胰岛素样生长因子-Ⅰ和骨形态发生蛋白-2对人牙周膜细胞增殖的作用*
作者：刘 宏 吴织芬 王勤涛
单位：第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：牙周膜细胞；细胞培养；胰岛素样生长因子；骨形态发生蛋白
牙体牙髓牙周病学杂志CHINESE JOURNAL OF CONSERVATIVE DENTISTRY1999年 第9卷 第1期 Vol 摘要 目的：重组人胰岛素样生长因子-I(rhIGF-I)、重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)分别或联合应用对人牙周膜(PDL)细胞增殖的影响。方法：采用组织块法体外培养人PDL细胞，MTT法测定PDL细胞在不同生长因子刺激下的增殖情况。结果：rhIGF-I 、rhBMP-2都可促进人PDL细胞的增殖，这种促增殖作用呈一定的浓度依赖性， rhIGF-I与rhBMP-2联合应用对人PDL细胞的增殖有协同作用，且与单独应用相比相差显著。结论：rhIGF-I、rhBMP-2可望作为牙周再生的生物活性介质，rhIGF-I与rhBMP-2联合应用对PDL细胞的促增殖作用更强。
, 百拇医药
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0031-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(1)：31]
Effect of recombinant human Insulin-like growth factor-I and
recombinant human bone morphogenetic protein-2 on
proliferation of human periodontal ligament cells
Liu Hong, Wu Zhifen, Wang Qintao
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
, 百拇医药
Abstract Aim: To study the effect of recombinant human Insulin-like growth factor-I and recombinant human bone morphogenetic protein-2 on human periodontal ligament cells proliferation. Methods: Human periodontal ligament cells were cultured by tissue explant and its proliferation were mesured by MTT colorimetric assay. Results: rhIGF-I or rhBMP-2 can stimulate human PDL cells proliferation in dose-dependent manner. The co-ordinate use of rhIGF-I and rhBMP-2 has synergetic effect on PDL cells proliferation. Conclusions: rhIGF-I and rhBMP-2 can be used as bioactive mediator on periodontal regeneration.
, 百拇医药
Key Word periodontal ligament cells；cell culture；recombinant human insulin-like growth factor-I；recombinant human bone morphogenetic protein-2
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(1):31]
多肽生长因子是一类天然存在的生物活性介质，在组织修复过程中调节一系列关键的细胞活动：如增殖、趋化、分化和通过结合于细胞表面受体而致基质的合成等[1]，这类分子几乎对于所有组织损伤的修复都有效，Howard Howell等[2]将重组人血小板衍化生长因子(recombinant human platelet-derived growth factor, rhPDGF)和重组人胰岛素样生长因子(recombinant human insulin-like growth factor-I，rhIGF-I)联合应用治疗根分叉病变取得了良好的效果。本研究旨在探讨rhIGF-I、rhBMP-2单独或联合应用对体外培养人牙周膜细胞增殖的作用，为进一步研究rhIGF-I、rhBMP-2联合应用于牙周再生治疗进行初步的探讨。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
DMEM培养液(Gibco USA); 胎牛血清(FCS,浙江金华清湖犊牛利用研究所)；rhIGF-I(Boehringer Mannhein, German); rhBMP-2(本校生化教研室蒲勤博士惠赠);四唑盐(MTT，Sigma,USA); 二甲基亚砜(DMSO,西安化学试剂厂)。
1.2 方法
1.2.1 牙周膜细胞的培养[3]
取因阻生或正畸拔除的牙周组织健康的牙齿，用无血清DMEM培养液冲洗3遍后，刮取其根中1/3牙周膜，剪成1mm3大小组织块，均匀铺于25ml培养瓶底，翻转瓶底向上，加入4ml含150ml/L灭活FCS、100mg/L链霉素、106U/L青霉素的培养液，置37℃，50ml/L CO2，950ml/L空气条件下孵育2h，待组织块贴牢瓶底后，轻轻翻转培养瓶，继续培养,每3天换液1次，直至细胞从组织块周围游出。传代，取第4～6代细胞进行实验。
, 百拇医药
1.2.2 对牙周膜细胞增殖的影响
将生长良好的第5代牙周膜细胞以浓度3×107/L接种于96孔板，每孔100μl,培养液为含150ml/L FCS的DMEM培养液，培养24h后，弃孔内液体和未贴壁细胞，无血清培养液洗3遍，实验组以含20ml/L FCS的DMEM稀释不同浓度的rhIGF-I、rhBMP-2、rhIGF-I+rhBMP-2的生长因子加入孔内，阴性对照只加入含20ml/L FCS的培养液，每组4孔，连续培养72h后，每孔加入20μl MTT，继续孵育4h，弃孔内液体，每孔加入150μl DMSO，充分振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上，测490nm波长处的吸光度值(A值)[4]。
2 结果 (表1，2)
表1 rhIGF-I、rhBMP-2对人PDL细胞增殖的作用 分组
, 百拇医药
剂量(μg/L)
A值
PI(增加百分率)
对照
0
0.51±0.07
0
rhIGF-I
3.125
0.65±0.08*
27.5
6.25
, 百拇医药
0.82±0.07**
60.8
12.5
0.89±0.15**
74.5
25
0.93±0.24**
82.4
rhBMP-2
25
0.60±0.09
17.6
, http://www.100md.com
50
0.64±0.07*
25.5
100
0.70±0.13*
37.2
200
0.71±0.07*
39.2
400
0.70±0.17
37.2
, 百拇医药
与对照组相比：* P<0.05, ** P<0.01表2 rhIGF-I、rhBMP-2联合应用对人PDL细胞增殖的作用 分 组
A值
PI
rhIGF-I(3.125μg/L)
0.65±0.08
27.5
rhBMP-2(50μg/L)
0.64±0.07
25.5
rhIGF-I(3.125μg/L)+rhBMP-2(50μg/L)
, http://www.100md.com
0.92±0.18*△
80.4
*与rhBMP-2相比P<0.05 , △ 与rhIGF-ⅠP<0.05
3 讨论
牙周组织再生过程能否顺利进行，关键就在于牙周膜细胞的增殖及分化。IGF分为IGF-I和IGF-II，IGF-I对多种细胞的生长和分化有促进作用。有实验表明IGF-I对人PDL细胞的有丝分裂有作用[5]，本组也证明了rhIGF-I对人PDL细胞有促增殖作用，在25μg/L时增加百分率可达82.4% ，促增殖效果呈一定的浓度依赖性。对于牙周组织再生治疗，关键在于刺激剩余牙周膜细胞的增殖，使其活性提高，本组表明IGF-I就具有这种作用。
BMP对人PDL细胞代谢方面的研究较少，有实验表明BMP-7(即osteogenic protein-1,OP-1)在200μg/L时对人PDL细胞的有丝分裂无作用[6]。王勤涛等[7]用提取的牛BMP作用于人PDL细胞，表明对其有促增殖作用，本组用基因重组人BMP-2进行实验，结果显示rhBMP-2可促进人PDL细胞的增殖，但作用相对较弱，200μg/L时增加百分率仅39.2% 。
, 百拇医药
牙周组织再生过程由于不仅有软组织的再生，更需要硬组织的恢复，而不同生长因子其生物学作用各异，有报告将PDGF与IGF-I联合用于牙周再生治疗[8]，也有将IGF-I与TGF-β联合应用作用于人PDL细胞的报告[9，10]。IGF-I是一种用于牙周再生的较好的活性介质，而BMP是作用于骨再生的重要因子，由于两者生物学作用的差异，单独应用只能显示各自的生物学作用。本组将IGF-I与BMP-2联合应用，显示其效果并非简单的各自促增殖作用的叠加，而是具有促增殖的协同作用，说明两者具有良好的生物相容性，可望作为牙周再生研究的生物活性介质，进一步探讨对人PDL细胞不同功能的影响。
* 国家自然科学基金资助项目(39700035)
参考文献
1 The American Academy of Periodontology. The potential role of growth and differentiation factors in periodontal regeneration (position paper). J Periodontol , 1996, 67(5) :545
, http://www.100md.com
2 Howard Howell T, Fiorellini JP, Paquette DW et al.A phase I/II clinical trial to evaluate a combination of human platelet-derived growth factor-BB and reconbination human insulin-like growth factor-I in patients with periodontal disease . J Periodontal, 1997,68:1186
3 Somerman MJ, Archer SY, Imm GR et al. A comparative study of human periodontal ligament cells and gingival fibroblasts in vitro. J Dent Res, 1988, 67(1):66
4 司徒镇强，吴军正. 细胞培养. 西安：世界图书出版社 1996.186
, 百拇医药
5 Haase HR, Clarkson RW, Waters MJ et al. Growth factor modulation of mitogenic responses and proteoglycan synthesis by human periodontal fibroblasts. J Cell Physiol, 1998, 174(3): 353
6 Lee MB. Bone morphogenetic proteins: background and implications for oral reconstruction. J Clin Periodontol,1997,24(6):355
7 王勤涛，史俊南，吴织芬等. 骨形成蛋白对牙周膜细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响. 牙体牙髓牙周病学杂志, 1996,6(3)：153
8 Rutherford RV, Niekrash CE, Kennedy JE et al. Platelet-derived and insulin-like growth factors stimulate regeneration of periodontal attachment in monkeys. J Periodont Res, 1992, 27(4pt1):285
, 百拇医药
9 Oates TW, Rouse CA, Cochran DL. Mitogenic effects of growth factors on human periodontal ligament cells in vitro. J Periodontal, 1993, 64(3):142
10 Di-Genio M, Barone A, Ramaglia L et al. Periodontal regeneration: the use of polypeptide growth factors. Minerva Stomatol, 1994, 43(10):437
收稿日期：1998-09-24, 百拇医药
单位：第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：牙周膜细胞；细胞培养；胰岛素样生长因子；骨形态发生蛋白
牙体牙髓牙周病学杂志CHINESE JOURNAL OF CONSERVATIVE DENTISTRY1999年 第9卷 第1期 Vol 摘要 目的：重组人胰岛素样生长因子-I(rhIGF-I)、重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)分别或联合应用对人牙周膜(PDL)细胞增殖的影响。方法：采用组织块法体外培养人PDL细胞，MTT法测定PDL细胞在不同生长因子刺激下的增殖情况。结果：rhIGF-I 、rhBMP-2都可促进人PDL细胞的增殖，这种促增殖作用呈一定的浓度依赖性， rhIGF-I与rhBMP-2联合应用对人PDL细胞的增殖有协同作用，且与单独应用相比相差显著。结论：rhIGF-I、rhBMP-2可望作为牙周再生的生物活性介质，rhIGF-I与rhBMP-2联合应用对PDL细胞的促增殖作用更强。
, 百拇医药
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0031-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(1)：31]
Effect of recombinant human Insulin-like growth factor-I and
recombinant human bone morphogenetic protein-2 on
proliferation of human periodontal ligament cells
Liu Hong, Wu Zhifen, Wang Qintao
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
, 百拇医药
Abstract Aim: To study the effect of recombinant human Insulin-like growth factor-I and recombinant human bone morphogenetic protein-2 on human periodontal ligament cells proliferation. Methods: Human periodontal ligament cells were cultured by tissue explant and its proliferation were mesured by MTT colorimetric assay. Results: rhIGF-I or rhBMP-2 can stimulate human PDL cells proliferation in dose-dependent manner. The co-ordinate use of rhIGF-I and rhBMP-2 has synergetic effect on PDL cells proliferation. Conclusions: rhIGF-I and rhBMP-2 can be used as bioactive mediator on periodontal regeneration.
, 百拇医药
Key Word periodontal ligament cells；cell culture；recombinant human insulin-like growth factor-I；recombinant human bone morphogenetic protein-2
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(1):31]
多肽生长因子是一类天然存在的生物活性介质，在组织修复过程中调节一系列关键的细胞活动：如增殖、趋化、分化和通过结合于细胞表面受体而致基质的合成等[1]，这类分子几乎对于所有组织损伤的修复都有效，Howard Howell等[2]将重组人血小板衍化生长因子(recombinant human platelet-derived growth factor, rhPDGF)和重组人胰岛素样生长因子(recombinant human insulin-like growth factor-I，rhIGF-I)联合应用治疗根分叉病变取得了良好的效果。本研究旨在探讨rhIGF-I、rhBMP-2单独或联合应用对体外培养人牙周膜细胞增殖的作用，为进一步研究rhIGF-I、rhBMP-2联合应用于牙周再生治疗进行初步的探讨。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
DMEM培养液(Gibco USA); 胎牛血清(FCS,浙江金华清湖犊牛利用研究所)；rhIGF-I(Boehringer Mannhein, German); rhBMP-2(本校生化教研室蒲勤博士惠赠);四唑盐(MTT，Sigma,USA); 二甲基亚砜(DMSO,西安化学试剂厂)。
1.2 方法
1.2.1 牙周膜细胞的培养[3]
取因阻生或正畸拔除的牙周组织健康的牙齿，用无血清DMEM培养液冲洗3遍后，刮取其根中1/3牙周膜，剪成1mm3大小组织块，均匀铺于25ml培养瓶底，翻转瓶底向上，加入4ml含150ml/L灭活FCS、100mg/L链霉素、106U/L青霉素的培养液，置37℃，50ml/L CO2，950ml/L空气条件下孵育2h，待组织块贴牢瓶底后，轻轻翻转培养瓶，继续培养,每3天换液1次，直至细胞从组织块周围游出。传代，取第4～6代细胞进行实验。
, 百拇医药
1.2.2 对牙周膜细胞增殖的影响
将生长良好的第5代牙周膜细胞以浓度3×107/L接种于96孔板，每孔100μl,培养液为含150ml/L FCS的DMEM培养液，培养24h后，弃孔内液体和未贴壁细胞，无血清培养液洗3遍，实验组以含20ml/L FCS的DMEM稀释不同浓度的rhIGF-I、rhBMP-2、rhIGF-I+rhBMP-2的生长因子加入孔内，阴性对照只加入含20ml/L FCS的培养液，每组4孔，连续培养72h后，每孔加入20μl MTT，继续孵育4h，弃孔内液体，每孔加入150μl DMSO，充分振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上，测490nm波长处的吸光度值(A值)[4]。
2 结果 (表1，2)
表1 rhIGF-I、rhBMP-2对人PDL细胞增殖的作用 分组
, 百拇医药
剂量(μg/L)
A值
PI(增加百分率)
对照
0
0.51±0.07
0
rhIGF-I
3.125
0.65±0.08*
27.5
6.25
, 百拇医药
0.82±0.07**
60.8
12.5
0.89±0.15**
74.5
25
0.93±0.24**
82.4
rhBMP-2
25
0.60±0.09
17.6
, http://www.100md.com
50
0.64±0.07*
25.5
100
0.70±0.13*
37.2
200
0.71±0.07*
39.2
400
0.70±0.17
37.2
, 百拇医药
与对照组相比：* P<0.05, ** P<0.01表2 rhIGF-I、rhBMP-2联合应用对人PDL细胞增殖的作用 分 组
A值
PI
rhIGF-I(3.125μg/L)
0.65±0.08
27.5
rhBMP-2(50μg/L)
0.64±0.07
25.5
rhIGF-I(3.125μg/L)+rhBMP-2(50μg/L)
, http://www.100md.com
0.92±0.18*△
80.4
*与rhBMP-2相比P<0.05 , △ 与rhIGF-ⅠP<0.05
3 讨论
牙周组织再生过程能否顺利进行，关键就在于牙周膜细胞的增殖及分化。IGF分为IGF-I和IGF-II，IGF-I对多种细胞的生长和分化有促进作用。有实验表明IGF-I对人PDL细胞的有丝分裂有作用[5]，本组也证明了rhIGF-I对人PDL细胞有促增殖作用，在25μg/L时增加百分率可达82.4% ，促增殖效果呈一定的浓度依赖性。对于牙周组织再生治疗，关键在于刺激剩余牙周膜细胞的增殖，使其活性提高，本组表明IGF-I就具有这种作用。
BMP对人PDL细胞代谢方面的研究较少，有实验表明BMP-7(即osteogenic protein-1,OP-1)在200μg/L时对人PDL细胞的有丝分裂无作用[6]。王勤涛等[7]用提取的牛BMP作用于人PDL细胞，表明对其有促增殖作用，本组用基因重组人BMP-2进行实验，结果显示rhBMP-2可促进人PDL细胞的增殖，但作用相对较弱，200μg/L时增加百分率仅39.2% 。
, 百拇医药
牙周组织再生过程由于不仅有软组织的再生，更需要硬组织的恢复，而不同生长因子其生物学作用各异，有报告将PDGF与IGF-I联合用于牙周再生治疗[8]，也有将IGF-I与TGF-β联合应用作用于人PDL细胞的报告[9，10]。IGF-I是一种用于牙周再生的较好的活性介质，而BMP是作用于骨再生的重要因子，由于两者生物学作用的差异，单独应用只能显示各自的生物学作用。本组将IGF-I与BMP-2联合应用，显示其效果并非简单的各自促增殖作用的叠加，而是具有促增殖的协同作用，说明两者具有良好的生物相容性，可望作为牙周再生研究的生物活性介质，进一步探讨对人PDL细胞不同功能的影响。
* 国家自然科学基金资助项目(39700035)
参考文献
1 The American Academy of Periodontology. The potential role of growth and differentiation factors in periodontal regeneration (position paper). J Periodontol , 1996, 67(5) :545
, http://www.100md.com
2 Howard Howell T, Fiorellini JP, Paquette DW et al.A phase I/II clinical trial to evaluate a combination of human platelet-derived growth factor-BB and reconbination human insulin-like growth factor-I in patients with periodontal disease . J Periodontal, 1997,68:1186
3 Somerman MJ, Archer SY, Imm GR et al. A comparative study of human periodontal ligament cells and gingival fibroblasts in vitro. J Dent Res, 1988, 67(1):66
4 司徒镇强，吴军正. 细胞培养. 西安：世界图书出版社 1996.186
, 百拇医药
5 Haase HR, Clarkson RW, Waters MJ et al. Growth factor modulation of mitogenic responses and proteoglycan synthesis by human periodontal fibroblasts. J Cell Physiol, 1998, 174(3): 353
6 Lee MB. Bone morphogenetic proteins: background and implications for oral reconstruction. J Clin Periodontol,1997,24(6):355
7 王勤涛，史俊南，吴织芬等. 骨形成蛋白对牙周膜细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响. 牙体牙髓牙周病学杂志, 1996,6(3)：153
8 Rutherford RV, Niekrash CE, Kennedy JE et al. Platelet-derived and insulin-like growth factors stimulate regeneration of periodontal attachment in monkeys. J Periodont Res, 1992, 27(4pt1):285
, 百拇医药
9 Oates TW, Rouse CA, Cochran DL. Mitogenic effects of growth factors on human periodontal ligament cells in vitro. J Periodontal, 1993, 64(3):142
10 Di-Genio M, Barone A, Ramaglia L et al. Periodontal regeneration: the use of polypeptide growth factors. Minerva Stomatol, 1994, 43(10):437
收稿日期：1998-09-24, 百拇医药