正常成人视乳头筛板细胞外基质的免疫组化研究
作者：李杨 王元申 徐亮 刘磊
单位：李杨 徐亮(100730 北京市眼科研究所)；王元申(首都医科大学神经科学研究所)；刘磊(北京同仁医院眼科)
关键词：视盘；细胞外基质
中华眼科杂志990114 【摘要】 目的 用免疫组化法研究正常成人视乳头筛板细胞外基质的结构组成和分布。方法 用免疫过氧化酶法(ABC法)观察7例(14只眼)正常成人眼筛板中，Ⅳ型胶原蛋白、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)和层连接蛋白(laminin，LN)的分布。结果 正常成人筛板中存在大量Ⅳ型胶原蛋白和层连接蛋白，纤维连接蛋白仅在血管处呈阳性染色，筛板中无阳性染色。结论 筛板是中枢神经系统的一种特殊组织， 由类似基底膜样物质组成，赋予筛板弹性和基底膜的机械稳定性。
The extracellular matrix of optic nerve head in normal human adult
, http://www.100md.com
LI Yang*, WANG Yuanshen, XU Liang, et al.
*Beijing Ophthalmic Institute, Beijing 100730
【Abstract】 Objective To demonstrate the macromolecular components of extracellular matrix of lamina cribrosa from young human donors. Methods Immunoperoxidase (ABC) staining method was used to investigate the distribution of collagen type IV, laminin and fibronectin in the lamina cribrosa of 7 pairs of normal human eyes. Results There was a large amount of collagen type IV and laminin in the cribrosa plates, but no positive staining of fibronectin in them. The positive staining of fibronectin only existed at the blood vessel region. Conclusion The lamina cribrosa contains a specialized extracellular matrix of the central nerve system made up of plates of material resembling basement membrane.
, 百拇医药
【Key words】 Optic disc Extracellular matrix
开角型青光眼是一种常见致盲眼病， 其临床表现主要为视乳头凹陷的进行性扩大和视野缺损的进行性发展。近年来的研究认为，视乳头筛板(lamina cribrosa)是青光眼视神经损害的原发部位。筛板由一系列结缔组织板(cribrosa plate)组成，这些结缔组织板排列在一起构成视神经穿出眼球的通道，其对视神经轴突有营养和支持作用。由于眼压增高对筛板造成的无论是缺血还是机械压力，均可影响轴突的代谢和传导，最终引起神经细胞的死亡。为了更好地了解开角型青光眼病程中，筛板扭曲的原因及筛板扭曲所引起的视神经损伤的机制，首先必须对筛板的结构包括其细胞外基质有足够的认识。
细胞外基质是由胶原、糖蛋白等大分子构成的复杂网状结构。不同的组织含有不同类型的胶原蛋白或糖蛋白，而表现其各自不同的理化性质。细胞外基质主要有两大类，一类为间质型，主要由Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和纤维连接蛋白(fibronectin，FN)构成，如巩膜和角膜基质；另一类为基底膜型，主要由IV型胶原蛋白、层连接蛋白(laminin，LN)、纤维连接蛋白构成。
, 百拇医药
我们采用免疫过氧化酶法，对正常成年人视乳头筛板的细胞外基质的组分进行观察。以期为今后研究开角型青光眼视乳头筛板的细胞外基质病理改变奠定基础。
材料和方法
1.一般资料：正常青年男性(年龄在20～30岁)7例(14只眼)，均来自同仁眼库。死后2～4小时，在球后2 mm处剪断视神经摘除眼球。
2.标本处理：沿视神经周围1 mm环形剪下视神经标本。置4%多聚甲醛(PFA)固定4小时。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后，常规脱水、透明、石蜡包埋。连续切片，厚度为10 μm，切片常规脱蜡、下行水化。
3.免疫过氧化酶染色(ABC法)：经上述过程后，将切片放入3%过氧化氢中10分钟，以抑制内源性过氧化物酶反应。蒸馏水冲洗后，将切片放入1%胰蛋白酶溶液中(37℃)3～4小时，进行抗原修复。切片按常规ABC法进行免疫过氧化酶染色。第一抗体分别为1∶50鼠抗人Ⅳ型胶原蛋白单克隆抗体、1∶100鼠抗人纤维连接蛋白单克隆抗体和1∶30兔抗人层连接蛋白多克隆抗体，以缓冲液代替第一抗体为阴性对照。第二抗体分别为兔抗鼠及羊抗兔抗体。实验中所用抗体、ABC试剂盒及胰蛋白酶均为美国Sigma公司产品。其余试剂为国产分析纯试剂。
, 百拇医药
结果
1.人Ⅳ型胶原蛋白免疫过氧化酶染色：正常视乳头筛板存在大量Ⅳ型胶原蛋白(图1，2)。纵切标本显示Ⅳ型胶原蛋白在筛板区呈板状、横向分布构成筛板的主体。横切面观察，IV型胶原蛋白形成一完好连续薄膜包绕筛板，高倍镜下观察在筛板核心存在细丝样阳性染色。神经束中无阳性染色。在视乳头筛板前区，只有血管处有阳性染色。在筛板后区，阳性染色物衬覆神经束，血管壁也存在阳性染色。视乳头中血管内皮基底膜作为Ⅳ型胶原蛋白阳性对照。巩膜部除血管外，无Ⅳ型胶原蛋白着染。
2.层连接蛋白(LN)的免疫过氧化酶阳性染色：其方式与Ⅳ型胶原蛋白相同(图3)。
3.纤维连接蛋白(FN)的免疫过氧化酶阳性染色：在视乳头筛板无阳性着染，但在视乳头的血管呈阳性染色(图4)。
, 百拇医药
图1 正常成人视乳头Ⅳ型胶原蛋白免疫过氧化酶染色，▲筛板前区，CP筛板，△筛板后区，S巩膜，BV血管，NB神经膜 纵切观察 ×6
图3 正常成人视乳头筛板层连接蛋白免疫过氧化酶染色 横切观察 ×6
图2 正常成人视乳头Ⅳ型胶原蛋白免疫过氧化酶染色 横切观察 ×100
, 百拇医药
图4 正常成人视乳头筛板纤维连接蛋白过氧化酶染色 纵切观察 ×12
讨论 本研究用较为敏感的免疫过氧化酶ABC法，观察正常成人视乳头筛板细胞外基质。结果表明，正常成人视乳头筛板存在大量Ⅳ型胶原蛋白和层连接蛋白，这些大分子呈薄片形式横向排列于巩膜管中。巩膜中除血管外，无这两种大分子。筛板中除血管外，无纤维连接蛋白。这与Hernandez等[1，2]和Goldbaum等[3]报告的结果一致。
Ⅳ型胶原蛋白和层连接蛋白是所有基底膜结构的两种主要成分。本研究结果表明，筛板细胞外基质中含有基底膜样物质。组织学研究发现，在视乳头筛板前区、筛板和筛板后区的神经细胞和间质型胶原之间均有一层星形胶质细胞，这些胶质细胞对胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP)呈阳性反应，筛板中基底膜大分子可能由该细胞合成[4]。
, http://www.100md.com
在筛板，基底膜样物质呈线性膜包绕筛板并由筛板表面呈条纹状延伸到筛板中心。电镜观察证实包裹筛板的胶质细胞有突起延伸到筛板中，由Ⅳ型胶原蛋白和层连接蛋白构成的基底膜包绕这些胶质细胞[5]。这种结构可能加强了筛板对神经束的固定作用，在青光眼眼压升高过程中，筛板形态发生慢性改变，上述结构分布可能使固定在筛板上的神经束扭曲，成为视神经轴浆流受阻的原因。
在筛板后区，神经束膜的细胞外基质是筛板的延续。筛板和筛板后区细胞外基质的区别是筛板的细胞外基质成分浓度高，呈板状，方向与神经垂直。基于Ⅳ型胶原蛋白和层连接蛋白的吸附特点，这两种大分子可能将神经纤维连接到胶质束膜上，对穿过的视神经轴突具有机械支持作用，并可能在胚胎神经纤维生长过程中发挥引导作用[6，7]。
由本研究结果可见，筛板不是巩膜组织的一部分，其成分构成和分布均与巩膜不同。Hernandez等[1]认为筛板是中枢神经系统的一种特殊组织，对通过其中的视神经具有营养和支持作用。
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本研究结果中，纤维连接蛋白仅在视乳头的血管呈阳性染色，筛板中无阳性染色。这与Hernandez等[1，2]报告的结果相同，但Goldbaum等[3]的免疫组化结果却发现，筛板中存在大量纤维连接蛋白阳性染色。
筛板细胞外基质分子构成的组织尽管缺少巩膜的张力强度，但具有顺应性，对眼压的波动具有回弹能力。基底膜成分中的Ⅳ型胶原蛋白，由于其分子超微结构及其在筛板中的横向分布方式，使其在筛板形成一疏松大分子网，赋予筛板弹性和基底膜层样结构的机械稳定作用。
本研究用免疫过氧化酶法观察正常成人视乳头筛板的基底膜型细胞外基质的组成和分布，为今后研究观察年龄相关的视乳头筛板细胞外基质的变化或开角型青光眼所引起的视乳头筛板的病理改变，探讨其发病机制奠定基础。
参考文献
, 百拇医药
[1] Hernandez MR, Igoe F, Neufeld AH. Extracellular matrix of the human optic nerve head. Am J Ophthalmol, 1986, 102:139-148.
[2] Hernandez MR, Luo XX, Igoe F, et al. Extracellular matrix of the human lamina cribrosa. Am J Ophthalmol, 1987, 104:567-576.
[3] Goldbaum MH, Jeng SY, Logemann R, et al. The extracellular matrix of the human optic nerve. Arch Ophthalmol, 1989, 107:1225-1231.
[4] Hernandez MR, Gong HY. Extracellular matrix of the trabecular meshwork and optic nerve head. In: Ritch R, Schields MB, Krupin T, eds. The glaucomas: basic sciences. 2nd ed. St. Louis: Mosby, 1996.230-239.
, http://www.100md.com
[5] Morrison JC, L'Hernault NL, Jerdan JA, et al. Ultrastructural location of extracellular matrix components in the optic nerve head. Arch Ophthalmol, 1989,107:123-129.
[6] Manthorpe M, Engvall E, Ruoslahti E, et al. Laminin promotes neuritic regeneration from cultured peripheral and central neurons. J Cell Biol, 1983,97:1882-1890.
[7] Lander AD, Fujii DK, Reichardt LF. Purification of a factor that promotes neurite outgrowth: isolation of laminin and associated molecules. J Cell Bilo, 1985,101:898-913.
(收稿：1998-01-24 修回：1998-09-28), 百拇医药
单位：李杨 徐亮(100730 北京市眼科研究所)；王元申(首都医科大学神经科学研究所)；刘磊(北京同仁医院眼科)
关键词：视盘；细胞外基质
中华眼科杂志990114 【摘要】 目的 用免疫组化法研究正常成人视乳头筛板细胞外基质的结构组成和分布。方法 用免疫过氧化酶法(ABC法)观察7例(14只眼)正常成人眼筛板中，Ⅳ型胶原蛋白、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)和层连接蛋白(laminin，LN)的分布。结果 正常成人筛板中存在大量Ⅳ型胶原蛋白和层连接蛋白，纤维连接蛋白仅在血管处呈阳性染色，筛板中无阳性染色。结论 筛板是中枢神经系统的一种特殊组织， 由类似基底膜样物质组成，赋予筛板弹性和基底膜的机械稳定性。
The extracellular matrix of optic nerve head in normal human adult
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LI Yang*, WANG Yuanshen, XU Liang, et al.
*Beijing Ophthalmic Institute, Beijing 100730
【Abstract】 Objective To demonstrate the macromolecular components of extracellular matrix of lamina cribrosa from young human donors. Methods Immunoperoxidase (ABC) staining method was used to investigate the distribution of collagen type IV, laminin and fibronectin in the lamina cribrosa of 7 pairs of normal human eyes. Results There was a large amount of collagen type IV and laminin in the cribrosa plates, but no positive staining of fibronectin in them. The positive staining of fibronectin only existed at the blood vessel region. Conclusion The lamina cribrosa contains a specialized extracellular matrix of the central nerve system made up of plates of material resembling basement membrane.
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【Key words】 Optic disc Extracellular matrix
开角型青光眼是一种常见致盲眼病， 其临床表现主要为视乳头凹陷的进行性扩大和视野缺损的进行性发展。近年来的研究认为，视乳头筛板(lamina cribrosa)是青光眼视神经损害的原发部位。筛板由一系列结缔组织板(cribrosa plate)组成，这些结缔组织板排列在一起构成视神经穿出眼球的通道，其对视神经轴突有营养和支持作用。由于眼压增高对筛板造成的无论是缺血还是机械压力，均可影响轴突的代谢和传导，最终引起神经细胞的死亡。为了更好地了解开角型青光眼病程中，筛板扭曲的原因及筛板扭曲所引起的视神经损伤的机制，首先必须对筛板的结构包括其细胞外基质有足够的认识。
细胞外基质是由胶原、糖蛋白等大分子构成的复杂网状结构。不同的组织含有不同类型的胶原蛋白或糖蛋白，而表现其各自不同的理化性质。细胞外基质主要有两大类，一类为间质型，主要由Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和纤维连接蛋白(fibronectin，FN)构成，如巩膜和角膜基质；另一类为基底膜型，主要由IV型胶原蛋白、层连接蛋白(laminin，LN)、纤维连接蛋白构成。
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我们采用免疫过氧化酶法，对正常成年人视乳头筛板的细胞外基质的组分进行观察。以期为今后研究开角型青光眼视乳头筛板的细胞外基质病理改变奠定基础。
材料和方法
1.一般资料：正常青年男性(年龄在20～30岁)7例(14只眼)，均来自同仁眼库。死后2～4小时，在球后2 mm处剪断视神经摘除眼球。
2.标本处理：沿视神经周围1 mm环形剪下视神经标本。置4%多聚甲醛(PFA)固定4小时。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后，常规脱水、透明、石蜡包埋。连续切片，厚度为10 μm，切片常规脱蜡、下行水化。
3.免疫过氧化酶染色(ABC法)：经上述过程后，将切片放入3%过氧化氢中10分钟，以抑制内源性过氧化物酶反应。蒸馏水冲洗后，将切片放入1%胰蛋白酶溶液中(37℃)3～4小时，进行抗原修复。切片按常规ABC法进行免疫过氧化酶染色。第一抗体分别为1∶50鼠抗人Ⅳ型胶原蛋白单克隆抗体、1∶100鼠抗人纤维连接蛋白单克隆抗体和1∶30兔抗人层连接蛋白多克隆抗体，以缓冲液代替第一抗体为阴性对照。第二抗体分别为兔抗鼠及羊抗兔抗体。实验中所用抗体、ABC试剂盒及胰蛋白酶均为美国Sigma公司产品。其余试剂为国产分析纯试剂。
, 百拇医药
结果
1.人Ⅳ型胶原蛋白免疫过氧化酶染色：正常视乳头筛板存在大量Ⅳ型胶原蛋白(图1，2)。纵切标本显示Ⅳ型胶原蛋白在筛板区呈板状、横向分布构成筛板的主体。横切面观察，IV型胶原蛋白形成一完好连续薄膜包绕筛板，高倍镜下观察在筛板核心存在细丝样阳性染色。神经束中无阳性染色。在视乳头筛板前区，只有血管处有阳性染色。在筛板后区，阳性染色物衬覆神经束，血管壁也存在阳性染色。视乳头中血管内皮基底膜作为Ⅳ型胶原蛋白阳性对照。巩膜部除血管外，无Ⅳ型胶原蛋白着染。
2.层连接蛋白(LN)的免疫过氧化酶阳性染色：其方式与Ⅳ型胶原蛋白相同(图3)。
3.纤维连接蛋白(FN)的免疫过氧化酶阳性染色：在视乳头筛板无阳性着染，但在视乳头的血管呈阳性染色(图4)。
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图1 正常成人视乳头Ⅳ型胶原蛋白免疫过氧化酶染色，▲筛板前区，CP筛板，△筛板后区，S巩膜，BV血管，NB神经膜 纵切观察 ×6
图3 正常成人视乳头筛板层连接蛋白免疫过氧化酶染色 横切观察 ×6
图2 正常成人视乳头Ⅳ型胶原蛋白免疫过氧化酶染色 横切观察 ×100
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图4 正常成人视乳头筛板纤维连接蛋白过氧化酶染色 纵切观察 ×12
讨论 本研究用较为敏感的免疫过氧化酶ABC法，观察正常成人视乳头筛板细胞外基质。结果表明，正常成人视乳头筛板存在大量Ⅳ型胶原蛋白和层连接蛋白，这些大分子呈薄片形式横向排列于巩膜管中。巩膜中除血管外，无这两种大分子。筛板中除血管外，无纤维连接蛋白。这与Hernandez等[1，2]和Goldbaum等[3]报告的结果一致。
Ⅳ型胶原蛋白和层连接蛋白是所有基底膜结构的两种主要成分。本研究结果表明，筛板细胞外基质中含有基底膜样物质。组织学研究发现，在视乳头筛板前区、筛板和筛板后区的神经细胞和间质型胶原之间均有一层星形胶质细胞，这些胶质细胞对胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP)呈阳性反应，筛板中基底膜大分子可能由该细胞合成[4]。
, http://www.100md.com
在筛板，基底膜样物质呈线性膜包绕筛板并由筛板表面呈条纹状延伸到筛板中心。电镜观察证实包裹筛板的胶质细胞有突起延伸到筛板中，由Ⅳ型胶原蛋白和层连接蛋白构成的基底膜包绕这些胶质细胞[5]。这种结构可能加强了筛板对神经束的固定作用，在青光眼眼压升高过程中，筛板形态发生慢性改变，上述结构分布可能使固定在筛板上的神经束扭曲，成为视神经轴浆流受阻的原因。
在筛板后区，神经束膜的细胞外基质是筛板的延续。筛板和筛板后区细胞外基质的区别是筛板的细胞外基质成分浓度高，呈板状，方向与神经垂直。基于Ⅳ型胶原蛋白和层连接蛋白的吸附特点，这两种大分子可能将神经纤维连接到胶质束膜上，对穿过的视神经轴突具有机械支持作用，并可能在胚胎神经纤维生长过程中发挥引导作用[6，7]。
由本研究结果可见，筛板不是巩膜组织的一部分，其成分构成和分布均与巩膜不同。Hernandez等[1]认为筛板是中枢神经系统的一种特殊组织，对通过其中的视神经具有营养和支持作用。
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本研究结果中，纤维连接蛋白仅在视乳头的血管呈阳性染色，筛板中无阳性染色。这与Hernandez等[1，2]报告的结果相同，但Goldbaum等[3]的免疫组化结果却发现，筛板中存在大量纤维连接蛋白阳性染色。
筛板细胞外基质分子构成的组织尽管缺少巩膜的张力强度，但具有顺应性，对眼压的波动具有回弹能力。基底膜成分中的Ⅳ型胶原蛋白，由于其分子超微结构及其在筛板中的横向分布方式，使其在筛板形成一疏松大分子网，赋予筛板弹性和基底膜层样结构的机械稳定作用。
本研究用免疫过氧化酶法观察正常成人视乳头筛板的基底膜型细胞外基质的组成和分布，为今后研究观察年龄相关的视乳头筛板细胞外基质的变化或开角型青光眼所引起的视乳头筛板的病理改变，探讨其发病机制奠定基础。
参考文献
, 百拇医药
[1] Hernandez MR, Igoe F, Neufeld AH. Extracellular matrix of the human optic nerve head. Am J Ophthalmol, 1986, 102:139-148.
[2] Hernandez MR, Luo XX, Igoe F, et al. Extracellular matrix of the human lamina cribrosa. Am J Ophthalmol, 1987, 104:567-576.
[3] Goldbaum MH, Jeng SY, Logemann R, et al. The extracellular matrix of the human optic nerve. Arch Ophthalmol, 1989, 107:1225-1231.
[4] Hernandez MR, Gong HY. Extracellular matrix of the trabecular meshwork and optic nerve head. In: Ritch R, Schields MB, Krupin T, eds. The glaucomas: basic sciences. 2nd ed. St. Louis: Mosby, 1996.230-239.
, http://www.100md.com
[5] Morrison JC, L'Hernault NL, Jerdan JA, et al. Ultrastructural location of extracellular matrix components in the optic nerve head. Arch Ophthalmol, 1989,107:123-129.
[6] Manthorpe M, Engvall E, Ruoslahti E, et al. Laminin promotes neuritic regeneration from cultured peripheral and central neurons. J Cell Biol, 1983,97:1882-1890.
[7] Lander AD, Fujii DK, Reichardt LF. Purification of a factor that promotes neurite outgrowth: isolation of laminin and associated molecules. J Cell Bilo, 1985,101:898-913.
(收稿：1998-01-24 修回：1998-09-28), 百拇医药