大鼠牙髓伤害性刺激诱导延髓内Fos表
作者：徐默菡 牛忠英 饶志仁 倪龙兴 王 凌
单位：第四军医大学口腔医学院全军神经科学研究所 陕西 西安 710032
关键词：Fos蛋白；酪氨酸羟化酶；牙髓伤害性刺激；延髓；大鼠
大鼠牙髓伤害性刺激诱导延髓内Fos表 摘要 目的：研究牙髓伤害性信息在延髓传入的相关部位。方法：用抗Fos 蛋白的免疫组织化学方法，对大鼠牙齿机械穿髓后诱导的延髓内Fos表达部位进行了观察。同时结合酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化方法，观察FOS阳性神经元与TH阳性神经元的关系。结果：Fos样免疫反应神经元主要分布在同侧三叉神经脊束核尾侧亚核(Vc) 、双侧延髓内脏带(孤束核、腹外侧区及二者之间的网状结构)。在抗Fos 和抗酪氨酸羟化酶的双重免疫染色切片上，见到延髓内脏带内许多Fos阳性神经元的胞浆同时呈TH样免疫反应(Fos-TH双重阳性细胞)。结论：三叉神经脊束核尾侧亚核在牙髓伤害性信息传递过程中具有重要作用；延髓内脏带可能参与了调控牙髓暴露所致的疼痛应激反应。
, 百拇医药
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0027-04
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(1)：27]
Noxious dental pulp stimulation induced Fos expression
in the medulla oblongata of the rat
Xu Mohan, Niu Zhongying, Rao Zhiren et al
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aim:To assess the related position of noxious dental pulp sensory input in medulla oblongata, and to discuss the relationship with catecholaminergic neurons. Methods: By using immunocytochemical staining for Fos and tyrosine hydroxylase(TH), the Fos expression and its relationship with catecholaminergic neurons were examined in the medulla oblongata of the rat following received mechanical exposing dental pulp. Results: The Fos-like immunoreactive neurons distributed mainly in the spinal trigeminal subnucleus caudalis(Vc)ipsilaterally and medullary visceral zone (MVZ,including nucleus tractus solitarius,ventrolateral medulla and the reticular formation between the first two),ln the sections processed for double staining of Fos and TH immunohisto chemistry, numerous Fos-LI neurons showed also TH- like immunoreactivity in their cytoplasm(Fos-TH cells)in MVZ. Conclusions: The present study suggested that Vc had an important role on the transmission of noxious dental pulp information, and MVZ may be involved in mediating response to stress from noxious stimulation of dental pulp exposure.
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Key word Fos protein；tyrosine hydroxylase；noxious dental pulp stimulation；medulla oblongata；rat
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(1):27]
牙痛是口腔疾病中最常见的临床症状，是一个复杂的病理生理及心理过程。关于牙痛的中枢传导途径及调控机制，目前尚不清楚。有研究认为三叉神经脊束核是牙齿伤害性信息传入延髓的部位[1]。但这不能解释患者在罹患牙痛的同时常常出现的呼吸、心跳、血压、情绪等变化。延髓内脏带是九十年代提出的延髓内与内脏感觉、应激反应、呼吸、心血管调节等有关的一个新的机能结构区，儿茶酚胺能神经元是它的主要功能神经元[2]。近年来研究发现外周伤害性刺激可诱导中枢有关的神经元表达Fos蛋白，Fos是神经元被刺激激活的标志[3]。本研究采用显示Fos的免疫组化方法，对大鼠机械穿髓所致的疼痛诱导的延髓内Fos表达阳性神经元的分布进行了观察，探讨延髓内与牙痛传入相关部位的可能作用。同时结合酪氨酸羟化酶(儿茶酚胺的代表物，TH)免疫组化方法，探讨延髓儿茶酚胺能神经元与Fos表达的关系， 以期为牙痛的中枢机制研究在延髓部位提供较为全面的形态学上的依据。
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1 材料和方法
成年SD雄性大鼠10只，体重200～250g。术前将动物置于安静的环境饲养 24h以上。随机分为实验组(n=6)，手术操作对照组(n=2)，正常对照组(n=2)。
1.1 实验组
1.1.1 机械穿髓动物模型的制作[4]
大鼠先用乙醚诱导麻醉，再腹腔注射4g/L戊巴比妥钠(每100g体重1ml)。 动物麻醉平稳后，于右上颌第一磨牙面用高速涡轮机开髓至点状露髓。术毕将动物送回与术前相同的环境存活2h。
1.1.2 切片制备
动物在过量戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下开胸， 经升主动脉插管，先用100ml生理盐水冲去血液，继之灌注含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L 磷酸缓冲液(PB，pH=7.4)400ml。注毕立即取延髓置于200g/L蔗糖溶液内浸泡过夜(4℃)。冰冻连续切片，片厚30μm，置0.01mol/L PBS内。
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1.1.3 Fos免疫组化反应(ABC法)
①切片首先放入含3ml/LH2O2的甲醇液中室温下30min。②置入含3g/L TritonX-100的PBS中，室温30min。③置入兔抗Fos血清(1:3000，Sigma，用小牛血清稀释液稀释)，4℃孵育48h。④置入生物素标记的羊抗兔IgG(1:500，Vector)，室温孵育2～4h。⑤入ABC复合物( 1:500，Vector)，室温孵育2～4h。上述每一步骤后均用0.01mol/L PBS洗切片3次， 每次10min。最后用葡萄糖-DAB-硫酸镍铵法呈色，室温下反应10～15min。反应后的切片分为两套，一套经裱片、晾干、脱水、透明、封片即可观察。另一套继续进行以下TH免疫组化反应。
1.1.4 TH免疫组化反应(ABC法)
①入小鼠抗TH血清单克隆抗体(Sigma)，4℃孵育48h。②入羊抗鼠IgG(1:500，Vector)，4℃ 24h。③入ABC复合物(1:500，Vector)，4℃ 24h。④DAB呈色。切片经裱片、晾干、脱水、透明、封片，即可观察。
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1.2 对照组
1.2.1 手术操作对照组(n=2)：动物经与实验组相同的麻醉过程后，不做机械穿髓，只空开涡轮机，使刺激环境及其余过程与处理组同，以观察非牙髓刺激引起的延髓Fos表达。存活2h后按1.1.2方法处理。
1.2.2 正常对照组(n=2)：正常大鼠按1.1.2方法处死，作Fos免疫组化反应，以观察正常状态下延髓的Fos表达。
1.2.3 免疫反应染色对照：取实验组大鼠延髓切片，用牛血清稀释液代替Fos一抗、TH一抗作孵育，其余步骤同1.1.3，用以检查Fos和TH免疫组化反应的特异性。
1.3 计数定量方法
采用简单的累加计数方法，胞核呈蓝黑色的神经元为Fos免疫反应阳性神经元，胞浆棕色神经元为TH免疫反应阳性神经元，胞浆棕色同时胞核蓝黑色者为 Fos-TH 双标神经元， 以上三种神经元各自计数， 然后即可得出Fos-TH双标神经元占TH阳性神经元的比例。
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2 结果
2.1 实验组
Fos样免疫反应阳性神经元的细胞核呈蓝黑色，胞浆不着色。 Fos阳性神经元主要出现在同侧的尾侧亚核和双侧孤束核、腹外侧核及中间网状结构(延髓内脏带，MVZ)。尾侧亚核Fos阳性神经元主要分布在该核的背侧Ⅰ、Ⅱ层及腹外侧，背侧浅层较浓密，腹外侧稀疏。同侧极间亚核、吻侧亚核、感觉主核未见Fos阳性神经元。对侧尾侧亚核偶见Fos阳性神经元。延髓内脏带内Fos 阳性神经元以孤束核和腹外侧核的分布较密集，中间网状结构内较稀疏。
TH免疫反应阳性神经元的胞浆呈均匀棕色，主要见于双侧孤束核及腹外侧核。在Fos、TH免疫组化双重染色的切片上，见到Fos阳性、TH阳性和Fos-TH双重阳性三种细胞。前二者的镜下特点已述及。Fos-TH双标细胞的胞核为黑色，胞浆呈均匀棕色，主要分布于双侧孤束核和腹外侧核。计数一例动物的15张延髓切片，见到TH标记细胞751个(TH阳性细胞+FOS-TH双标细胞)，Fos-TH双标细胞129个，双标细胞数约占TH标记细胞数的17.2%(图1、2、3)。
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图1 实验组大鼠延髓内三种阳性细胞的分布模式图
● Fos阳性细胞 ■TH阳性细胞 ▲Fos-TH阳性细胞 (每个符号代表3～5个细胞)
+0.8mm闩头侧0.8mm平面 obex闩平面 -0.3mm闩尾侧0.3mm平面 -1.0mm闩尾侧1.0mm平面NTS孤束核 dmnx迷走神经背核 nVL腹外侧网状核 nⅫ舌下神经核 PY锥体束 Sp5I三叉神经脊束核极间亚核PYX锥体交叉 LRt外侧网状核 Sp5C三叉神经脊束核尾侧亚核
图2 孤束核内Fos阳性细胞(↑)、TH 图3 腹外侧核内Fos阳性细胞(↑)、TH阳性细
, http://www.100md.com 阳性细胞(
)、Fos/TH双重阳性细胞(△) 胞()、Fos-TH双重阳性细胞(△)
2.2 对照组
手术操作对照组在同侧尾侧亚核的腹外侧浅层见到少量Fos阳性细胞(平均5～10个)，估计与术中牵拉同侧口角有关；双侧孤束核内可见Fos阳性细胞，数量较实验组明显少(平均10～15个)，估计与涡轮机开动的声音刺激导致大鼠产生一定程度的应激反应有关(图4)。 正常对照组未见延髓切片上出现Fos阳性细胞。免疫反应对照组切片上未见Fos、TH阳性细胞。
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图4 手术操作对照组延髓内Fos免疫反应阳性细胞分布模式图(● Fos阳性细胞)
3 讨论
3.1 延髓内Fos表达的特点和意义
c-fos原癌基因是一种即刻-早期基因[5]。当细胞受到刺激后，其胞核内的该基因可被激活，转录的mRNA由胞核进入胞浆，并在胞浆翻译和合成Fos蛋白(简称Fos)。Fos与另一即刻-早期基因c-jun所产生的蛋白Jun 迅速转移到胞核内，形成异源二聚体。该复合物以很高的亲和力结合到DNA链上的AP-1结合位点， 进一步调节其靶基因的转录，从而将短期刺激与细胞的长期效应耦联起来。因此，Fos又可被视为第三信使。Fos的显示可作为接受一定刺激的神经元功能活动的标志，是近年来被广泛采用的一种中枢神经系统功能解剖学研究方法之一[3]。
本组结果表明，牙髓伤害性刺激所诱导的延髓内Fos 表达具有如下特点：Fos阳性神经元主要集中分布在同侧三叉神经脊束核尾侧亚核的背侧浅层、 双侧孤束核及腹外侧网状核。前者的分布与以往的报道一致[6，7]， 且与追踪及电生理研究在Vc内的结果基本相同[1，8]，说明Vc内Fos的表达是对牙髓伤害性信息初级传入的直接反应。而孤束核和腹外侧网状核内由牙髓刺激引起的Fos 表达还未见报道。形态学追踪研究表明三叉神经的某些分支，其传入纤维既可直接终止于孤束核，又可经间质核的介导后向孤束核传入[9，10]。因此孤束核内的Fos阳性神经元可能是对经这两种途径传入的伤害性信息的反应。腹外侧网状核是心血管与呼吸运动神经元的分布区，Kabashi[11] 等证明孤束核的神经元向腹外侧网状核发出轴突投射，提示腹外侧核Fos 表达可能是通过孤束核间接获得牙髓伤害性信息的反应。
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延髓迷走孤束复合体、腹外侧核及两者之间的网状结构( “延髓内脏带”，MVZ)，既与内脏感觉的传递有关，也是心血管、内脏活动、呼吸调节及参与伤害性刺激感受和调节应激反应的重要中枢之一[2，12]。牙齿在非局麻状态下备洞、充填或拔除过程中，患者血浆中的皮质醇浓度，血、尿中的儿茶酚胺浓度明显升高，收缩压、舒张压均上升，心率加快，心搏出量增大，血管床收缩，出现一系列交感神经兴奋的症状，这是机体对牙齿伤害性刺激产生的应激反应[13]。实验中大鼠清醒后时有烦躁、胡须抖动明显等行为改变，这是应激反应的外在表现。本组首次报道刺激牙髓后在中枢延髓内脏带内出现Fos表达， 可能为以上这些应激反应提供了中枢的形态学依据。
3.2 延髓儿茶酚胺能神经元与Fos表达的关系
儿茶酚胺能神经元是延髓内脏带内的主要功能性神经元。本组显示了延髓儿茶酚胺能神经元(以TH作为标记物)的分布，结果与以往的报道一致[14]，多集中分布在孤束核和腹外侧核，少数散在分布于中间网状结构。儿茶酚胺能神经元与内脏活动和应激反应的调节关系密切。本组采用Fos和TH免疫组化双重染色，结果证明“延髓内脏带”内许多Fos阳性神经元同时呈 TH 阳性。 细胞计数表明Fos-TH双重阳性细胞占TH标记细胞总数的17.2%，从而说明延髓内儿茶酚胺能神经元中的约17.2%参与牙髓伤害性刺激的反应。
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本组结果表明，牙髓机械损伤性刺激诱导的延髓Fos 表达部位不仅在与面口部痛传递密切相关的三叉神经脊束核尾侧亚核背侧浅层，还位于与内脏感觉、呼吸、心血管、应激反应等的调节有关的延髓内脏带，且约有17.2%的延髓儿茶酚胺能神经元参与牙髓机械损伤刺激的反应。提示Vc浅层可能是牙髓伤害性信息初级传入的主要到达部位；延髓内脏带可能参与调控牙髓伤害性刺激引起的应激反应。这为进一步认识和解释临床上与患者牙痛症状相伴而来的呼吸、心率、血压、情绪等变化提供了较为全面的中枢形态学的依据
参考文献
1 Marfurt CF, Turner DF. The cental projections of tooth pulp afferent neurons in the rat as determined by the transganglionic transport of horseradish peroxidase. J Comp Neurol,1984，223:535
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2 饶志仁.延髓内脏带——新的机能结构区. 中国学术期刊文摘,1995，(增刊):43
3 Bullitt E. Expression of c-fos-like protein as marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol, 1990，296(4):517
4 朱美玲.SP、CGRP、NO在牙齿损伤性感受过程及TENS镇痛中的作用: [学位论文]. 西安：第四军医大学口腔医学院,1998
5 张遐,鞠躬.c-fos癌基因的诱导和显示——一种反映神经功能通路的新方法.生理科学进展, 1991，22(4):299
6 Wakisaka S,Sasaki Y, Ichikawa H et al. lncrease in c-fos-like immunoreactivity in the trigeminal nucleus complex after dental treatment. Proc Finn Dent Soc,1992，88 (suppl) 1:551
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7 Coimbra F, Coimbra A. Dental noxious input reaches the subnucleus caudalis of the trigeminal complex in the rat, as shown by c- fos expression upon thermal or mechanical stimualtion. Neurosic lett, 1994，173:201
8 Dong WK, Chudler EH, Kawakami Y. Tooth pulp- evoked potentials in the trigeminal brainstem nuclear complex. Brain Res,1990,529:131
9 张文斌,李继硕,李惠民.三叉神经初级传入与孤束核的联系——HRP跨越神经节追踪研究. 神经解剖学杂志,1990，6(1):97
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10 张文斌,李继硕,李惠民.三叉神经躯体传入成分向孤束核投射的间接途径——HRP跨节和逆行追踪技术的光镜与电镜研究.解剖学报,1992，23(3):253
11 Kabashi M, Adachi A. A hepatoportal osmoreceptor afferent projection from nucleus tractus solitaius to caudal ventrolateral medulla. Brain Res Bull,1990，24(6):775
12 Li T, Gao W, Rao ZR. Noxious somatic stimulation- induced expression of Fos- like immunoreactivity in catecholaminergic neurons with habenular nucleus projection in the medullary visceral zone of rat. Brain Res, 1998,783:51
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13 Brand HS, Gortzak RATh, Palmer Bouva CCR et al. Cardiovascular and neruoendocrine responses during acute stress induced by different types of dental treatment .Inter Dent J, 1995,45:45
14 Kalia M, Fuxe K, Goldstein M. Rat medulla oblongata.Ⅱ.Dopaminergic Noradrenergic (A1 and A2) and adrenergic neurons, nerve fibers and presumptive terminal processes. J Comp Neurol, 1985,233(3):308
收稿日期：1998-07-23
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单位：第四军医大学口腔医学院全军神经科学研究所 陕西 西安 710032
关键词：Fos蛋白；酪氨酸羟化酶；牙髓伤害性刺激；延髓；大鼠
大鼠牙髓伤害性刺激诱导延髓内Fos表 摘要 目的：研究牙髓伤害性信息在延髓传入的相关部位。方法：用抗Fos 蛋白的免疫组织化学方法，对大鼠牙齿机械穿髓后诱导的延髓内Fos表达部位进行了观察。同时结合酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化方法，观察FOS阳性神经元与TH阳性神经元的关系。结果：Fos样免疫反应神经元主要分布在同侧三叉神经脊束核尾侧亚核(Vc) 、双侧延髓内脏带(孤束核、腹外侧区及二者之间的网状结构)。在抗Fos 和抗酪氨酸羟化酶的双重免疫染色切片上，见到延髓内脏带内许多Fos阳性神经元的胞浆同时呈TH样免疫反应(Fos-TH双重阳性细胞)。结论：三叉神经脊束核尾侧亚核在牙髓伤害性信息传递过程中具有重要作用；延髓内脏带可能参与了调控牙髓暴露所致的疼痛应激反应。
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中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0027-04
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(1)：27]
Noxious dental pulp stimulation induced Fos expression
in the medulla oblongata of the rat
Xu Mohan, Niu Zhongying, Rao Zhiren et al
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aim:To assess the related position of noxious dental pulp sensory input in medulla oblongata, and to discuss the relationship with catecholaminergic neurons. Methods: By using immunocytochemical staining for Fos and tyrosine hydroxylase(TH), the Fos expression and its relationship with catecholaminergic neurons were examined in the medulla oblongata of the rat following received mechanical exposing dental pulp. Results: The Fos-like immunoreactive neurons distributed mainly in the spinal trigeminal subnucleus caudalis(Vc)ipsilaterally and medullary visceral zone (MVZ,including nucleus tractus solitarius,ventrolateral medulla and the reticular formation between the first two),ln the sections processed for double staining of Fos and TH immunohisto chemistry, numerous Fos-LI neurons showed also TH- like immunoreactivity in their cytoplasm(Fos-TH cells)in MVZ. Conclusions: The present study suggested that Vc had an important role on the transmission of noxious dental pulp information, and MVZ may be involved in mediating response to stress from noxious stimulation of dental pulp exposure.
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Key word Fos protein；tyrosine hydroxylase；noxious dental pulp stimulation；medulla oblongata；rat
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(1):27]
牙痛是口腔疾病中最常见的临床症状，是一个复杂的病理生理及心理过程。关于牙痛的中枢传导途径及调控机制，目前尚不清楚。有研究认为三叉神经脊束核是牙齿伤害性信息传入延髓的部位[1]。但这不能解释患者在罹患牙痛的同时常常出现的呼吸、心跳、血压、情绪等变化。延髓内脏带是九十年代提出的延髓内与内脏感觉、应激反应、呼吸、心血管调节等有关的一个新的机能结构区，儿茶酚胺能神经元是它的主要功能神经元[2]。近年来研究发现外周伤害性刺激可诱导中枢有关的神经元表达Fos蛋白，Fos是神经元被刺激激活的标志[3]。本研究采用显示Fos的免疫组化方法，对大鼠机械穿髓所致的疼痛诱导的延髓内Fos表达阳性神经元的分布进行了观察，探讨延髓内与牙痛传入相关部位的可能作用。同时结合酪氨酸羟化酶(儿茶酚胺的代表物，TH)免疫组化方法，探讨延髓儿茶酚胺能神经元与Fos表达的关系， 以期为牙痛的中枢机制研究在延髓部位提供较为全面的形态学上的依据。
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1 材料和方法
成年SD雄性大鼠10只，体重200～250g。术前将动物置于安静的环境饲养 24h以上。随机分为实验组(n=6)，手术操作对照组(n=2)，正常对照组(n=2)。
1.1 实验组
1.1.1 机械穿髓动物模型的制作[4]
大鼠先用乙醚诱导麻醉，再腹腔注射4g/L戊巴比妥钠(每100g体重1ml)。 动物麻醉平稳后，于右上颌第一磨牙面用高速涡轮机开髓至点状露髓。术毕将动物送回与术前相同的环境存活2h。
1.1.2 切片制备
动物在过量戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下开胸， 经升主动脉插管，先用100ml生理盐水冲去血液，继之灌注含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L 磷酸缓冲液(PB，pH=7.4)400ml。注毕立即取延髓置于200g/L蔗糖溶液内浸泡过夜(4℃)。冰冻连续切片，片厚30μm，置0.01mol/L PBS内。
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1.1.3 Fos免疫组化反应(ABC法)
①切片首先放入含3ml/LH2O2的甲醇液中室温下30min。②置入含3g/L TritonX-100的PBS中，室温30min。③置入兔抗Fos血清(1:3000，Sigma，用小牛血清稀释液稀释)，4℃孵育48h。④置入生物素标记的羊抗兔IgG(1:500，Vector)，室温孵育2～4h。⑤入ABC复合物( 1:500，Vector)，室温孵育2～4h。上述每一步骤后均用0.01mol/L PBS洗切片3次， 每次10min。最后用葡萄糖-DAB-硫酸镍铵法呈色，室温下反应10～15min。反应后的切片分为两套，一套经裱片、晾干、脱水、透明、封片即可观察。另一套继续进行以下TH免疫组化反应。
1.1.4 TH免疫组化反应(ABC法)
①入小鼠抗TH血清单克隆抗体(Sigma)，4℃孵育48h。②入羊抗鼠IgG(1:500，Vector)，4℃ 24h。③入ABC复合物(1:500，Vector)，4℃ 24h。④DAB呈色。切片经裱片、晾干、脱水、透明、封片，即可观察。
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1.2 对照组
1.2.1 手术操作对照组(n=2)：动物经与实验组相同的麻醉过程后，不做机械穿髓，只空开涡轮机，使刺激环境及其余过程与处理组同，以观察非牙髓刺激引起的延髓Fos表达。存活2h后按1.1.2方法处理。
1.2.2 正常对照组(n=2)：正常大鼠按1.1.2方法处死，作Fos免疫组化反应，以观察正常状态下延髓的Fos表达。
1.2.3 免疫反应染色对照：取实验组大鼠延髓切片，用牛血清稀释液代替Fos一抗、TH一抗作孵育，其余步骤同1.1.3，用以检查Fos和TH免疫组化反应的特异性。
1.3 计数定量方法
采用简单的累加计数方法，胞核呈蓝黑色的神经元为Fos免疫反应阳性神经元，胞浆棕色神经元为TH免疫反应阳性神经元，胞浆棕色同时胞核蓝黑色者为 Fos-TH 双标神经元， 以上三种神经元各自计数， 然后即可得出Fos-TH双标神经元占TH阳性神经元的比例。
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2 结果
2.1 实验组
Fos样免疫反应阳性神经元的细胞核呈蓝黑色，胞浆不着色。 Fos阳性神经元主要出现在同侧的尾侧亚核和双侧孤束核、腹外侧核及中间网状结构(延髓内脏带，MVZ)。尾侧亚核Fos阳性神经元主要分布在该核的背侧Ⅰ、Ⅱ层及腹外侧，背侧浅层较浓密，腹外侧稀疏。同侧极间亚核、吻侧亚核、感觉主核未见Fos阳性神经元。对侧尾侧亚核偶见Fos阳性神经元。延髓内脏带内Fos 阳性神经元以孤束核和腹外侧核的分布较密集，中间网状结构内较稀疏。
TH免疫反应阳性神经元的胞浆呈均匀棕色，主要见于双侧孤束核及腹外侧核。在Fos、TH免疫组化双重染色的切片上，见到Fos阳性、TH阳性和Fos-TH双重阳性三种细胞。前二者的镜下特点已述及。Fos-TH双标细胞的胞核为黑色，胞浆呈均匀棕色，主要分布于双侧孤束核和腹外侧核。计数一例动物的15张延髓切片，见到TH标记细胞751个(TH阳性细胞+FOS-TH双标细胞)，Fos-TH双标细胞129个，双标细胞数约占TH标记细胞数的17.2%(图1、2、3)。
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图1 实验组大鼠延髓内三种阳性细胞的分布模式图
● Fos阳性细胞 ■TH阳性细胞 ▲Fos-TH阳性细胞 (每个符号代表3～5个细胞)
+0.8mm闩头侧0.8mm平面 obex闩平面 -0.3mm闩尾侧0.3mm平面 -1.0mm闩尾侧1.0mm平面NTS孤束核 dmnx迷走神经背核 nVL腹外侧网状核 nⅫ舌下神经核 PY锥体束 Sp5I三叉神经脊束核极间亚核PYX锥体交叉 LRt外侧网状核 Sp5C三叉神经脊束核尾侧亚核
图2 孤束核内Fos阳性细胞(↑)、TH 图3 腹外侧核内Fos阳性细胞(↑)、TH阳性细
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)、Fos/TH双重阳性细胞(△) 胞()、Fos-TH双重阳性细胞(△)2.2 对照组
手术操作对照组在同侧尾侧亚核的腹外侧浅层见到少量Fos阳性细胞(平均5～10个)，估计与术中牵拉同侧口角有关；双侧孤束核内可见Fos阳性细胞，数量较实验组明显少(平均10～15个)，估计与涡轮机开动的声音刺激导致大鼠产生一定程度的应激反应有关(图4)。 正常对照组未见延髓切片上出现Fos阳性细胞。免疫反应对照组切片上未见Fos、TH阳性细胞。
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图4 手术操作对照组延髓内Fos免疫反应阳性细胞分布模式图(● Fos阳性细胞)
3 讨论
3.1 延髓内Fos表达的特点和意义
c-fos原癌基因是一种即刻-早期基因[5]。当细胞受到刺激后，其胞核内的该基因可被激活，转录的mRNA由胞核进入胞浆，并在胞浆翻译和合成Fos蛋白(简称Fos)。Fos与另一即刻-早期基因c-jun所产生的蛋白Jun 迅速转移到胞核内，形成异源二聚体。该复合物以很高的亲和力结合到DNA链上的AP-1结合位点， 进一步调节其靶基因的转录，从而将短期刺激与细胞的长期效应耦联起来。因此，Fos又可被视为第三信使。Fos的显示可作为接受一定刺激的神经元功能活动的标志，是近年来被广泛采用的一种中枢神经系统功能解剖学研究方法之一[3]。
本组结果表明，牙髓伤害性刺激所诱导的延髓内Fos 表达具有如下特点：Fos阳性神经元主要集中分布在同侧三叉神经脊束核尾侧亚核的背侧浅层、 双侧孤束核及腹外侧网状核。前者的分布与以往的报道一致[6，7]， 且与追踪及电生理研究在Vc内的结果基本相同[1，8]，说明Vc内Fos的表达是对牙髓伤害性信息初级传入的直接反应。而孤束核和腹外侧网状核内由牙髓刺激引起的Fos 表达还未见报道。形态学追踪研究表明三叉神经的某些分支，其传入纤维既可直接终止于孤束核，又可经间质核的介导后向孤束核传入[9，10]。因此孤束核内的Fos阳性神经元可能是对经这两种途径传入的伤害性信息的反应。腹外侧网状核是心血管与呼吸运动神经元的分布区，Kabashi[11] 等证明孤束核的神经元向腹外侧网状核发出轴突投射，提示腹外侧核Fos 表达可能是通过孤束核间接获得牙髓伤害性信息的反应。
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延髓迷走孤束复合体、腹外侧核及两者之间的网状结构( “延髓内脏带”，MVZ)，既与内脏感觉的传递有关，也是心血管、内脏活动、呼吸调节及参与伤害性刺激感受和调节应激反应的重要中枢之一[2，12]。牙齿在非局麻状态下备洞、充填或拔除过程中，患者血浆中的皮质醇浓度，血、尿中的儿茶酚胺浓度明显升高，收缩压、舒张压均上升，心率加快，心搏出量增大，血管床收缩，出现一系列交感神经兴奋的症状，这是机体对牙齿伤害性刺激产生的应激反应[13]。实验中大鼠清醒后时有烦躁、胡须抖动明显等行为改变，这是应激反应的外在表现。本组首次报道刺激牙髓后在中枢延髓内脏带内出现Fos表达， 可能为以上这些应激反应提供了中枢的形态学依据。
3.2 延髓儿茶酚胺能神经元与Fos表达的关系
儿茶酚胺能神经元是延髓内脏带内的主要功能性神经元。本组显示了延髓儿茶酚胺能神经元(以TH作为标记物)的分布，结果与以往的报道一致[14]，多集中分布在孤束核和腹外侧核，少数散在分布于中间网状结构。儿茶酚胺能神经元与内脏活动和应激反应的调节关系密切。本组采用Fos和TH免疫组化双重染色，结果证明“延髓内脏带”内许多Fos阳性神经元同时呈 TH 阳性。 细胞计数表明Fos-TH双重阳性细胞占TH标记细胞总数的17.2%，从而说明延髓内儿茶酚胺能神经元中的约17.2%参与牙髓伤害性刺激的反应。
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本组结果表明，牙髓机械损伤性刺激诱导的延髓Fos 表达部位不仅在与面口部痛传递密切相关的三叉神经脊束核尾侧亚核背侧浅层，还位于与内脏感觉、呼吸、心血管、应激反应等的调节有关的延髓内脏带，且约有17.2%的延髓儿茶酚胺能神经元参与牙髓机械损伤刺激的反应。提示Vc浅层可能是牙髓伤害性信息初级传入的主要到达部位；延髓内脏带可能参与调控牙髓伤害性刺激引起的应激反应。这为进一步认识和解释临床上与患者牙痛症状相伴而来的呼吸、心率、血压、情绪等变化提供了较为全面的中枢形态学的依据
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收稿日期：1998-07-23
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