人牙本质基质蛋白1 cDNA序列的克隆*
作者：郝建军 费 俭 麻孙恺 江卫民 刘 正 史俊南 郭礼和
单位：
刘 正 郝建军 第二医科大学第九人民医院，上海 200011；郭礼和 费 俭 麻孙恺 中科院上海细胞所基因工程组，上海 200031；江卫民 史俊南 第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：牙本质基质蛋白1；聚合酶链反应；人
牙体牙髓牙周病学杂志CHINESE JOURNAL OF CONSERVATIVE DENTISTRY1999年 第9卷 第1期 Vol 摘要 目的：克隆人牙本质基质蛋白1( DMP1)成熟肽编码区基因片段。方法：用异硫氰酸胍一步法从引产胎儿牙乳头组织中抽提总RNA，用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙乳头cDNA，然后利用PCR方法，从cDNA中扩增出人DMP1成熟区的基因片段(约1.8 kbp)，将所得基因片段插入pBluescript质粒载体，转化到大肠杆菌XL1-Blue后挑选阳性克隆，提取重组质粒DNA，通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到人DMP1成熟肽编码区基因片段。
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中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0042-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999；9(1)：42]
Cloning and partially sequencing of human dentin matrixprotein 1 encoding mature protei
Hao Jianjun, Fei Jian， Ma Sunkai et al
School of Stomatology, The Shanghai Secondary Medical University, Shanghai 200011
Abstract Aim: Cloning and partially sequencing of human dentin matrix protein 1 (DMP1) encoding mature protein. Methods: In the study, total RNA was extracted from the tooth germs of a legally aborted embryo by acid guanidinium thiocyanata-phenol-chloroform method, the desired DNA product was obtained from the total RNA by RT-PCR with the primers including Oligo(dt) and two gene specific primers. The segment (about 1.8 kbp) was inserted into pBluescript vector and the interesting plasmid was transformed into E. Coli host strain XL1-Blue. The double-stranded DNA of the positive clone was analyzed by restriction endonuclease mapping and DNA sequencing. Results: The restriction endonuclease map and sequence of human DMP1 encoding mature protein were consistent with those of the references published. Conclusion: The human DMP1 cDNA encoding mature protein was obtained for further research.
, 百拇医药
Key Words dentin matrix protein 1；PCR；human
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999;9(1)：42]
牙本质基质蛋白1(Dental Matrix Protein 1，DMP1)是牙本质基质非胶原蛋白的主要成员之一，为成牙本质细胞合成的磷酸化蛋白质。它不仅是成牙本质细胞重要的表面标记，而且在牙本质生物矿化中具有成核作用，调节矿化晶体的形态和生长速度，起着维持矿化组织的重要作用[1]。本文采用逆转录PCR方法，从合法引产胎儿切牙、尖牙和前磨牙牙乳头组织中克隆到DMP1 cDNA基因片段，并测定了其部分核苷酸序列。
1 材料和方法
本组所用9月龄胎儿为合法引产胎儿。无菌条件下暴露前磨牙部位，挑开牙龈组织，挖取乳切牙、乳尖牙和乳前磨牙[2，3]，立即置液氮中冻存，-70℃下长期保存。
, 百拇医药
根据Hirst[4]等报道的人DMP1的cDNA序列，采用PC Gene 设计PCR扩增的两条引物。5'和3'端引物序列为：5'AAGAATTCTACGGAGGGTAGAGGTATCACACC3'，带有EcoRI酶切位点；3'端的引物序列为5'AAAGGATCCTGCAGATCCTTTCTTGCTTACTAGC3'，带有BamHI酶切识别序列。
载体质粒pBluescript KS(pBS)用 SmaI酶切消化，平端连接目的基因片段和酶切质粒载体。限制性内切酶均购自Promega公司。
逆转录PCR扩增、PCR产物的克隆、酶谱分析和核苷酸分析与郝建军的报道相同[5]。
2 结果
2.1 总RNA
异硫氰酸胍一步法提取的人牙乳头总RNA电泳(图1)，所获得的总RNA无明显的降解
, 百拇医药
1.人牙胚组织总RNA
2.小鼠牙乳头组织总R
图1 人牙乳头组织总RNA琼脂糖凝胶电泳
2.2 RT-PCR
牙胚组织总RNA经RT-PCR扩增后，可见大小约1.8 kbp的特异扩增产物(图2)。
图2 PCR扩增产物DMP1和重组质粒pBS/DMP1酶切图谱琼脂糖凝胶电泳
1.λDNA/HindⅢ
2.阴性对照(未加重组质粒模板)
3.以重组质粒为模板的DMP1 PCR产物
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4.重组质粒pBS/DMP1
5.pBS/DMP1经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切
6.载体质粒pBS7.λDNA/PstⅠ 8.目的产物DMP19.阴性产物(未加模板)
2.3 pBS-DMP1克隆的酶谱分析
重质粒pBS-DMP1经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后为两条带(图2，第5道)，1.8 kbp的DMP1和2.96kbp的载体pBS。1.8 kbp的DMP1与 PCR的目的产物电泳条带(8和3道)平齐，2.96kbp的pBS与空载体pBS(6道)平齐。重组质粒pBS-DSP的酶切图谱与预期的完全一致。ApaI 酶切pBS-DMP1可获得1.4kbp和3.4kbp两条带，这与文献报道的人DMP1序列的酶切位点完全一致(图3)[4]。
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图3 重组质粒pBS-DMP1酶切图谱琼脂糖凝胶电泳
1 λDNA-PstⅠ
2,3 重组质粒pBS-DMP1经ApaI酶切
4,5 pBS-DMP1经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切
6 重组质粒pBS-DMP1
2.4 pBS-DMP1克隆的序列分析
DMP1成熟蛋白编码区基因克隆质粒pBS-DMP1部分核苷酸的测序结果，可读出的200个碱基序列与Hirst等[4]报道的结果完全相同。
3 讨论
DMP1是牙本质主要非胶原蛋白的一种，是磷酸化程度高、酸性较强的蛋白质之一。1993年George等[6]在用多抗筛选SD大鼠成牙本质细胞-牙髓成纤维细胞复合体文库时发现了一种新的牙本质基质酸性蛋白，名命为AG1。随后他们[7]又用地高辛标记的核酸探针研究AG1在小鼠染色体的定位，发现其基因位于5q21，与fgf 5紧密相连，为了符合目前染色体命名规则，AG1被更名为牙本质基质蛋白1(DMP1)。
, 百拇医药
目前，已克隆了大鼠[6]、小鼠[8]、牛[9]和人[4]的DMP1 cDNA片段。人DMP1基因5'端有99bp的非翻译区(untranslated region, UTR)，由1539bp组成的单一开放读框，编码513个残基的强酸性蛋白，主要的三个氨基酸为丝氨酸、谷氨酸和天门冬氨酸，分别占21.4%，15.6%，12.1%。3'端有1041 bp的UTR，包括一个聚腺苷酸化信号。与人相比，牛DMP1基因序列的同一性和相似性分别为70.5%，82.5%，大鼠分别为66.2%，81.5%，小鼠为66.1%，80.5%。人、牛、小鼠和大鼠的DMP1基因有一些高度保守的区域，如疏水的16氨基酸残基信号肽，与细胞粘附有关的RGD三肽，数个可能是酪蛋白激酶I或II磷酸化位点的丝氨酸残基。人DMP1由6个外显子组成，为零型连接。第1外显子为78bp UTR，第2外显子为21bp UTR和16氨基酸残基构成的信号肽及N末端的2个氨基酸，第3、4和5外显子分别为48、33和48bp，第6外显子含有1320bp，包括编码的452个氨基酸、终止码和3'端UTR。DMP1的谷氨酸含量很高，组成上与OPN和BSP相似，其N未端序列与BAG-75和牙本质磷蛋白相似，提示DMP1的生物学特征介于骨和牙本质酸性磷蛋白之间。
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最近Hirst等[8]和MacDougall等[9]的报道对DMP1属于牙本质特异性蛋白提出质疑。Hirst等用含整个牛DMP1的1794bp 的酶切片段进行Zoo印迹分析，发现这段序列在人、猴、猪、羊和小鼠中为高度保守，但鸡的基因组DNA没有表达。用此片段作为探针进行Northern印迹显示，脑、成牙本质细胞和骨中约有3.0kb的杂交片段，其中表达水平最高的是脑，其次是成牙本质细胞和培养的长骨。胎牛脑中表达DMP1可能是一过性的，随着生长和发育DMP1在脑中消失，或表达减少。牛肝、皮肤和成釉细胞及颌骨中提取的mRNA没有检测到DMP1的表达。MacDougall等[9]通过原位杂交发现DMP1在小鼠体内的表达谱更广，不仅在成牙本质细胞中，而且在其它矿化组织如骨和牙骨质均有表达。因此，她们认为DMP1不是牙本质特异性蛋白，而应归属于矿化组织特异性蛋白之列。
尽管DMP1不是牙本质特异蛋白，但在牙本质的生物矿化过程中发挥着重要的作用，这主要是成牙本质细胞分泌的胶原蛋白提供了矿化所需的支架和空间，分泌的一组酸性蛋白(主要是牙本质磷蛋白或牙本质涎磷蛋白和DMP1)作为调节分子进入预先形成的结构基质中，在酸性蛋白与结构基质特异结合的位点上晶体生长的成核作用被启动，基质分子与晶体进一步作用可以调节晶体最终形成的大小和形态[10]。通过本实验，作者已克隆了人DMP1成熟肽编码区cDNA，现正在表达该成熟肽，这将为深入研究DMP1在牙本质矿化中的作用打下良好的基础。
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(在实验过程中得到第四军医大学口腔医学院肖明振和吴补领教授的指导，特此致谢)。
* 国家自然科学基金资助项目(39700160)；上海市博士后科研资助计划项目和中科院上海细胞所开放实验室资助课题
参考文献
1 郝建军.牙本质特异性蛋白的分子生物学研究进展.牙体牙髓牙周病学杂志,1998，8(4)：286
2 Hao Jianjun, Shi Junnan, Niu Zhongying et al. Mineralized nodules from human dental papilla cells in vitro. Eur J Oral Sci, 1997, 105(4):318
3 郝建军，汪平，史俊南.碱性成纤维细胞生长因子对体外大鼠牙胚分化的影响.牙体牙髓牙周病学杂志,1997,7(3):180
, 百拇医药
4 Hirst KL, Simmons D, Feng J et al. Elucidation of the sequence and the genomic organization of the human dentin matrx acidic phosphoprotein 1 (DMP1) gene: Exclusion of the locus from a causative role in the pathogenesis of dentinogenesis imperfecta type II. Genomics, 1997,42:38
5 郝建军, 麻孙恺, 费俭 等. 小鼠牙本质涎蛋白成熟肽编码区cDNA克隆与部分序列分析. 牙体牙髓牙周病学杂志, 1999，9(1)：39
6 George A, SabsayB, Simonian PAL et al. Characterization of a novel dentin matrix acidic phosphoprotein. J Biol Chem, 1993,268:12624
, 百拇医药
7 George A, Gui J, Jenkins NA et al. In situ localization and chromosomal mapping of the AG1(DMP1) gene. J Histochem Cytochem, 1994,42:1527
8 Hirst KL, Ibaraki-O'Connor K, Young MF et al. Cloning and expression analysis of the bovine dentin matrix acidic phosphoprotein gene. J Dent Res, 1997,76(3):754
9 MacDougall M, Gu TT, Simmons D et al. Charactrization of a novel isoform of dentin matrix protein 1: Spatial expression pattern in mineralization tissues. J Bone Miner Res, 1998，13(3)：422
10 Furedi-Mihofer H, Moradian-Oldak J, Weiner S et al. Interactions of matrix proteins from mineralized tissues with ocracalcium phosphate. Connect Tissue Res, 1994,30:251
收稿日期：1998-09-09
修回日期：1998-12-20
, 百拇医药
单位：
刘 正 郝建军 第二医科大学第九人民医院，上海 200011；郭礼和 费 俭 麻孙恺 中科院上海细胞所基因工程组，上海 200031；江卫民 史俊南 第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：牙本质基质蛋白1；聚合酶链反应；人
牙体牙髓牙周病学杂志CHINESE JOURNAL OF CONSERVATIVE DENTISTRY1999年 第9卷 第1期 Vol 摘要 目的：克隆人牙本质基质蛋白1( DMP1)成熟肽编码区基因片段。方法：用异硫氰酸胍一步法从引产胎儿牙乳头组织中抽提总RNA，用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙乳头cDNA，然后利用PCR方法，从cDNA中扩增出人DMP1成熟区的基因片段(约1.8 kbp)，将所得基因片段插入pBluescript质粒载体，转化到大肠杆菌XL1-Blue后挑选阳性克隆，提取重组质粒DNA，通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到人DMP1成熟肽编码区基因片段。
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中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0042-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999；9(1)：42]
Cloning and partially sequencing of human dentin matrixprotein 1 encoding mature protei
Hao Jianjun, Fei Jian， Ma Sunkai et al
School of Stomatology, The Shanghai Secondary Medical University, Shanghai 200011
Abstract Aim: Cloning and partially sequencing of human dentin matrix protein 1 (DMP1) encoding mature protein. Methods: In the study, total RNA was extracted from the tooth germs of a legally aborted embryo by acid guanidinium thiocyanata-phenol-chloroform method, the desired DNA product was obtained from the total RNA by RT-PCR with the primers including Oligo(dt) and two gene specific primers. The segment (about 1.8 kbp) was inserted into pBluescript vector and the interesting plasmid was transformed into E. Coli host strain XL1-Blue. The double-stranded DNA of the positive clone was analyzed by restriction endonuclease mapping and DNA sequencing. Results: The restriction endonuclease map and sequence of human DMP1 encoding mature protein were consistent with those of the references published. Conclusion: The human DMP1 cDNA encoding mature protein was obtained for further research.
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Key Words dentin matrix protein 1；PCR；human
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999;9(1)：42]
牙本质基质蛋白1(Dental Matrix Protein 1，DMP1)是牙本质基质非胶原蛋白的主要成员之一，为成牙本质细胞合成的磷酸化蛋白质。它不仅是成牙本质细胞重要的表面标记，而且在牙本质生物矿化中具有成核作用，调节矿化晶体的形态和生长速度，起着维持矿化组织的重要作用[1]。本文采用逆转录PCR方法，从合法引产胎儿切牙、尖牙和前磨牙牙乳头组织中克隆到DMP1 cDNA基因片段，并测定了其部分核苷酸序列。
1 材料和方法
本组所用9月龄胎儿为合法引产胎儿。无菌条件下暴露前磨牙部位，挑开牙龈组织，挖取乳切牙、乳尖牙和乳前磨牙[2，3]，立即置液氮中冻存，-70℃下长期保存。
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根据Hirst[4]等报道的人DMP1的cDNA序列，采用PC Gene 设计PCR扩增的两条引物。5'和3'端引物序列为：5'AAGAATTCTACGGAGGGTAGAGGTATCACACC3'，带有EcoRI酶切位点；3'端的引物序列为5'AAAGGATCCTGCAGATCCTTTCTTGCTTACTAGC3'，带有BamHI酶切识别序列。
载体质粒pBluescript KS(pBS)用 SmaI酶切消化，平端连接目的基因片段和酶切质粒载体。限制性内切酶均购自Promega公司。
逆转录PCR扩增、PCR产物的克隆、酶谱分析和核苷酸分析与郝建军的报道相同[5]。
2 结果
2.1 总RNA
异硫氰酸胍一步法提取的人牙乳头总RNA电泳(图1)，所获得的总RNA无明显的降解
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1.人牙胚组织总RNA
2.小鼠牙乳头组织总R
图1 人牙乳头组织总RNA琼脂糖凝胶电泳
2.2 RT-PCR
牙胚组织总RNA经RT-PCR扩增后，可见大小约1.8 kbp的特异扩增产物(图2)。
图2 PCR扩增产物DMP1和重组质粒pBS/DMP1酶切图谱琼脂糖凝胶电泳
1.λDNA/HindⅢ
2.阴性对照(未加重组质粒模板)
3.以重组质粒为模板的DMP1 PCR产物
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4.重组质粒pBS/DMP1
5.pBS/DMP1经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切
6.载体质粒pBS7.λDNA/PstⅠ 8.目的产物DMP19.阴性产物(未加模板)
2.3 pBS-DMP1克隆的酶谱分析
重质粒pBS-DMP1经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后为两条带(图2，第5道)，1.8 kbp的DMP1和2.96kbp的载体pBS。1.8 kbp的DMP1与 PCR的目的产物电泳条带(8和3道)平齐，2.96kbp的pBS与空载体pBS(6道)平齐。重组质粒pBS-DSP的酶切图谱与预期的完全一致。ApaI 酶切pBS-DMP1可获得1.4kbp和3.4kbp两条带，这与文献报道的人DMP1序列的酶切位点完全一致(图3)[4]。
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图3 重组质粒pBS-DMP1酶切图谱琼脂糖凝胶电泳
1 λDNA-PstⅠ
2,3 重组质粒pBS-DMP1经ApaI酶切
4,5 pBS-DMP1经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切
6 重组质粒pBS-DMP1
2.4 pBS-DMP1克隆的序列分析
DMP1成熟蛋白编码区基因克隆质粒pBS-DMP1部分核苷酸的测序结果，可读出的200个碱基序列与Hirst等[4]报道的结果完全相同。
3 讨论
DMP1是牙本质主要非胶原蛋白的一种，是磷酸化程度高、酸性较强的蛋白质之一。1993年George等[6]在用多抗筛选SD大鼠成牙本质细胞-牙髓成纤维细胞复合体文库时发现了一种新的牙本质基质酸性蛋白，名命为AG1。随后他们[7]又用地高辛标记的核酸探针研究AG1在小鼠染色体的定位，发现其基因位于5q21，与fgf 5紧密相连，为了符合目前染色体命名规则，AG1被更名为牙本质基质蛋白1(DMP1)。
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目前，已克隆了大鼠[6]、小鼠[8]、牛[9]和人[4]的DMP1 cDNA片段。人DMP1基因5'端有99bp的非翻译区(untranslated region, UTR)，由1539bp组成的单一开放读框，编码513个残基的强酸性蛋白，主要的三个氨基酸为丝氨酸、谷氨酸和天门冬氨酸，分别占21.4%，15.6%，12.1%。3'端有1041 bp的UTR，包括一个聚腺苷酸化信号。与人相比，牛DMP1基因序列的同一性和相似性分别为70.5%，82.5%，大鼠分别为66.2%，81.5%，小鼠为66.1%，80.5%。人、牛、小鼠和大鼠的DMP1基因有一些高度保守的区域，如疏水的16氨基酸残基信号肽，与细胞粘附有关的RGD三肽，数个可能是酪蛋白激酶I或II磷酸化位点的丝氨酸残基。人DMP1由6个外显子组成，为零型连接。第1外显子为78bp UTR，第2外显子为21bp UTR和16氨基酸残基构成的信号肽及N末端的2个氨基酸，第3、4和5外显子分别为48、33和48bp，第6外显子含有1320bp，包括编码的452个氨基酸、终止码和3'端UTR。DMP1的谷氨酸含量很高，组成上与OPN和BSP相似，其N未端序列与BAG-75和牙本质磷蛋白相似，提示DMP1的生物学特征介于骨和牙本质酸性磷蛋白之间。
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最近Hirst等[8]和MacDougall等[9]的报道对DMP1属于牙本质特异性蛋白提出质疑。Hirst等用含整个牛DMP1的1794bp 的酶切片段进行Zoo印迹分析，发现这段序列在人、猴、猪、羊和小鼠中为高度保守，但鸡的基因组DNA没有表达。用此片段作为探针进行Northern印迹显示，脑、成牙本质细胞和骨中约有3.0kb的杂交片段，其中表达水平最高的是脑，其次是成牙本质细胞和培养的长骨。胎牛脑中表达DMP1可能是一过性的，随着生长和发育DMP1在脑中消失，或表达减少。牛肝、皮肤和成釉细胞及颌骨中提取的mRNA没有检测到DMP1的表达。MacDougall等[9]通过原位杂交发现DMP1在小鼠体内的表达谱更广，不仅在成牙本质细胞中，而且在其它矿化组织如骨和牙骨质均有表达。因此，她们认为DMP1不是牙本质特异性蛋白，而应归属于矿化组织特异性蛋白之列。
尽管DMP1不是牙本质特异蛋白，但在牙本质的生物矿化过程中发挥着重要的作用，这主要是成牙本质细胞分泌的胶原蛋白提供了矿化所需的支架和空间，分泌的一组酸性蛋白(主要是牙本质磷蛋白或牙本质涎磷蛋白和DMP1)作为调节分子进入预先形成的结构基质中，在酸性蛋白与结构基质特异结合的位点上晶体生长的成核作用被启动，基质分子与晶体进一步作用可以调节晶体最终形成的大小和形态[10]。通过本实验，作者已克隆了人DMP1成熟肽编码区cDNA，现正在表达该成熟肽，这将为深入研究DMP1在牙本质矿化中的作用打下良好的基础。
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* 国家自然科学基金资助项目(39700160)；上海市博士后科研资助计划项目和中科院上海细胞所开放实验室资助课题
参考文献
1 郝建军.牙本质特异性蛋白的分子生物学研究进展.牙体牙髓牙周病学杂志,1998，8(4)：286
2 Hao Jianjun, Shi Junnan, Niu Zhongying et al. Mineralized nodules from human dental papilla cells in vitro. Eur J Oral Sci, 1997, 105(4):318
3 郝建军，汪平，史俊南.碱性成纤维细胞生长因子对体外大鼠牙胚分化的影响.牙体牙髓牙周病学杂志,1997,7(3):180
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4 Hirst KL, Simmons D, Feng J et al. Elucidation of the sequence and the genomic organization of the human dentin matrx acidic phosphoprotein 1 (DMP1) gene: Exclusion of the locus from a causative role in the pathogenesis of dentinogenesis imperfecta type II. Genomics, 1997,42:38
5 郝建军, 麻孙恺, 费俭 等. 小鼠牙本质涎蛋白成熟肽编码区cDNA克隆与部分序列分析. 牙体牙髓牙周病学杂志, 1999，9(1)：39
6 George A, SabsayB, Simonian PAL et al. Characterization of a novel dentin matrix acidic phosphoprotein. J Biol Chem, 1993,268:12624
, 百拇医药
7 George A, Gui J, Jenkins NA et al. In situ localization and chromosomal mapping of the AG1(DMP1) gene. J Histochem Cytochem, 1994,42:1527
8 Hirst KL, Ibaraki-O'Connor K, Young MF et al. Cloning and expression analysis of the bovine dentin matrix acidic phosphoprotein gene. J Dent Res, 1997,76(3):754
9 MacDougall M, Gu TT, Simmons D et al. Charactrization of a novel isoform of dentin matrix protein 1: Spatial expression pattern in mineralization tissues. J Bone Miner Res, 1998，13(3)：422
10 Furedi-Mihofer H, Moradian-Oldak J, Weiner S et al. Interactions of matrix proteins from mineralized tissues with ocracalcium phosphate. Connect Tissue Res, 1994,30:251
收稿日期：1998-09-09
修回日期：1998-12-20
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