眼前段组织纤溶酶原激活物抑制剂-1 mRNA的表达
作者：吴强 陆道炎 王丽天 陈才根
单位：陆道炎 王丽天 陈才根(200092 上海第二医科大学附属新华医院眼科)；吴强(研究生，现在上海市第六人民医院眼科，200233)
关键词：
中华眼科杂志990128 纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)是纤溶酶原激活物(plasminogen activators, PAs)特异的生理抑制剂；它可通过抑制PAs对纤溶酶原的激活而发挥其重要的生物学作用[1]。近年国外及我们的研究已发现在人眼房水内存在蛋白质降解-蛋白质降解抑制的PAI-1-PAs酶反应系统[2]，但有关眼房水内PAI-1蛋白酶是否由眼前段组织释放而来，目前国内外尚未进行研究。我们应用敏感的分子生物学技术对眼前段组织的基因转录物质进行研究，以获取PAI-1蛋白酶在眼房水内存在的客观依据。
, http://www.100md.com
一、材料和方法
1.主要试剂和仪器：主要试剂：鼠白血病病毒反转录酶(M-MLV)(美国Gibco Brl公司产品)，dNTP、随机引物、Tag酶、RNsin(美国Promega公司产品)。主要仪器：聚合酶链反应仪(PERKIN ELMER 480美国产)，计算机图像分析仪(Image Analysis System德国产)，紫外分光光度仪(Ultrospec 300，瑞典 Pharmacia Biotech 产品)。
2.方法：
(1)组织标本的制备及RNA的提取：正常新西兰白兔3只，体重2.5～3.0 kg。在显微镜操作下，分别将3只兔眼的角膜经板层切除后，剪取剩余角膜、虹膜和晶体囊膜组织，用匀浆器粉碎成组织匀浆，依次加入RNA快速提取试剂、氯仿-异丙醇进行提取。所提取的9份RNA标本，经紫外分光光度仪测定，其吸光度(A)260 nm/(A)280 nm比值为1.70～1.94。
, 百拇医药
(2)组织细胞中的mRNA逆反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerse chain reaction):
引物序列：PAI-1(约360bp)
上游：5′ATG-GAA-TTC-CCG-TGG-AAC-AAG-AAT-GAG-ATC-AG 3′
下游：3′GAG-ACA-CGG-GTA-CTA-CCG-AGT 5′
β-actin(828bp)
上游：5′ATC-TGG-CAC-CAC-CTT-CTA-CAA-TGA-GCT-GC 3′
下游：3′CGT-CTA-CAC-CTA-GTC-GTT-CGT-CCT-CAT-ACT-GC 5′
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在20μl反应体系中加有随机引物、RNsin、待测组织细胞RNA、10 mmol/L dNTP、 M-MLV, 37℃下放置60分钟，然后升高温度至90℃下5分钟，进行逆反转录；再将PAI-1和β-actin cDNA反转录产物各10 μl分别加入包含有25 mmol/L MgCl2，10 mmol/L dNTP,上、下引物，Tag酶的反应体系中(总量为50 μl)，在聚合酶链反应仪上分别进行28和30次循环扩增；其最终产物加入1%琼脂糖凝胶加样槽中电泳，溴乙锭染色，摄片，计算机图像分析仪进行吸光度(A)扫描测定。
二、结果
3只兔眼角膜内皮细胞、晶体上皮细胞、虹膜组织的基因转录产物均显示出约360 bp和828 bp长度的单一条带，但360 bp条带的吸光度(A)值各不相同，以虹膜组织的最高，晶体上皮细胞次之，角膜内皮细胞最低(表1)。
表1 3只兔眼前段各组织PAI-1 mRNA表达的吸光度(A)值分析 组织类型
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PAI-1吸光度(A)值
(
±s)
β-actin吸光度(A)值
(±s)
比值
角膜内皮细胞
2.46±1.75
3.23±0.89
, 百拇医药
0.76
晶体上皮细胞
3.13±0.93
2.83±0.88
1.10
虹膜组织
3.91±1.87
3.14±1.24
1.24
三、讨论
PAI-1是属于丝氨酸类的一种蛋白酶，具有特异快速抑制PAs的活性，对PAs所涉及的机体内纤溶、组织修复、排卵和肿瘤的生长、转移等生理、病理过程起到重要的调节作用[1]。PAI-1水平的升高可导致机体内纤维蛋白的清除作用降低，而近10年的研究表明，PAI-1还是一个调节细胞外基质蛋白代谢的重要蛋白酶[3]。
, 百拇医药
近年Wang和我们的研究已发现,在正常人眼房水中存在有PAI-1蛋白酶，其含量及活性比血液中的低,但它可对生理状态下眼房水中纤溶系统-蛋白质凝固系统的动态平衡起到维持作用[2]。但有关这些研究均是直接对术中所提取的眼房水进行检测，标本易于受到血液的污染，而导致假阳性结果。因此，为确定PAI-1在眼房水中存在的客观性，我们应用先进而敏感的分子生物学技术，首次对正常兔眼的角膜内皮细胞、晶体上皮细胞和虹膜组织的基因表达产物mRNA进行体外逆反转录、扩增，并以各组织都一致表达的β-actin作为内参照进行半定量研究，发现在兔眼角膜内皮细胞、晶体上皮细胞、虹膜组织中均有PAI-1的 mRNA表达，表达的量以虹膜组织最高，晶体上皮细胞次之，角膜内皮细胞最低。该研究结果从分子水平揭示了眼前段组织，即角膜内皮细胞、晶体上皮细胞和虹膜组织均具有合成PAI-1蛋白酶的功能，而由虹膜组织和所释放的PAI-1蛋白酶可能是存在于眼房水内的PAI-1蛋白酶的一个重要来源；这为系统深入探讨PAI-1蛋白酶与白内障术后房水内纤维蛋白反应的出现和后囊膜混浊的形成的相关性研究，奠定了重要的基础。
, 百拇医药
*本课题获国家自然科研基金资助(基金编号39270707)
参考文献
[1] Sprengers ED, Kluft C. Plasminogen activator inhibitors. Blood, 1987,69:381-387.
[2] Wang Y, Taylor DM, Smalley DM, et al. Increased basal levels of free plasminogen activator activity found in human aqueous humor. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1994,35:3561-3566.
[3] Juhan-Vague I, Alessi MC. Plasminogen activator inhibitor 1 and atherothrombosis. Thromb Haemost, 1993,70:138-143.
(收稿：1998-03-05 修回：1998-08-05), http://www.100md.com
单位：陆道炎 王丽天 陈才根(200092 上海第二医科大学附属新华医院眼科)；吴强(研究生，现在上海市第六人民医院眼科，200233)
关键词：
中华眼科杂志990128 纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)是纤溶酶原激活物(plasminogen activators, PAs)特异的生理抑制剂；它可通过抑制PAs对纤溶酶原的激活而发挥其重要的生物学作用[1]。近年国外及我们的研究已发现在人眼房水内存在蛋白质降解-蛋白质降解抑制的PAI-1-PAs酶反应系统[2]，但有关眼房水内PAI-1蛋白酶是否由眼前段组织释放而来，目前国内外尚未进行研究。我们应用敏感的分子生物学技术对眼前段组织的基因转录物质进行研究，以获取PAI-1蛋白酶在眼房水内存在的客观依据。
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一、材料和方法
1.主要试剂和仪器：主要试剂：鼠白血病病毒反转录酶(M-MLV)(美国Gibco Brl公司产品)，dNTP、随机引物、Tag酶、RNsin(美国Promega公司产品)。主要仪器：聚合酶链反应仪(PERKIN ELMER 480美国产)，计算机图像分析仪(Image Analysis System德国产)，紫外分光光度仪(Ultrospec 300，瑞典 Pharmacia Biotech 产品)。
2.方法：
(1)组织标本的制备及RNA的提取：正常新西兰白兔3只，体重2.5～3.0 kg。在显微镜操作下，分别将3只兔眼的角膜经板层切除后，剪取剩余角膜、虹膜和晶体囊膜组织，用匀浆器粉碎成组织匀浆，依次加入RNA快速提取试剂、氯仿-异丙醇进行提取。所提取的9份RNA标本，经紫外分光光度仪测定，其吸光度(A)260 nm/(A)280 nm比值为1.70～1.94。
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(2)组织细胞中的mRNA逆反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerse chain reaction):
引物序列：PAI-1(约360bp)
上游：5′ATG-GAA-TTC-CCG-TGG-AAC-AAG-AAT-GAG-ATC-AG 3′
下游：3′GAG-ACA-CGG-GTA-CTA-CCG-AGT 5′
β-actin(828bp)
上游：5′ATC-TGG-CAC-CAC-CTT-CTA-CAA-TGA-GCT-GC 3′
下游：3′CGT-CTA-CAC-CTA-GTC-GTT-CGT-CCT-CAT-ACT-GC 5′
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在20μl反应体系中加有随机引物、RNsin、待测组织细胞RNA、10 mmol/L dNTP、 M-MLV, 37℃下放置60分钟，然后升高温度至90℃下5分钟，进行逆反转录；再将PAI-1和β-actin cDNA反转录产物各10 μl分别加入包含有25 mmol/L MgCl2，10 mmol/L dNTP,上、下引物，Tag酶的反应体系中(总量为50 μl)，在聚合酶链反应仪上分别进行28和30次循环扩增；其最终产物加入1%琼脂糖凝胶加样槽中电泳，溴乙锭染色，摄片，计算机图像分析仪进行吸光度(A)扫描测定。
二、结果
3只兔眼角膜内皮细胞、晶体上皮细胞、虹膜组织的基因转录产物均显示出约360 bp和828 bp长度的单一条带，但360 bp条带的吸光度(A)值各不相同，以虹膜组织的最高，晶体上皮细胞次之，角膜内皮细胞最低(表1)。
表1 3只兔眼前段各组织PAI-1 mRNA表达的吸光度(A)值分析 组织类型
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PAI-1吸光度(A)值
(
±s)β-actin吸光度(A)值
(
±s)比值
角膜内皮细胞
2.46±1.75
3.23±0.89
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0.76
晶体上皮细胞
3.13±0.93
2.83±0.88
1.10
虹膜组织
3.91±1.87
3.14±1.24
1.24
三、讨论
PAI-1是属于丝氨酸类的一种蛋白酶，具有特异快速抑制PAs的活性，对PAs所涉及的机体内纤溶、组织修复、排卵和肿瘤的生长、转移等生理、病理过程起到重要的调节作用[1]。PAI-1水平的升高可导致机体内纤维蛋白的清除作用降低，而近10年的研究表明，PAI-1还是一个调节细胞外基质蛋白代谢的重要蛋白酶[3]。
, 百拇医药
近年Wang和我们的研究已发现,在正常人眼房水中存在有PAI-1蛋白酶，其含量及活性比血液中的低,但它可对生理状态下眼房水中纤溶系统-蛋白质凝固系统的动态平衡起到维持作用[2]。但有关这些研究均是直接对术中所提取的眼房水进行检测，标本易于受到血液的污染，而导致假阳性结果。因此，为确定PAI-1在眼房水中存在的客观性，我们应用先进而敏感的分子生物学技术，首次对正常兔眼的角膜内皮细胞、晶体上皮细胞和虹膜组织的基因表达产物mRNA进行体外逆反转录、扩增，并以各组织都一致表达的β-actin作为内参照进行半定量研究，发现在兔眼角膜内皮细胞、晶体上皮细胞、虹膜组织中均有PAI-1的 mRNA表达，表达的量以虹膜组织最高，晶体上皮细胞次之，角膜内皮细胞最低。该研究结果从分子水平揭示了眼前段组织，即角膜内皮细胞、晶体上皮细胞和虹膜组织均具有合成PAI-1蛋白酶的功能，而由虹膜组织和所释放的PAI-1蛋白酶可能是存在于眼房水内的PAI-1蛋白酶的一个重要来源；这为系统深入探讨PAI-1蛋白酶与白内障术后房水内纤维蛋白反应的出现和后囊膜混浊的形成的相关性研究，奠定了重要的基础。
, 百拇医药
*本课题获国家自然科研基金资助(基金编号39270707)
参考文献
[1] Sprengers ED, Kluft C. Plasminogen activator inhibitors. Blood, 1987,69:381-387.
[2] Wang Y, Taylor DM, Smalley DM, et al. Increased basal levels of free plasminogen activator activity found in human aqueous humor. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1994,35:3561-3566.
[3] Juhan-Vague I, Alessi MC. Plasminogen activator inhibitor 1 and atherothrombosis. Thromb Haemost, 1993,70:138-143.
(收稿：1998-03-05 修回：1998-08-05), http://www.100md.com