人牙髓细胞体外培养条件的优化
作者：严 焱 刘 正
单位：第二医科大学口腔医学院口腔内科，上海 200011
关键词：体外培养；人牙髓细胞；培养瓶；胎牛血清；高糖DMEM
牙体牙髓牙周病学杂志CHINESE JOURNAL OF CONSERVATIVE DENTISTRY1999年 第9卷 第1期 Vol 摘要 目的：优化体外人牙髓细胞(HDPC)培养条件，以提高HDPC原代培养成功率。方法：采用玻璃及塑料培养瓶、高糖DMEM以及标准型、合格型胎牛血清，分别比较原代牙髓组织细胞游出率。结果：塑料培养瓶细胞游出率以及细胞游出最短时间均明显优于常用玻璃培养瓶；两种不同型号胎牛血清比较为标准型胎牛血清的组织块贴壁以及细胞游出率均优于合格型胎牛血清；高糖DMEM适合于HPDC培养。结论：商品塑料培养瓶、标准胎牛血清、高糖DMEM是提高体外HDPC培养成功率的关键。
, http://www.100md.com
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0018-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(1)：18]
Established the excellent condition suitable for culture
human dental pulp cells in vitro
Yan Yan, Liu Zheng
Department of Oral Medicine, School of Stomatology,The Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011
, 百拇医药 Abstract Aim：To enhance the success rate of primary pulp tissues, we established the excellent condition suitable for culture human dental pulp cells in vitro. Methods: The cell growth rate of pulp tissues was compared with plastic culture bottle against glass one; qualified fetal bovine serium (QFBS) contained in DMEM( high glucose) against certified fetal bovine serium(CFBS), respectively. Results: The cell growth rate of pulp tissues in plastic bottle was higher than that of the glass bottle as well as in CFBS higher than that in QFBS; DMEM in high glucose was suitable for HDPC. Conclusions: It was a key for HDPC primary culture using plastic bottle, DMEM in high glucose and CFBS.
, 百拇医药
Key words culture in vitro；human dental pulp cells；culture bottle；fatal bovine serium；DMEM in high glucose
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(1):18]
本实验在众多学者研究的基础上，进行优化体外人牙髓细胞(Human dental pulp cell, HDPC)培养条件，以提高HDPC原代培养成功率。
1 材料和方法
1.1 材料和仪器
二氧化碳培养箱(SANYO，Japan)；倒置相差显微镜和照相系统(Nikon, Japan)；SZX-11超净工作台(整新电子仪器厂，上海)；50ml商品塑料培养瓶(GIBCO BRL， USA)；25ml玻璃培养瓶(上海)；Dulbeccos modified eagle培养液(高糖)(高糖DMEM)(GIBCO BRL， USA)；Hepes(Nacalai, Japan)；胎牛血清：合格型胎牛血清(qulified fetal bovine serium, QFBS)(GIBCO BRL, USA)；标准型胎牛血清(certified fetal bovine serium, CFBS) (GIBCO BRL, USA)。
, 百拇医药
1.2 组织块培养方法
参照司徒镇强[1]，略作修改。采用临床10～20岁因正畸阻生需要拔除的健康牙齿，在拔除后立即置入含双抗(青霉素，链霉素)的生理盐水内，于超净台上用750ml/L乙醇消毒。随后，正畸切钳沿牙根沟纹处切开牙齿，取出牙髓，不完全DMEM冲洗，剪切成1mm×1mm碎片，分割平铺于25ml玻璃培养瓶及50ml塑料培养瓶内，将瓶底向上，加入少量含150ml/L FBS的DMEM培养液，二氧化碳培养箱37℃培养4h，待组织贴壁后，将瓶底翻转平放，静止培养。
于倒置显微镜下观察组织块细胞生长状况。在组织块未长出细胞前，2周换液1次；待有细胞游出，则5d换液1次。当长出细胞铺满瓶底80%，即按1:2传代。比较塑料培养瓶与玻璃培养瓶细胞游出率。
1.3 HDPC来源鉴定
取出已传代(3代)细胞，经2.5g/L胰酶消化后，将细胞以2×104/孔接种于放有1cm×1cm大小盖玻片的24孔板内，常规培养，待长满为单层时，取出，用ABC法行波形丝蛋白(Vimtin)单抗染色，光镜下观察。
, 百拇医药
1.4 HDPC生长曲线
取第3代细胞，2.5g/L胰酶消化，以每孔1万细胞接种。放入培养箱培养。分别于第1～7天取出，胰酶消化后行细胞计数，每时相3孔，取3孔均数。绘制生长曲线。
1.5 两种型号胎牛血清比较
按上述原代培养方法，将已剪碎的牙髓组织放入商品塑料培养瓶内。分别加入150ml/L QFBS与CFBS， 比较两种型号胎牛血清细胞游出率。
2 结果
2.1 人牙髓细胞原代培养观察
牙髓组织原代培养后第10天，组织块周围长出细胞，倒置显微镜下见细胞呈长梭形，细胞核椭圆，位于中央，胞浆均匀透亮(图1，2)。
, 百拇医药
图1 人牙髓细胞原代培养第10天 4×10
图2 人牙髓细胞原代培养第15天 10×10
2.2 两种培养瓶原代HDPC游出率比较
将原代培养组织块分别置入玻璃和塑料培养瓶内。培养72h后，每天观察组织贴壁、细胞游出情况，最后统计细胞游出及细胞长出最短时间(表1)。
表1 两种培养瓶原代HDPC成活率比较
例数
贴壁组织块
(块)
细胞长出例数
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(成活率%)
细胞长出
最短时间(d)
玻璃瓶
18
10～25
2(12%)
28
商品塑料瓶
13
10～25
12(92%)*
7
, http://www.100md.com
经χ2检验 *P<0.012.3 两种不同型号胎牛血清对HDPC原代培养作用比较
经观察发现：含CFBS的DMEM在商品塑料培养瓶内最为适合HDPC的生长，所培养例数，除1瓶外，其余12瓶均有细胞长出，而HDPC在含QFBS的DMEM中无细胞生长(表2)。
表2 两种不同型号胎牛血清对HDPC原代培养比较
合格型胎牛血清(QFBS)
标准型胎牛血清(CFBS)
原代培养例数
7
13
培养瓶
, 百拇医药
商品塑料瓶
商品塑料瓶
组织块贴壁
差
良好
细胞成活(例数)
无(0)
有(12)
2.4 HDPC生长曲线
本实验HDPC生长曲线为“S”型(图3)。
图3 人牙髓细胞生长曲线
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2.5 细胞来源鉴定
所培养HDPC为抗波形丝蛋白阳性(图4)。
图4 人牙髓细胞抗波形丝蛋白阳性 ABC染色 16×10
3 讨论
本组采用高糖DMEM，150ml/L CFBS，以及商品塑料瓶，优化HDPC体外生长条件。结果HDPC游出率为92%，较之在其它条件相同所用玻璃培养瓶细胞游出率12%有极显著差异。高糖DMEM有利于HDPC生长，这与其能提供细胞生长所需高能量、参与合成细胞蛋白质和核酸有关。提示HDPC生长条件要求较高。
本组结果显示，商品塑料培养瓶中HDPC游出率明显高于玻璃培养瓶，有显著差异。其原因可能为商品塑料瓶底涂有胶原膜能支持细胞的攀附；阻挡瓶底表面某些有损细胞成分，有利于组织块贴附及细胞生长；此外，胶原是细胞外间质的主要成分，对细胞分裂有协同作用[2]。
, 百拇医药
我们比较了QFBS与CFBS两种血清对细胞生长的作用。结果表明，FQBS抑制细胞成活，所培养组织块大量飘浮。而CFBS却使细胞生长良好，组织块贴壁甚佳。
总之，体外HDPC的培养条件要求甚高，我们认为选择：①商品塑料培养瓶；②标准胎牛血清；③高糖DMEM是提高体外HDPC培养成功率的关键。
参考文献
1 司徒镇强，吴军正. 细胞培养. 西安：世界图书出版社，1996.933
2 李玉瑞. 细胞外间质生物化学及研究方法. 北京：人民卫生出版社，1988. 100
收稿日期：1998-06-17
修回日期：1998-12-10, 百拇医药
单位：第二医科大学口腔医学院口腔内科，上海 200011
关键词：体外培养；人牙髓细胞；培养瓶；胎牛血清；高糖DMEM
牙体牙髓牙周病学杂志CHINESE JOURNAL OF CONSERVATIVE DENTISTRY1999年 第9卷 第1期 Vol 摘要 目的：优化体外人牙髓细胞(HDPC)培养条件，以提高HDPC原代培养成功率。方法：采用玻璃及塑料培养瓶、高糖DMEM以及标准型、合格型胎牛血清，分别比较原代牙髓组织细胞游出率。结果：塑料培养瓶细胞游出率以及细胞游出最短时间均明显优于常用玻璃培养瓶；两种不同型号胎牛血清比较为标准型胎牛血清的组织块贴壁以及细胞游出率均优于合格型胎牛血清；高糖DMEM适合于HPDC培养。结论：商品塑料培养瓶、标准胎牛血清、高糖DMEM是提高体外HDPC培养成功率的关键。
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中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0018-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(1)：18]
Established the excellent condition suitable for culture
human dental pulp cells in vitro
Yan Yan, Liu Zheng
Department of Oral Medicine, School of Stomatology,The Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011
, 百拇医药 Abstract Aim：To enhance the success rate of primary pulp tissues, we established the excellent condition suitable for culture human dental pulp cells in vitro. Methods: The cell growth rate of pulp tissues was compared with plastic culture bottle against glass one; qualified fetal bovine serium (QFBS) contained in DMEM( high glucose) against certified fetal bovine serium(CFBS), respectively. Results: The cell growth rate of pulp tissues in plastic bottle was higher than that of the glass bottle as well as in CFBS higher than that in QFBS; DMEM in high glucose was suitable for HDPC. Conclusions: It was a key for HDPC primary culture using plastic bottle, DMEM in high glucose and CFBS.
, 百拇医药
Key words culture in vitro；human dental pulp cells；culture bottle；fatal bovine serium；DMEM in high glucose
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(1):18]
本实验在众多学者研究的基础上，进行优化体外人牙髓细胞(Human dental pulp cell, HDPC)培养条件，以提高HDPC原代培养成功率。
1 材料和方法
1.1 材料和仪器
二氧化碳培养箱(SANYO，Japan)；倒置相差显微镜和照相系统(Nikon, Japan)；SZX-11超净工作台(整新电子仪器厂，上海)；50ml商品塑料培养瓶(GIBCO BRL， USA)；25ml玻璃培养瓶(上海)；Dulbeccos modified eagle培养液(高糖)(高糖DMEM)(GIBCO BRL， USA)；Hepes(Nacalai, Japan)；胎牛血清：合格型胎牛血清(qulified fetal bovine serium, QFBS)(GIBCO BRL, USA)；标准型胎牛血清(certified fetal bovine serium, CFBS) (GIBCO BRL, USA)。
, 百拇医药
1.2 组织块培养方法
参照司徒镇强[1]，略作修改。采用临床10～20岁因正畸阻生需要拔除的健康牙齿，在拔除后立即置入含双抗(青霉素，链霉素)的生理盐水内，于超净台上用750ml/L乙醇消毒。随后，正畸切钳沿牙根沟纹处切开牙齿，取出牙髓，不完全DMEM冲洗，剪切成1mm×1mm碎片，分割平铺于25ml玻璃培养瓶及50ml塑料培养瓶内，将瓶底向上，加入少量含150ml/L FBS的DMEM培养液，二氧化碳培养箱37℃培养4h，待组织贴壁后，将瓶底翻转平放，静止培养。
于倒置显微镜下观察组织块细胞生长状况。在组织块未长出细胞前，2周换液1次；待有细胞游出，则5d换液1次。当长出细胞铺满瓶底80%，即按1:2传代。比较塑料培养瓶与玻璃培养瓶细胞游出率。
1.3 HDPC来源鉴定
取出已传代(3代)细胞，经2.5g/L胰酶消化后，将细胞以2×104/孔接种于放有1cm×1cm大小盖玻片的24孔板内，常规培养，待长满为单层时，取出，用ABC法行波形丝蛋白(Vimtin)单抗染色，光镜下观察。
, 百拇医药
1.4 HDPC生长曲线
取第3代细胞，2.5g/L胰酶消化，以每孔1万细胞接种。放入培养箱培养。分别于第1～7天取出，胰酶消化后行细胞计数，每时相3孔，取3孔均数。绘制生长曲线。
1.5 两种型号胎牛血清比较
按上述原代培养方法，将已剪碎的牙髓组织放入商品塑料培养瓶内。分别加入150ml/L QFBS与CFBS， 比较两种型号胎牛血清细胞游出率。
2 结果
2.1 人牙髓细胞原代培养观察
牙髓组织原代培养后第10天，组织块周围长出细胞，倒置显微镜下见细胞呈长梭形，细胞核椭圆，位于中央，胞浆均匀透亮(图1，2)。
, 百拇医药
图1 人牙髓细胞原代培养第10天 4×10
图2 人牙髓细胞原代培养第15天 10×10
2.2 两种培养瓶原代HDPC游出率比较
将原代培养组织块分别置入玻璃和塑料培养瓶内。培养72h后，每天观察组织贴壁、细胞游出情况，最后统计细胞游出及细胞长出最短时间(表1)。
表1 两种培养瓶原代HDPC成活率比较
例数
贴壁组织块
(块)
细胞长出例数
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(成活率%)
细胞长出
最短时间(d)
玻璃瓶
18
10～25
2(12%)
28
商品塑料瓶
13
10～25
12(92%)*
7
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经χ2检验 *P<0.012.3 两种不同型号胎牛血清对HDPC原代培养作用比较
经观察发现：含CFBS的DMEM在商品塑料培养瓶内最为适合HDPC的生长，所培养例数，除1瓶外，其余12瓶均有细胞长出，而HDPC在含QFBS的DMEM中无细胞生长(表2)。
表2 两种不同型号胎牛血清对HDPC原代培养比较
合格型胎牛血清(QFBS)
标准型胎牛血清(CFBS)
原代培养例数
7
13
培养瓶
, 百拇医药
商品塑料瓶
商品塑料瓶
组织块贴壁
差
良好
细胞成活(例数)
无(0)
有(12)
2.4 HDPC生长曲线
本实验HDPC生长曲线为“S”型(图3)。
图3 人牙髓细胞生长曲线
, http://www.100md.com
2.5 细胞来源鉴定
所培养HDPC为抗波形丝蛋白阳性(图4)。
图4 人牙髓细胞抗波形丝蛋白阳性 ABC染色 16×10
3 讨论
本组采用高糖DMEM，150ml/L CFBS，以及商品塑料瓶，优化HDPC体外生长条件。结果HDPC游出率为92%，较之在其它条件相同所用玻璃培养瓶细胞游出率12%有极显著差异。高糖DMEM有利于HDPC生长，这与其能提供细胞生长所需高能量、参与合成细胞蛋白质和核酸有关。提示HDPC生长条件要求较高。
本组结果显示，商品塑料培养瓶中HDPC游出率明显高于玻璃培养瓶，有显著差异。其原因可能为商品塑料瓶底涂有胶原膜能支持细胞的攀附；阻挡瓶底表面某些有损细胞成分，有利于组织块贴附及细胞生长；此外，胶原是细胞外间质的主要成分，对细胞分裂有协同作用[2]。
, 百拇医药
我们比较了QFBS与CFBS两种血清对细胞生长的作用。结果表明，FQBS抑制细胞成活，所培养组织块大量飘浮。而CFBS却使细胞生长良好，组织块贴壁甚佳。
总之，体外HDPC的培养条件要求甚高，我们认为选择：①商品塑料培养瓶；②标准胎牛血清；③高糖DMEM是提高体外HDPC培养成功率的关键。
参考文献
1 司徒镇强，吴军正. 细胞培养. 西安：世界图书出版社，1996.933
2 李玉瑞. 细胞外间质生物化学及研究方法. 北京：人民卫生出版社，1988. 100
收稿日期：1998-06-17
修回日期：1998-12-10, 百拇医药