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编号:10244321
CDK4蛋白在口腔粘膜癌变过程中表达的研究
http://www.100md.com 《华西口腔医学杂志》 1999年第1期
     作者:陈谦明 罗 刚 李秉琦 何志秀 陈 列 曾 昕 聂敏海

    单位:陈谦明,罗 刚,李秉琦,曾 昕,聂敏海 610041 华西医科大学口腔医学院口腔粘膜病研究室,何志秀,陈 列 口腔病理学教研室

    关键词:CDK4蛋白;P16蛋白;口腔粘膜癌前损害;免疫组织化学

    华西口腔医学杂志990102 摘要 目的:探讨CDK4蛋白在口腔粘膜癌变过程中表达的变化规律。方法:采用链菌素-生物素免疫组织化学染色法,对正常口腔粘膜、癌前损害、口腔鳞状细胞癌等共计80例标本中CDK4蛋白的表达进行检测,并与同批标本的P16蛋白的免疫组织化学染色结果进行相关性分析。结果:口腔粘膜癌前损害中出现CDK4蛋白的过表达,其阳性率及表达强度与P16蛋白的表达密切相关。结论:CDK4的过表达可能是口腔粘膜癌前损害发生发展中的增殖刺激因子,并可能引发P16的代偿作用。
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    Expression of CDK4 Protein in Oral Carcinogenesis

    Chen Qianming, Luo Gang, Li Bingqi, et al

    Department of Oral Medicine, College of Stomatology, West China University of Medical Sciences

    He Zhixiu, Chen Lie

    Department of Pathology, College of Stomatology, West China University of Medical Sciences

    Abstract Objective: To study the expression of cyclin dependant kinase 4(CDK4) protein in oral carcinogenesis. Methods: An LSAB immunohistochemistry method was applied to 80 cases of parrafin-fixed tissues to study the expression and distribution of CDK4 in normal oral mucosa, oral premalignant leision (OPL) and oral squamous cell carcinoma. Results:The overexpression of CDK4 protein was observed in the progression of OPL. Meanwhile, a correlation analysis was appilied to investigate the relationship between P16 and CDK4 expression, and the result showed that the coeffient of correlation was 0.813, which was statistically significant. Conclusion: The overexpression of CDK4 is invovled in the progression of OPL, and there is a positive feedback loop between CDK4 and P16.
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    Key words: CDK4 protein P16 protein oral premalignant lesion immunohistochemistry

    细胞周期调控因素的研究已成为研究热点,作者曾报道肿瘤抑制基因CDKN2的蛋白产物、细胞周期负性调节因子P16蛋白在口腔粘膜癌前损害演进过程中变化规律[1]。在此,作者在其同批标本中用免疫组织化学染色法研究P16蛋白作用底物细胞周期依赖激酶4(cyclin dependant kinase 4,CDK4)的改变情况,以期为明确细胞周期调控因子在口腔粘膜癌变过程中的作用积累资料。

    1 材料和方法

    1.1 标本选择

    纳入标准:参照WHO1983年有关口腔粘膜癌前损害的分类标准,分别选择正常口腔粘膜,上皮单纯增生,轻、中、重度异常增生,无转移浸润性鳞状细胞癌,伴转移的浸润性鳞状细胞癌及其淋巴结转移灶各10例,共计80例研究标本。
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    排除标准:标本过厚,难以保证取材后能达到迅速完全固定;或标本中病灶过小,作连续切片后难以保证每张切片上均有典型病变;标本相应的临床和病理资料不全;患者接受过放疗、化疗、热疗等均不纳入。

    1.2 主要试剂

    兔抗人CDK4多克隆抗体(sc-748)(Santa Cruz公司,美国)。LSAB药盒、DAB(DAKO公司,美国)。

    1.3 实验方法

    免疫组织化学染色采用微波脱交联的LSAB法。选用经Northern杂交证实为CDK4阳性的纤维肉瘤为阳性对照,腺样淋巴增生组织为阴性对照,分别用PBS和非免疫一抗同源血清(兔血清)为空白对照和替代对照。结果采用1996年全国免疫组织化学技术与诊断标准化专题研讨会所推荐的阳性细胞强度指数法(staining intensity index,SII)进行半定量结果判定,选择5个典型高倍视野(×400),每视野内随机计数100个上皮细胞,共计500个,与阳性、阴性对照切片中的典型细胞比较,按其阳性着色程度,由阴性至强阳性分为0~3共4级,A、B、C、D为相应级别的细胞百分数。SII=(A×0+B×2+C×3+D×4)/100。
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    2 结 果

    2.1 CDK4免疫组织化学染色结果

    CDK4染色阳性反应产物出现于胞浆和(或)胞核,且抗原的表达强度也随着由正常粘膜至异常增生的发展而逐渐增强。正常口腔粘膜、上皮单纯增生组中,阳性反应主要定位于细胞核内;而在上皮异常增生各组及浸润癌中阳性反应逐渐增强,且出现较为明显的胞浆内着色(表1)。

    表1 CDK4蛋白免疫组织化学染色结果 CDK4染色

    正常口

    腔粘膜

    上皮单

    纯增生

    上皮异常增生
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    鳞癌组

    淋巴结转移灶

    轻度

    中度

    重度

    无转移

    有转移

    n=10

    n=10

    n=10

    n=10

    n=10

    n=10
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    n=10

    n=10

    染色强度平均秩和

    胞核

    32.4

    30.0

    44.4

    58.0

    60.0

    48.5

    12.2

    10.4

    胞浆
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    12.0

    14.8

    44.8

    42.0

    48.8

    90.4

    88.0

    86.8

    阳性细胞百分比

    16.8

    20.4

    34.6

    46.8
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    64.7

    68.4

    30.2

    8.2

    SII

    24.7

    29.3

    100.7

    114.4

    198.8

    144.0

    24.9

    10.3
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    在正常口腔粘膜组织中,阳性细胞数较少,散在分布于整个上皮层。少数组织中出现胞浆着色,但强度明显低于细胞核着色。上皮单纯性增生与正常口腔粘膜无显著性差异(P>0.05);上皮异常增生各组中,阳性细胞呈灶性分布,主要位于上皮棘层及部分粒层细胞胞浆或胞核中(图1)。胞核及胞浆染色强度(SII值)均较前两组增强(P<0.05),不同程度的异常增生上皮间CDK4的阳性反应无明显差别;浸润癌中CDK4胞核阳性反应显著低于其余各组,而胞浆阳性反应强度高于各组(P<0.05)。高分化肿瘤中,阳性细胞定位于癌巢外周,基底样细胞中见整齐的阳性反应信号(图2);低分化肿瘤中所有阳性反应均位于胞浆。几乎所有伴转移的口腔粘膜鳞状细胞癌均无胞核阳性反应。

    图1 口腔粘膜组织中度异常增生 CDK4阳性见于基底细胞及棘细胞 LSAB ×200
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    图2 无淋巴结转移的高分化口腔鳞癌 CDK4阳性见于癌巢周围基底样细胞,排列整齐 LSAB ×200

    2.2 CDK4与P16表达的相关性

    结合曾报道的在同批标本中P16蛋白的表达[1],发现P16和CDK4免疫组织化学染色结果存在明显相关性。

    从二者的阳性率比较,总共56例(5例正常,6例上皮单纯增生,26例异常增生和19例肿瘤)胞核或胞浆CDK4阳性的标本中,有46例同时表达P16抗原(表2)。其中正常口腔粘膜组织4例、上皮单纯增生6例、异常增生22例、肿瘤14例。而在CDK4阴性的24例标本中,仅2例正常口腔粘膜组织、1例上皮单纯增生、2例上皮异常增生和1例肿瘤为P16阳性。

    表2 P16与CDK4一致性比较表(例) 蛋白表达
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    P16阳性

    P16阴性

    合计

    CDK4阳性

    46(57.5%)

    10(12.5%)

    56

    CDK4阴性

    6(7.5%)

    18(22.5%)

    24

    合计

    52
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    28

    80

    从正常口腔粘膜、单纯过角化到上皮异常增生到浸润性鳞状细胞癌的全过程中,P16与CDK4的染色强度呈现相似的动态变化规律,以其SII值行相关性分析,相关系数为r=0.813(r0.05=0.215),表明二者的相关性具有统计学意义。3 讨 论

    3.1 CDK4是细胞周期调控中的关键元件

    细胞周期调控异常被认为是肿瘤发生的一个基本机制。而P34cdc2激酶是细胞周期调控的关键限速酶。该酶由调节亚基和功能亚基两部分组成,CDK4即是该酶最重要的功能亚基,其调节亚基包括细胞周期促进因子如细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和抑制因子如CDKN2基因的产物P16蛋白,这些细胞因子通过CDK4的最终作用,维持着细胞周期的平衡[2],因此,CDK4是细胞周期调控中的关键元件。
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    3.2 CDK4的过表达与口腔粘膜癌前损害的演进有关

    CDK4的编码基因位于人类基因组12号染色体长臂13区段,目前已在多种肿瘤细胞系中检测到该区位的基因改变,包括基因重排和点突变。Ladanyi等[4]在研究尤文肉瘤的基因改变时发现除MDM2和SAS基因外,还有CDK4的扩增。He和Sonoda等[5,6]也分别在胶质瘤细胞系和原发骨肿瘤中检测到该基因的扩增,并认为CDK4的扩增是胶质瘤的发生中CDKN2基因同源性缺失的替代机制。这些证据说明,CDK4的表达及基因异常可能与某些肿瘤的发生有关。

    本研究通过免疫组织化学染色发现,异常增生口腔粘膜及口腔粘膜鳞癌中CDK4免疫组织化学染色的强度较正常口腔粘膜组织和单纯性上皮增生增强,提示口腔粘膜癌前损害衍进过程中存在CDK4的过表达。可能有某些致癌刺激因子作用于CDK4的转录前、转录及转录后的任一环节,致使CDK4过表达,并催化其底物pRB的磷酸化使其失活,释放转录因子,由G1期进入S期,导致细胞过度增殖,引起癌变的发生和发展。因此,CDK4的过表达可能是口腔粘膜癌前损害发生发展过程中可能的增殖刺激因素之一。
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    3.3 CDK4的过表达与口腔粘膜癌变过程中P16的代偿反应有关

    比较同一组织连续切片中P16和CDK4免疫组织化学染色结果,发现二者的阳性率、阳性染色强度均存在正相关关系。由于P16蛋白作为CDK4的调节因子,与其结合形成无或低活性的复合体,但并不使后者的抗原性或抗原的量发生改变。因此作者推测口腔粘膜癌前损害过程中CDK4表达的改变,是先于P16的改变,而非后者的结果。因此,可能是由于位于P16下游的CDK4对前者的转录、表达存在某种正反馈调节通路,故CDK4的过表达引发了P16的代偿过程。

    CDK4是通过什么机理来调节P16的表达呢?通过分析CDK4与P16在细胞周期调控中的作用环节,发现视网膜母细胞瘤易感基因(pRB)与二者的作用密切相关。Shapiro等[7]报道了肺癌中P16、pRB表达的交互性,认为功能性的pRB能反馈抑制P16的表达。段开文等[8]在DMBA诱导的实验性口腔癌模型上也观察到pRB表达强度的下降。故可以推测,在口腔粘膜癌前损害的发生发展过程中,某些病理性增殖刺激因素引起的CDK4过表达导致功能性的非磷酸化pRB减少,pRB对P16的反馈抑制丧失或减弱,故P16水平相应升高,力图以此抑制过表达的CDK4的活性,重新恢复细胞周期的平衡。即是说,在机体内复杂的细胞周期调控网络中,不仅存在P16↑→活性CDK4↓→活性pRB↑的增殖抑制通路,还存在一个CDK4↑→活性pRB↓→P16↑的正反馈代偿回路,正是由于这种互相制约的调节体系的存在,才使得对正常细胞周期的精确调控能得以实现。
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    综上,对比P16、cdk的在口腔癌变过程中的变化规律及结合二者在细胞周期中的作用,作者认为①CDK4的过表达可能作为一种增殖刺激因素参与了口腔粘膜癌前损害的演进过程;②P16作为负性代偿因子参与这一过程,这一代偿作用的完成依赖于CDK4/pRB相关的正反馈调节通路。

    本研究为国家自然科学基金及国家教委博士点基金资助项目(编号 39570766,9504125)

    参考文献

    1 陈谦明,李秉琦,罗 刚,等.人类口腔粘膜癌前损害发生发展过程中CDKN2基因作用的研究.华西口腔医学杂志,1996,14(1):55~61

    2 Kamb A, Gruis AG, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator patentially involved in genesis of many tumor types. Science (washington DC), 1994,264:436~437
, 百拇医药
    3 Reed AG. All in the (cancer) family (review). Nat Genet, 1993, 5(2):103~117

    4 Ladanyi S, Takeda S, Horrii A, et al. Detailed analysis of genetic alterations in colorectal tumors from patients with and without familial adenomatous ployposis. Oncogene, 1993, 8(8):2399~2344

    5 He J, Kratzke RA, Niehans GA, et al. Immunohistochemical detection of the cyclindependent kinase inhibitor 2/Multiple tumor suppressor gene 1(CDKN2/MTS1) product P16 ink4A in archival human solid tumors: correlation with retinoblastoma protein experession. Cancer Res, 1995, 55(17):6006~6010
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    6 Sonoda E, Ichimura K, Reifenberger G, et al. CDKN2 (P16/MTS1) gene deletion or CDK4 amplification occurs in the majority of glioblastomas. Cancer Res, 1994, 54(17):6321~6325

    7 Shapiro DG, Duan W, Popovic EA. Homozyagous deletions of the Multiple tumor suppressor gene 1 in the progression of human astrocytomas. Cancer Res, 1995, 55(1):20~26

    8 段开文.实验性口腔癌发生过程中肿瘤起源和细胞标志的研究.成都:华西医科大学博士学位论文,1997:15

    (1998-09-04收稿), 百拇医药