视网膜色素上皮移植细胞超微结构的观察
作者：李光辉 吴乐正 高汝龙 吴德正
单位：李光辉(510515 广州，第一军医大学附属南方医院眼科)；吴乐正 高汝龙 吴德正(中山医科大学中山眼科中心)
关键词：眼上皮色素；移植
中华眼科杂志990115 【摘要】 目的 观察视网膜色素上皮移植细胞的超微结构，为临床应用提供实验基础。方法 取有色兔眼球后段，去除视网膜的神经上皮层，获得视网膜色素上皮细胞作为移植的供体细胞。以10只无色兔为移植的受体，内路法将供体色素上皮细胞移植到视网膜下腔，电镜观察移植细胞的超微结构。结果 移植的10只眼，细胞成功移植到视网膜下腔，可见移植细胞贴附于受体的Bruch膜并形成基底内褶，细胞间紧密连接，细胞内可见吞噬体。结论 内路法是一种确实可行的视网膜色素上皮移植方法，移植后的细胞可存活进行新陈代谢，形成一系列的正常超微结构。
The study of ultrastructure of retinal pigment epithelium of transplantation
, 百拇医药
LI Guanghui*, WU Lezheng, GAO Rulong, et al.
*Department of Ophthalmology, The First Military University of Medical Sciences, Guangzhou 510515
【Abstract】 Objective To investigate the ultrastructure of retinal pigment epithelium (RPE) for the base of clinical application. Methods Pigmented rabbit RPE was transplanted to the subretinal space of 10 unpigmented rabbits by internal route. The ultrastructure of transplanted RPE cells were observed by electron microscopy. Results The transplantation of RPE was successful. It was shown that the transplanted cells had polarity and attached to Bruch's membrane to form basal infoldings, and the relationships between transplanted cells and the host photoreceptors were also seen. Conclusions The internal approach is a practical and useful method for transplantation of RPE. The transplanted RPE can vitalize, perform metabolism and form some normal ultrastructure.
, 百拇医药
【Key words】 Retinal pigment epithelium Transplantation
视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)具有重要的生理作用，与其有关的疾病是致盲的重要眼病之一。视网膜色素上皮移植是近年来颇受关注的研究内容，期望移植健康的细胞替代病变的细胞，为某些眼病的治疗奠定基础。
材料与方法
一、RPE细胞供体的准备
取有色兔眼球，沿角膜缘后2～3 mm环形剪开眼球壁，去除角膜、晶体、玻璃体。分离视网膜神经层，暴露视网膜的色素上皮层。用无菌生理盐水轻轻冲洗所得眼杯，用棉签吸干。加0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)于眼杯中，放入37℃温箱中消化30分钟，倾倒眼杯中的消化液，加1～2ml胎牛血清终止消化。用玻璃吸管轻轻吹打视网膜色素上皮层，使RPE细胞脱落。收集含脱落的RPE细胞的悬液，放于玻璃试管中，常温下800 r/min离心10分钟。倾倒离心后上清液，保留试管底部的细胞团块，加50～80μl不含Ca++、Mg++的平衡盐液，摇匀，细胞密度约为3 000～5 000个/μl，试管存放在含冰块的烧杯中，作细胞移植用。
, http://www.100md.com
二、内路法RPE移植
新西兰纯种无色素兔10只眼，托品酰胺点眼散瞳，以氯胺酮50 mg/kg肌注麻醉，开睑器开睑，缝线固定上、下直肌。在上直肌两侧剪开分离球结膜暴露巩膜，用9号针头于角巩缘后3 mm处做2个巩膜切口，分别为导光纤维入口及注射针入口。调节手术显微镜焦点，看清导光纤维头注射针头及视网膜，确定视乳头部位，在视乳头旁2～3 PD处，注射针头贴近视网膜表面，迅速推进加样器中的平衡盐液，制造一视网膜脱离，显微镜下可见到半球形的视网膜神经层的隆起，退出导光纤维及注射针头。用微量注射器抽吸5～10 μl的RPE细胞悬液固定于样品推进器上，再次接通导光纤维，分别由巩膜的两切口进入到玻璃体腔，在手术显微镜下寻找已经隆起的视网膜脱离区，视网膜下注射针头插入到视网膜下腔注入移植的细胞。
三、透射电镜观察
切取一小部分移植区的视网膜，以2.5%戊二醛液固定24小时以上，1%锇酸(osmic acid)后固定1小时；逐次酒精(60%、70%、80%、90%、95%、100%)脱水，以Epon 812包埋及做半薄切片定位后再做超薄切片，乙酸铅和醋酸铀染色后行电镜观察。
, 百拇医药
结果
一、术后10、20天电镜所见
受体的RPE细胞不含粗大的黑色颗粒，含黑色素颗粒的移植RPE细胞完全贴附在Bruch膜上，在基底部形成内褶，顶端可见丰富的微绒毛，细胞间形成间隙连接和紧密连接(图1～3)。
图1 黑箭头示Bruch膜及基底部内褶，白箭头示移植细胞间的连接 ×3 900
图2 为图1中细胞间连接的放大图像 ×15 500
, 百拇医药
图3 为新西兰纯种无色兔
RPE细胞，其中不含黑色的
粗大颗粒，以此可与移植的
RPE鉴别 ×5 200
二、术后40天电镜所见
单层色素上皮细胞排列于Bruch膜上，感光细胞外段与移植RPE细胞形成正常的相嵌关系，并包裹视细胞的外节盘膜，移植的RPE细胞核偏于基底一侧，细胞间形成间隙连接和紧密连接(图4，5)。
图4 黑箭头示感光细胞的外段膜盘结构，白箭头示细胞间的连接 ×3 900
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图5 箭头示图4中细胞连接的放大 ×21 000
三、术后90天电镜所见
移植的RPE细胞中的黑色颗粒偏于顶端一侧，与感光细胞外段相贴，细胞内可见吞噬视细胞外段的吞噬次级溶酶体(图6)。
图6 箭头示RPE细胞中吞噬小体 ×15 500
讨论 80年代中期，一系列报道表明，RPE细胞移植到RCS(royal college of surgeon)鼠的视网膜下，可阻止感光细胞的变性坏死、挽救感光细胞，为未来眼底病的治疗带来希望[1-3]。本研究取原始的含色素颗粒的RPE细胞作为供体，术后容易与不含黑色颗粒的受体RPE细胞区别。
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一、移植术后不同时期的RPE存活
本研究对移植术后的RPE细胞进行了连续的观察，术后10天、20天移植的细胞已紧密贴附于Bruch膜上，彼此连接形成单细胞层，两个时间组之间无明显差异；术后40天除具有上述正常的结构外，移植细胞顶端已嵌入感光细胞的外段，但这一结构形成的时间长于其他的报道[4]，原因尚不清楚。术后90天移植的RPE细胞贴附于Bruch膜上，大量的基底内褶形成，细胞侧膜间彼此连接形成正常的结构关系，表明术后3个月移植的RPE细胞存活良好。Gouras等[4]曾观察到术后5个月移植细胞仍存活，表明移植的RPE细胞可在较长时间内存活。
二、移植RPE与Bruch膜的关系
移植的RPE细胞能否贴附于Bruch膜上形成单细胞层是一个重要问题。本研究结果显示，移植的细胞可贴附于Bruch膜上并与之形成大量的基底部内褶，而基底部内褶是RPE与脉络膜之间进行物质交换的结构基础，有助于扩大与脉络膜之间的交换面积。Gouras等[4]和El Dirini等[5]的结果中移植的细胞未完全贴附于Bruch膜上，基底部内褶短少，这可能与使用培养的细胞为供体有关，因为培养的RPE细胞基底部内褶及顶端微绒毛均比原始的RPE细胞少，原因尚不清楚。
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三、移植RPE与视网膜神经层的关系
移植的RPE细胞最根本的目的之一是挽救感光细胞的功能，保持外节的不断更新，这也是正常RPE细胞的主要功能之一。国外早期研究因采用完全去除视网膜神经层的方法，不能对此进行观察[1]，本研究移植40天后感光细胞外段与移植细胞的顶端微绒毛形成相嵌结构；移植90天后可见感光细胞的外段盘膜被移植细胞吞噬。证明移植细胞不仅能存活而且能行使新陈代谢的功能，这也是移植的RPE细胞挽救感光细胞的基础。
视网膜色素上皮移植是近年来开展的眼科重大研究课题之一，尽管取得了许多进展，但也存在不少问题亟待解决，如RPE细胞如何有序地排列于Bruch膜上、移植排斥反应、如何清除原位的RPE细胞等一系列问题，目前均不十分清楚，有待进一步探讨解决。
参考文献
[1] Gouras P, Flood MT, Kjedbye H, et al. Transplantation of cultured human retinal epithelium to Bruch′s membrane of the owl monkey′s eye. Curr Eye Res,1985,4:253-265.
, http://www.100md.com
[2] Li L, Turner JE. Inherited retinal dystrophy in the RCS rat:prevention of photoreceptor degenerations by pigment epithelial cell transplantation. Exp Eye Res, 1988,47:911-917.
[3] Lane C, Boulton M, Marshall J. Transplantation of retinal pigment epithelium using a pars plana approach. Eye, 1989,3:27-32.
[4] Gouras P, Lopez R, Brittis M, et al. The ultrastructure of transplanted rabbit retinal epithelium. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 1992,230:468-475.
[5] El Dirini AA, Wang HM, Qgden TE, et al. Retinal pigment epithelium implantation in the rabbit:technique and morphology. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 1992, 230:292-297.
(收稿：1998-02-16 修回：1998-09-26), 百拇医药
单位：李光辉(510515 广州，第一军医大学附属南方医院眼科)；吴乐正 高汝龙 吴德正(中山医科大学中山眼科中心)
关键词：眼上皮色素；移植
中华眼科杂志990115 【摘要】 目的 观察视网膜色素上皮移植细胞的超微结构，为临床应用提供实验基础。方法 取有色兔眼球后段，去除视网膜的神经上皮层，获得视网膜色素上皮细胞作为移植的供体细胞。以10只无色兔为移植的受体，内路法将供体色素上皮细胞移植到视网膜下腔，电镜观察移植细胞的超微结构。结果 移植的10只眼，细胞成功移植到视网膜下腔，可见移植细胞贴附于受体的Bruch膜并形成基底内褶，细胞间紧密连接，细胞内可见吞噬体。结论 内路法是一种确实可行的视网膜色素上皮移植方法，移植后的细胞可存活进行新陈代谢，形成一系列的正常超微结构。
The study of ultrastructure of retinal pigment epithelium of transplantation
, 百拇医药
LI Guanghui*, WU Lezheng, GAO Rulong, et al.
*Department of Ophthalmology, The First Military University of Medical Sciences, Guangzhou 510515
【Abstract】 Objective To investigate the ultrastructure of retinal pigment epithelium (RPE) for the base of clinical application. Methods Pigmented rabbit RPE was transplanted to the subretinal space of 10 unpigmented rabbits by internal route. The ultrastructure of transplanted RPE cells were observed by electron microscopy. Results The transplantation of RPE was successful. It was shown that the transplanted cells had polarity and attached to Bruch's membrane to form basal infoldings, and the relationships between transplanted cells and the host photoreceptors were also seen. Conclusions The internal approach is a practical and useful method for transplantation of RPE. The transplanted RPE can vitalize, perform metabolism and form some normal ultrastructure.
, 百拇医药
【Key words】 Retinal pigment epithelium Transplantation
视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)具有重要的生理作用，与其有关的疾病是致盲的重要眼病之一。视网膜色素上皮移植是近年来颇受关注的研究内容，期望移植健康的细胞替代病变的细胞，为某些眼病的治疗奠定基础。
材料与方法
一、RPE细胞供体的准备
取有色兔眼球，沿角膜缘后2～3 mm环形剪开眼球壁，去除角膜、晶体、玻璃体。分离视网膜神经层，暴露视网膜的色素上皮层。用无菌生理盐水轻轻冲洗所得眼杯，用棉签吸干。加0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)于眼杯中，放入37℃温箱中消化30分钟，倾倒眼杯中的消化液，加1～2ml胎牛血清终止消化。用玻璃吸管轻轻吹打视网膜色素上皮层，使RPE细胞脱落。收集含脱落的RPE细胞的悬液，放于玻璃试管中，常温下800 r/min离心10分钟。倾倒离心后上清液，保留试管底部的细胞团块，加50～80μl不含Ca++、Mg++的平衡盐液，摇匀，细胞密度约为3 000～5 000个/μl，试管存放在含冰块的烧杯中，作细胞移植用。
, http://www.100md.com
二、内路法RPE移植
新西兰纯种无色素兔10只眼，托品酰胺点眼散瞳，以氯胺酮50 mg/kg肌注麻醉，开睑器开睑，缝线固定上、下直肌。在上直肌两侧剪开分离球结膜暴露巩膜，用9号针头于角巩缘后3 mm处做2个巩膜切口，分别为导光纤维入口及注射针入口。调节手术显微镜焦点，看清导光纤维头注射针头及视网膜，确定视乳头部位，在视乳头旁2～3 PD处，注射针头贴近视网膜表面，迅速推进加样器中的平衡盐液，制造一视网膜脱离，显微镜下可见到半球形的视网膜神经层的隆起，退出导光纤维及注射针头。用微量注射器抽吸5～10 μl的RPE细胞悬液固定于样品推进器上，再次接通导光纤维，分别由巩膜的两切口进入到玻璃体腔，在手术显微镜下寻找已经隆起的视网膜脱离区，视网膜下注射针头插入到视网膜下腔注入移植的细胞。
三、透射电镜观察
切取一小部分移植区的视网膜，以2.5%戊二醛液固定24小时以上，1%锇酸(osmic acid)后固定1小时；逐次酒精(60%、70%、80%、90%、95%、100%)脱水，以Epon 812包埋及做半薄切片定位后再做超薄切片，乙酸铅和醋酸铀染色后行电镜观察。
, 百拇医药
结果
一、术后10、20天电镜所见
受体的RPE细胞不含粗大的黑色颗粒，含黑色素颗粒的移植RPE细胞完全贴附在Bruch膜上，在基底部形成内褶，顶端可见丰富的微绒毛，细胞间形成间隙连接和紧密连接(图1～3)。
图1 黑箭头示Bruch膜及基底部内褶，白箭头示移植细胞间的连接 ×3 900
图2 为图1中细胞间连接的放大图像 ×15 500
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图3 为新西兰纯种无色兔
RPE细胞，其中不含黑色的
粗大颗粒，以此可与移植的
RPE鉴别 ×5 200
二、术后40天电镜所见
单层色素上皮细胞排列于Bruch膜上，感光细胞外段与移植RPE细胞形成正常的相嵌关系，并包裹视细胞的外节盘膜，移植的RPE细胞核偏于基底一侧，细胞间形成间隙连接和紧密连接(图4，5)。
图4 黑箭头示感光细胞的外段膜盘结构，白箭头示细胞间的连接 ×3 900
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图5 箭头示图4中细胞连接的放大 ×21 000
三、术后90天电镜所见
移植的RPE细胞中的黑色颗粒偏于顶端一侧，与感光细胞外段相贴，细胞内可见吞噬视细胞外段的吞噬次级溶酶体(图6)。
图6 箭头示RPE细胞中吞噬小体 ×15 500
讨论 80年代中期，一系列报道表明，RPE细胞移植到RCS(royal college of surgeon)鼠的视网膜下，可阻止感光细胞的变性坏死、挽救感光细胞，为未来眼底病的治疗带来希望[1-3]。本研究取原始的含色素颗粒的RPE细胞作为供体，术后容易与不含黑色颗粒的受体RPE细胞区别。
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一、移植术后不同时期的RPE存活
本研究对移植术后的RPE细胞进行了连续的观察，术后10天、20天移植的细胞已紧密贴附于Bruch膜上，彼此连接形成单细胞层，两个时间组之间无明显差异；术后40天除具有上述正常的结构外，移植细胞顶端已嵌入感光细胞的外段，但这一结构形成的时间长于其他的报道[4]，原因尚不清楚。术后90天移植的RPE细胞贴附于Bruch膜上，大量的基底内褶形成，细胞侧膜间彼此连接形成正常的结构关系，表明术后3个月移植的RPE细胞存活良好。Gouras等[4]曾观察到术后5个月移植细胞仍存活，表明移植的RPE细胞可在较长时间内存活。
二、移植RPE与Bruch膜的关系
移植的RPE细胞能否贴附于Bruch膜上形成单细胞层是一个重要问题。本研究结果显示，移植的细胞可贴附于Bruch膜上并与之形成大量的基底部内褶，而基底部内褶是RPE与脉络膜之间进行物质交换的结构基础，有助于扩大与脉络膜之间的交换面积。Gouras等[4]和El Dirini等[5]的结果中移植的细胞未完全贴附于Bruch膜上，基底部内褶短少，这可能与使用培养的细胞为供体有关，因为培养的RPE细胞基底部内褶及顶端微绒毛均比原始的RPE细胞少，原因尚不清楚。
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三、移植RPE与视网膜神经层的关系
移植的RPE细胞最根本的目的之一是挽救感光细胞的功能，保持外节的不断更新，这也是正常RPE细胞的主要功能之一。国外早期研究因采用完全去除视网膜神经层的方法，不能对此进行观察[1]，本研究移植40天后感光细胞外段与移植细胞的顶端微绒毛形成相嵌结构；移植90天后可见感光细胞的外段盘膜被移植细胞吞噬。证明移植细胞不仅能存活而且能行使新陈代谢的功能，这也是移植的RPE细胞挽救感光细胞的基础。
视网膜色素上皮移植是近年来开展的眼科重大研究课题之一，尽管取得了许多进展，但也存在不少问题亟待解决，如RPE细胞如何有序地排列于Bruch膜上、移植排斥反应、如何清除原位的RPE细胞等一系列问题，目前均不十分清楚，有待进一步探讨解决。
参考文献
[1] Gouras P, Flood MT, Kjedbye H, et al. Transplantation of cultured human retinal epithelium to Bruch′s membrane of the owl monkey′s eye. Curr Eye Res,1985,4:253-265.
, http://www.100md.com
[2] Li L, Turner JE. Inherited retinal dystrophy in the RCS rat:prevention of photoreceptor degenerations by pigment epithelial cell transplantation. Exp Eye Res, 1988,47:911-917.
[3] Lane C, Boulton M, Marshall J. Transplantation of retinal pigment epithelium using a pars plana approach. Eye, 1989,3:27-32.
[4] Gouras P, Lopez R, Brittis M, et al. The ultrastructure of transplanted rabbit retinal epithelium. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 1992,230:468-475.
[5] El Dirini AA, Wang HM, Qgden TE, et al. Retinal pigment epithelium implantation in the rabbit:technique and morphology. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 1992, 230:292-297.
(收稿：1998-02-16 修回：1998-09-26), 百拇医药