为棕黄色着色。Bcl-2在成牙本质细胞层表达阳性，在牙髓中央区域弱阳性表达(图1)； Bax在成牙本质细胞层表达强阳性，在牙髓中央区域呈阳性表达(图2)。从阳性染色的强度来看，两者在牙髓中央的表达弱于牙髓外周，尤其是成牙本质细胞层，而Bcl-2的表达在相应部位又弱于Bax。
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图1 正常牙髓中Bcl-2的表达 (10×10)
图2 正常牙髓成牙本质细胞Bax表达阳性 (40×10)
通过LPS化学诱导，各实验组呈现出较典型的牙髓炎症性组织病理学改变，从穿髓点以下依次出现坏死区、炎细胞浸润区、纤维包饶区和充血反应区。在炎症牙髓中我们观察到，炎细胞浸润区Bcl-2表达强阳性，纤维包饶区和充血反应区表达分别为阳性和弱阳性(图3)；Bax在炎症牙髓中的表达也是阳性，但着色较均匀(图4)。此外，我们还注意到在1d组、3d组、5d组、7d组中，Bcl-2和Bax在炎症区域的表达是逐渐减弱的。
图3 Bcl-2在炎症牙髓中的表达 (10×10)
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图4 Bax在炎症牙髓中的表达 (10×10)
3 讨论
bcl-2是一种凋亡抑制基因，其编码的蛋白能抑制细胞发生凋亡，延长细胞的存活时间。Bcl-2蛋白抗凋亡作用的机制尚不明确，但至少与以下因素有关：①Bcl-2蛋白羧基端19个氨基酸构成疏水的跨膜整合区或称信号锚定顺序(signal anchor sequence)是Bcl-2发挥作用的结构基础。②Bcl-2通常以同源二聚体或异源二聚体的形式发挥作用。Bcl-2可与同家族的Bax、Bcl-x(s)、AL基因、Bad及非同家族的Bag-1形成异源二聚体。③Bcl-2的作用受其它基因的影响，如p53、c-myc等。Bax的基本生物学功能是促进细胞凋亡，其促凋亡作用也是通过同源二聚体或异源二聚体来调节的，其促凋亡作用受Bcl-2、Bcl-x(l)和Bad调节，均以二聚体形式发挥作用。Bcl-2和Bax的表达具有一定的组织特异性和细胞分化阶段特异性。Bcl-2基因在哺乳动物胚胎组织中广泛表达，在人成熟组织中主要表达于长寿细胞和/或具有增殖活性的细胞，Bax的表达则更为广泛[1，2，5]。
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成牙本质细胞是终末分化细胞，是牙髓组织中的一种长寿细胞，本研究结果表明正常牙髓的成牙本质细胞Bcl-2表达阳性，提示成牙本质细胞在牙髓组织中较其它细胞存活时间长的机理可能是由于Bcl-2抑制成牙本质细胞凋亡，延长了它们的存活时间。本实验结果表明：正常牙髓中成牙本质细胞层和牙髓中央Bcl-2和Bax均有表达，且在牙髓中央的表达弱于牙髓外周，尤其是成牙本质细胞层，而Bcl-2的表达在相应部位又弱于Bax。因此我们认为，正常牙髓中Bcl-2和Bax均有表达，两者在同一细胞中表达的高低可能决定着该细胞的生死存亡。由于同一区域Bax的表达强于Bcl-2，而牙髓外周又强于中央，说明牙髓中细胞无论是中央还是外周都发生着细胞凋亡，且外周多于中央。这说明Bcl-2/Bax是牙髓组织中细胞凋亡的重要调控因素之一。
我们选用了内毒素诱导法建立大鼠实验性牙髓炎模型，观察了4个时间点。从时空上说LPS的毒素是自穿髓点向根方和四周逐渐渗透和扩散的，组织细胞的坏死分解产物及致炎因子也是向根方和四周逐渐渗透和扩散的，因而同一时间点的各实验组中依次出现坏死区、炎细胞浸润区、纤维包饶区和充血反应区，充分反映了牙髓炎的发生发展过程和牙髓的自身防御能力。免疫组化结果表明：炎细胞浸润区Bcl-2表达强阳性，纤维包饶区和充血反应区表达分别为阳性和弱阳性，Bax在炎症牙髓中的表达也是阳性，但着色较均匀。从而提示在大鼠实验性牙髓炎中大量的炎细胞由于Bcl-2的高表达而不能及时发生细胞凋亡，从而不能被及时清除，最终走向细胞坏死，这样一来其坏死分解产物、释放的毒性内容物或产生的趋化因子就能加重局部组织的损害，使得牙髓炎症不易控制，最后牙髓坏死。此外，由于Bax在牙髓炎各部位的表达较均匀，可以推测牙髓炎中机体对细胞凋亡的调控主要是通过改变Bcl-2的表达量和表达部位而实现的。
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炎症灶内的炎症细胞和其它增生细胞通过凋亡机制有效清除，一方面可以限制炎症反应的发展，另一方面可以防止炎症后纤维增生和瘢痕形成。本研究发现，Bcl-2是牙髓炎时炎细胞凋亡的重要调控因素之一，那么在去除外界刺激因素的前提下，能否通过改变Bcl-2的局部表达量，促进炎细胞及增生细胞发生细胞凋亡，使其被有效清除，从而达到限制炎症发展，治疗牙髓炎的目的。这是牙髓病研究的新课题，尚待进一步研究和探讨。
参考文献
1 Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved hemology, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell, 1993，74:609
2 Boise LM, Gonzalez-Garcia M, Postema CE et al. A bcl-2 ralated gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell, 1993，74:597
, 百拇医药
3 余擎，吴补领，肖明振等. 大鼠正常牙髓和炎症牙髓中的细胞凋亡. 牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(1)：52
4 余擎，吴补领，肖明振等. 内毒素脂多糖等方法刺激大鼠牙髓的组织病理学反应. 牙体牙髓牙周病学杂志, 1999，9(1)：49
5 Krajewski S, Krajewska M, Shabaik A et al. Immunohistochemical determination of in vivo distribution of Bax, a dominant inhibitor of Bcl-2. Am J Pathol, 1994，1323
收稿日期：1998-10-12
修回日期：1998-12-20, http://www.100md.com