角膜上皮干细胞定位特征的免疫组织化学研究
作者：张 莉 赵光喜 吴惠群
单位：张 莉(原北京医科大学第三临床医院研究生，现在北京市第四医院，100062)；赵光喜 吴惠群(北京医科大学第三临床医院)
关键词：角膜；上皮；干细胞；免疫测定；免疫组织化学
角膜上皮干细胞定位特征的免疫组织化学研究 摘 要 利用单克隆抗体AE5与分化型角膜上皮细胞中角蛋白K3特异性结合，研究缺乏分化标志特征的角膜上皮干细胞定位特点，应用免疫组织化学方法显示K3阳性表达的区域分布于除角膜缘上皮基底部以外的所有角膜上皮细胞中，角膜上皮干细胞存在于角膜缘基底部AE5抗体反应阴性细胞中，即角膜干细胞位于角膜缘上皮层基底部。
分类号 R392.31
, 百拇医药
Studies on the localization of corneal epithelial stem cells/Zhang
Li...∥Ophthalmol CHN.-1999，8(1).-53～55(Department of Ophthalmology，Third Hospital，Beijing Medical University，Beijing 100083) To explore the location of corneal epithelial stem cells，A 64000-mol-wt corneal keratin designated K3 keratin，represented a marker for an advanced stage of corneal epithelial differentiation and had an epitope for AE5.AE5，a monoclonal antibody，can combine with the differentiated marker protein.We demonstrated that K3 keratin was located in all cell layers of corneal epithelium，but only in the suprabasal layers of the limbal epithelium.The fact that epithelial basal cells of central cornea，not those of the limbus，possessed K3 keratin indicated that corneal basal cells were in a more differentiated state than limbal basal cell.Limbal basal negative cells contained the least differentiated cells.Corneal epithelial stem cells were located in the corneal limbal basal cell layer.
, 百拇医药
Subject terms Cornea；Epithelium；Stem cells Immunoassay Immuno histochemistry
临床某些眼表疾病，如反复性角膜上皮剥脱、复发性翼状胬肉、化学烧伤后的纤维血管翳性混浊、蚕蚀性角膜溃疡等疾病均与角膜干细胞功能紊乱有关[1]。为探讨角膜上皮干细胞定位特点，我们进行了角膜上皮细胞角蛋白K3表达的免疫组化研究，为防治因干细胞缺乏所致的顽固性眼表疾病提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康新西兰白兔，雌雄不限，体重2.0～4.0kg。北京医科大学实验动物中心提供。
1.2 主要实验试剂与仪器
, 百拇医药
鼠抗兔角膜上皮角蛋白抗体AE5(T-T Sun实验室惠赠)；ABC试剂盒(美国Vector Lab公司产品，包括正常马血清，羊抗鼠血清，生物素-卵白素复合物，即ABC)；四盐酸3.3-二氨基联苯胺(DAB)；5%PBS-BSA；快速制片处理仪；奥林巴斯光学显微镜。
1.3 实验方法
1.3.1 角膜(包括角膜缘)组织石蜡切片制备
动物空气栓塞致死，立即摘除眼球，0.1M PBS洗净
血污。角膜缘后5mm环行切开眼球，弃后节。角膜中央部、周边部、角膜缘及其邻近结膜、巩膜组织取材，纯酒精固定48hr，二甲苯透明10min，置快速制片处理仪中，浸蜡(56℃)15min，包埋，切片，厚度5μm，37℃恒温箱中孵育。
1.3.2 ABC法免疫组织化学染色 石蜡切片经二甲苯、乙醇顺序脱蜡至水，置3%H2O2中，室温30min。0.1M PBS漂洗，5min，3次。切片置湿盒中，滴加单克隆抗体AE5(鼠抗兔抗体，5%PBS-BSA稀释，工作抗体滴度1∶100)， 原北京医科大学第三临床医院研究生，现在北京市第四医院，100062 北京医科大学第三临床医院4℃过夜。PBS漂洗，5min，3次。滴加第二抗体(羊抗鼠血清，1∶500)，反应1hr。PBS漂洗5min，3次。滴加第三抗体(ABC 1∶500)，反应1hr。PBS漂洗5min，3次。Tris-HCl(0.05M pH7.6)漂洗5min，滴新配置DAB-H2O2于组织上，光镜下观察显色，3～5min。冲去DAB终止反应，2%甲绿复染，光镜下观察细胞核呈蓝色。脱水、透明、中性树脂胶封片，光镜下观察并摄片。
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1.3.3 阴性对照组 设置特异性抗体(第一抗体)对照组，以PBS代替单克隆抗体AE5，余步骤同1.3.2
2 结果
ABC法免疫组化实验，经酶作用底物显示组织抗原阳性为棕色染色。本实验单克隆抗体AE5与角膜上皮角蛋白K3特异性结合。角膜阳性染色细胞显示K3抗原表达。经2%甲绿复染显示特异性染色物质K3位于细胞质中。
实验结果显示，上皮阳性染色区域分布于除角膜缘基底细胞以外的所有角膜上皮细胞中(包括角膜缘基底上层细胞)，对照组(特异性抗体AE5阴性对照)角膜及角膜缘上皮均阴性。
K3免疫阳性反应细胞中可见圆形或椭圆形棕色标记颗粒。随细胞层次改变，棕色标记颗粒密集程度不同，即K3表达强度不同。角膜中央部与周边部上皮，越近表层，标记颗粒越密集，越近基底，颗粒越稀疏，K3表达强度呈表层向基底层纵向减弱趋势(图1中已显示此变化规律)，中央部向角膜缘部基底上层细胞(同一水平层次)亦呈逐渐减弱趋势(图1、图2分别示角膜中央部、周边部、角膜缘部基底上层细胞K3表达强度横向水平逐渐减弱)。
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角膜缘基底部可见数个散在或排列整齐的一排阴性染色细胞，阴性染色细胞缺乏K3表达(图2中显示角膜缘基底上层上皮细胞K3阳性表达，角膜缘基底部K3表达阴性)。
3 讨论
所有自我更新的组织中都有干细胞的存在，干细胞是成熟机体中具多潜能、自我维持、细胞周期长、能够进行不对称细胞分裂、缺乏分化特征、形态和生化上处于原始幼稚阶段的细胞。干细胞是细胞自我更新、增殖和分化的源泉[1]。
角蛋白(keratin)是构成细胞支架系统中间纤维的五种蛋白组成成分之一。关于中间纤维在细胞分化中不同表达的变化已积累了相当多的事实。干细胞在生理和病理条件下向一定的功能表型转化，这种获得分化能力的细胞具有不同于干细胞角蛋白类型表达[2]，抗角质蛋白抗体检测角蛋白表达，提供细胞分化依据。
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K3(亦称64K)是分化状态较高的角膜上皮标志蛋白。Schermer等[3]研究发现，培养的角膜上皮陆续表达三对角蛋白：50/58K、48/56K、55/64K。细胞增殖多层次后，基底上层主要表达55/64K角蛋白，早期表达50/58K的“基底细胞”分离并加入生长因子刺激后，培养晚期也表达55/64K。
本实验发现，角膜上皮细胞(包括基底细胞)及角膜缘基底部以上细胞均呈K3抗原阳性表达，而角膜缘基底细胞则呈阴性表达，角膜缘上皮层基底部呈阴性染色的细胞缺乏分化标志特征蛋白表达，是上皮细胞中原始幼稚的细胞，角膜缘基底部包含了最低分化细胞。
角膜缘上皮层基底部阴性染色、不表达K3的细胞在角膜上皮增殖与分化中充当干细胞的角色，即干细胞位于角膜缘基底部，该结论与Schermer等学者实验研究结论相符[3]。
, 百拇医药
病变损伤角膜缘，造成干细胞缺乏和/或功能紊乱，导致角膜表型上皮不能维持。临床中某些眼表疾病，如眼表瘢痕性类天疱疮、Stevens-Johnson综合征、反复性角膜上皮剥脱、复发性翼状胬肉、化学烧伤后的纤维血管翳性混浊、蚕蚀性角膜溃疡、先天性无虹膜症的角膜表层病变、与戴角膜接触镜相关的眼表上皮病变、良性遗传性角膜内角化不全等均与原发或继发性干细胞缺失和/或功能紊乱有关。Kohji等[4]研究了先天性无虹膜症的眼表异常发现，在被检查的16个无虹膜症患者中，所有病例均表现角膜混浊、新生血管生长、缺乏角膜缘的Vogt栅栏结构，并通过印迹细胞学发现角膜周边部的杯状细胞显著增加。这项研究表明，无虹膜症的角膜表面有结膜上皮的侵入正是由于角膜上皮干细胞缺乏。
角膜干细胞位于角膜缘上皮层基底部为角膜缘移植手术提供了理论依据，而角膜缘移植后上皮重建，眼表改善又进一步证实了干细胞是上皮细胞增殖与修复的源泉。角膜缘移植术分自体和异体角膜缘移植，自体角膜缘移植片取自健眼，适用于病变仅累及单侧眼病例。由于有些不可避免的累及双眼的病变或对侧“健眼”有轻微的或亚临床病变，只能采取异体角膜缘移植，异体角膜缘移植片取自尸体供眼或病人亲属活体组织。
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如角膜供体取自病人亲属的活体角膜，需先作HLA相容性检查。切除病变角膜缘全周，或上下方角巩膜缘板层，去除角膜上皮及纤维血管组织，以备植床。自体或异体角膜缘移植片5～10mm，宽度2～3mm，延伸到透明角膜区0.5～1mm，并超过角膜缘外2mm。将植片缝合于植床上。术后戴治疗性软性接触镜[5]。
Copeland和Char[6]报告了结膜鳞状细胞癌切除后自体角膜缘移植重建术。Jenkins等[7]报告应用角膜缘移植术治疗慢性角膜接触镜相关角膜上皮病变。Tan等[5]报告18例自体及异体角膜缘移植，结果显示自体及异体角膜缘移植术后，两者角膜上皮完全修复时间很接近(4周内)。Kenyon和Tseng[8]研究显示曾接受角膜缘移植手术的患眼，在接下来为增视目的的板层或穿通性角膜移植手术后，眼表稳定或趋向安静，无活动性炎症，上皮完整，视力明显改善。说明成功的角膜缘移植手术，将提高角膜移植术的成功率。
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本实验利用干细胞缺乏分化标志特点，应用免疫组化技术，研究了角膜上皮干细胞定位特征，证实干细胞位于角膜缘上皮层基底部。健康角膜缘上皮组织移植，将为角膜组织带来新鲜的充满增殖活力的干细胞，角膜表面的结膜上皮和新生血管消退，角膜表型上皮重建。干细胞是角膜上皮增殖的源泉。干细胞的高增殖压形成了角膜与结膜之间的组织屏障。
4 参考文献
[1] Hall PA，Watt FM.Stem cells.The generation and maintenance of cellular diversity.Development，1989，106：619.
[2] Lauweryns B，van den Oord JJ，Vos RD，et al.A new epithelial cell type inthe human cornea.Invest Ophthalmol Vis Sci，1993，34：1983.
, http://www.100md.com
[3] Schermer A，Galvin S，Sun TT.Differentiation-related expression of a Major64K corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of cornealepithelial stem cells.The Journal of Cell Biology，1986，103：49.
[4] Nishida K，Kinoshita S，Ohashi Y，et al Ocular surface abnormalities in aniridia.Am J Ophthalmol，1995，120：368-375.
[5] Tan DTH，Ficker LA，Buckley RJ.Limbal transplantation.Ophthalmology 1996 103：29-36.
, 百拇医药
[6] Copeland RA Jr，Char DH.Limbal autograft reconstruction after conjunctive squamous cell carcinoma.Am J Ophthalmol，1990，110：412-415.
[7Jenkins CTuft SLiu Cet al.Limbal transplantation in the management of chronic contact lens-associated epitheliopathy.Eye，1993，7：629-633.
[8] Kenyon KR，Tseng SCG.Limbal autograft transplantation for ocular surface disorders.Ophthalmology，1989，90：709-723.
(1998-01-19收稿，1998-10-15修回), http://www.100md.com
单位：张 莉(原北京医科大学第三临床医院研究生，现在北京市第四医院，100062)；赵光喜 吴惠群(北京医科大学第三临床医院)
关键词：角膜；上皮；干细胞；免疫测定；免疫组织化学
角膜上皮干细胞定位特征的免疫组织化学研究 摘 要 利用单克隆抗体AE5与分化型角膜上皮细胞中角蛋白K3特异性结合，研究缺乏分化标志特征的角膜上皮干细胞定位特点，应用免疫组织化学方法显示K3阳性表达的区域分布于除角膜缘上皮基底部以外的所有角膜上皮细胞中，角膜上皮干细胞存在于角膜缘基底部AE5抗体反应阴性细胞中，即角膜干细胞位于角膜缘上皮层基底部。
分类号 R392.31
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Studies on the localization of corneal epithelial stem cells/Zhang
Li...∥Ophthalmol CHN.-1999，8(1).-53～55(Department of Ophthalmology，Third Hospital，Beijing Medical University，Beijing 100083) To explore the location of corneal epithelial stem cells，A 64000-mol-wt corneal keratin designated K3 keratin，represented a marker for an advanced stage of corneal epithelial differentiation and had an epitope for AE5.AE5，a monoclonal antibody，can combine with the differentiated marker protein.We demonstrated that K3 keratin was located in all cell layers of corneal epithelium，but only in the suprabasal layers of the limbal epithelium.The fact that epithelial basal cells of central cornea，not those of the limbus，possessed K3 keratin indicated that corneal basal cells were in a more differentiated state than limbal basal cell.Limbal basal negative cells contained the least differentiated cells.Corneal epithelial stem cells were located in the corneal limbal basal cell layer.
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Subject terms Cornea；Epithelium；Stem cells Immunoassay Immuno histochemistry
临床某些眼表疾病，如反复性角膜上皮剥脱、复发性翼状胬肉、化学烧伤后的纤维血管翳性混浊、蚕蚀性角膜溃疡等疾病均与角膜干细胞功能紊乱有关[1]。为探讨角膜上皮干细胞定位特点，我们进行了角膜上皮细胞角蛋白K3表达的免疫组化研究，为防治因干细胞缺乏所致的顽固性眼表疾病提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康新西兰白兔，雌雄不限，体重2.0～4.0kg。北京医科大学实验动物中心提供。
1.2 主要实验试剂与仪器
, 百拇医药
鼠抗兔角膜上皮角蛋白抗体AE5(T-T Sun实验室惠赠)；ABC试剂盒(美国Vector Lab公司产品，包括正常马血清，羊抗鼠血清，生物素-卵白素复合物，即ABC)；四盐酸3.3-二氨基联苯胺(DAB)；5%PBS-BSA；快速制片处理仪；奥林巴斯光学显微镜。
1.3 实验方法
1.3.1 角膜(包括角膜缘)组织石蜡切片制备
动物空气栓塞致死，立即摘除眼球，0.1M PBS洗净
血污。角膜缘后5mm环行切开眼球，弃后节。角膜中央部、周边部、角膜缘及其邻近结膜、巩膜组织取材，纯酒精固定48hr，二甲苯透明10min，置快速制片处理仪中，浸蜡(56℃)15min，包埋，切片，厚度5μm，37℃恒温箱中孵育。
1.3.2 ABC法免疫组织化学染色 石蜡切片经二甲苯、乙醇顺序脱蜡至水，置3%H2O2中，室温30min。0.1M PBS漂洗，5min，3次。切片置湿盒中，滴加单克隆抗体AE5(鼠抗兔抗体，5%PBS-BSA稀释，工作抗体滴度1∶100)， 原北京医科大学第三临床医院研究生，现在北京市第四医院，100062 北京医科大学第三临床医院4℃过夜。PBS漂洗，5min，3次。滴加第二抗体(羊抗鼠血清，1∶500)，反应1hr。PBS漂洗5min，3次。滴加第三抗体(ABC 1∶500)，反应1hr。PBS漂洗5min，3次。Tris-HCl(0.05M pH7.6)漂洗5min，滴新配置DAB-H2O2于组织上，光镜下观察显色，3～5min。冲去DAB终止反应，2%甲绿复染，光镜下观察细胞核呈蓝色。脱水、透明、中性树脂胶封片，光镜下观察并摄片。
, http://www.100md.com
1.3.3 阴性对照组 设置特异性抗体(第一抗体)对照组，以PBS代替单克隆抗体AE5，余步骤同1.3.2
2 结果
ABC法免疫组化实验，经酶作用底物显示组织抗原阳性为棕色染色。本实验单克隆抗体AE5与角膜上皮角蛋白K3特异性结合。角膜阳性染色细胞显示K3抗原表达。经2%甲绿复染显示特异性染色物质K3位于细胞质中。
实验结果显示，上皮阳性染色区域分布于除角膜缘基底细胞以外的所有角膜上皮细胞中(包括角膜缘基底上层细胞)，对照组(特异性抗体AE5阴性对照)角膜及角膜缘上皮均阴性。
K3免疫阳性反应细胞中可见圆形或椭圆形棕色标记颗粒。随细胞层次改变，棕色标记颗粒密集程度不同，即K3表达强度不同。角膜中央部与周边部上皮，越近表层，标记颗粒越密集，越近基底，颗粒越稀疏，K3表达强度呈表层向基底层纵向减弱趋势(图1中已显示此变化规律)，中央部向角膜缘部基底上层细胞(同一水平层次)亦呈逐渐减弱趋势(图1、图2分别示角膜中央部、周边部、角膜缘部基底上层细胞K3表达强度横向水平逐渐减弱)。
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角膜缘基底部可见数个散在或排列整齐的一排阴性染色细胞，阴性染色细胞缺乏K3表达(图2中显示角膜缘基底上层上皮细胞K3阳性表达，角膜缘基底部K3表达阴性)。
3 讨论
所有自我更新的组织中都有干细胞的存在，干细胞是成熟机体中具多潜能、自我维持、细胞周期长、能够进行不对称细胞分裂、缺乏分化特征、形态和生化上处于原始幼稚阶段的细胞。干细胞是细胞自我更新、增殖和分化的源泉[1]。
角蛋白(keratin)是构成细胞支架系统中间纤维的五种蛋白组成成分之一。关于中间纤维在细胞分化中不同表达的变化已积累了相当多的事实。干细胞在生理和病理条件下向一定的功能表型转化，这种获得分化能力的细胞具有不同于干细胞角蛋白类型表达[2]，抗角质蛋白抗体检测角蛋白表达，提供细胞分化依据。
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K3(亦称64K)是分化状态较高的角膜上皮标志蛋白。Schermer等[3]研究发现，培养的角膜上皮陆续表达三对角蛋白：50/58K、48/56K、55/64K。细胞增殖多层次后，基底上层主要表达55/64K角蛋白，早期表达50/58K的“基底细胞”分离并加入生长因子刺激后，培养晚期也表达55/64K。
本实验发现，角膜上皮细胞(包括基底细胞)及角膜缘基底部以上细胞均呈K3抗原阳性表达，而角膜缘基底细胞则呈阴性表达，角膜缘上皮层基底部呈阴性染色的细胞缺乏分化标志特征蛋白表达，是上皮细胞中原始幼稚的细胞，角膜缘基底部包含了最低分化细胞。
角膜缘上皮层基底部阴性染色、不表达K3的细胞在角膜上皮增殖与分化中充当干细胞的角色，即干细胞位于角膜缘基底部，该结论与Schermer等学者实验研究结论相符[3]。
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病变损伤角膜缘，造成干细胞缺乏和/或功能紊乱，导致角膜表型上皮不能维持。临床中某些眼表疾病，如眼表瘢痕性类天疱疮、Stevens-Johnson综合征、反复性角膜上皮剥脱、复发性翼状胬肉、化学烧伤后的纤维血管翳性混浊、蚕蚀性角膜溃疡、先天性无虹膜症的角膜表层病变、与戴角膜接触镜相关的眼表上皮病变、良性遗传性角膜内角化不全等均与原发或继发性干细胞缺失和/或功能紊乱有关。Kohji等[4]研究了先天性无虹膜症的眼表异常发现，在被检查的16个无虹膜症患者中，所有病例均表现角膜混浊、新生血管生长、缺乏角膜缘的Vogt栅栏结构，并通过印迹细胞学发现角膜周边部的杯状细胞显著增加。这项研究表明，无虹膜症的角膜表面有结膜上皮的侵入正是由于角膜上皮干细胞缺乏。
角膜干细胞位于角膜缘上皮层基底部为角膜缘移植手术提供了理论依据，而角膜缘移植后上皮重建，眼表改善又进一步证实了干细胞是上皮细胞增殖与修复的源泉。角膜缘移植术分自体和异体角膜缘移植，自体角膜缘移植片取自健眼，适用于病变仅累及单侧眼病例。由于有些不可避免的累及双眼的病变或对侧“健眼”有轻微的或亚临床病变，只能采取异体角膜缘移植，异体角膜缘移植片取自尸体供眼或病人亲属活体组织。
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如角膜供体取自病人亲属的活体角膜，需先作HLA相容性检查。切除病变角膜缘全周，或上下方角巩膜缘板层，去除角膜上皮及纤维血管组织，以备植床。自体或异体角膜缘移植片5～10mm，宽度2～3mm，延伸到透明角膜区0.5～1mm，并超过角膜缘外2mm。将植片缝合于植床上。术后戴治疗性软性接触镜[5]。
Copeland和Char[6]报告了结膜鳞状细胞癌切除后自体角膜缘移植重建术。Jenkins等[7]报告应用角膜缘移植术治疗慢性角膜接触镜相关角膜上皮病变。Tan等[5]报告18例自体及异体角膜缘移植，结果显示自体及异体角膜缘移植术后，两者角膜上皮完全修复时间很接近(4周内)。Kenyon和Tseng[8]研究显示曾接受角膜缘移植手术的患眼，在接下来为增视目的的板层或穿通性角膜移植手术后，眼表稳定或趋向安静，无活动性炎症，上皮完整，视力明显改善。说明成功的角膜缘移植手术，将提高角膜移植术的成功率。
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本实验利用干细胞缺乏分化标志特点，应用免疫组化技术，研究了角膜上皮干细胞定位特征，证实干细胞位于角膜缘上皮层基底部。健康角膜缘上皮组织移植，将为角膜组织带来新鲜的充满增殖活力的干细胞，角膜表面的结膜上皮和新生血管消退，角膜表型上皮重建。干细胞是角膜上皮增殖的源泉。干细胞的高增殖压形成了角膜与结膜之间的组织屏障。
4 参考文献
[1] Hall PA，Watt FM.Stem cells.The generation and maintenance of cellular diversity.Development，1989，106：619.
[2] Lauweryns B，van den Oord JJ，Vos RD，et al.A new epithelial cell type inthe human cornea.Invest Ophthalmol Vis Sci，1993，34：1983.
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[3] Schermer A，Galvin S，Sun TT.Differentiation-related expression of a Major64K corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of cornealepithelial stem cells.The Journal of Cell Biology，1986，103：49.
[4] Nishida K，Kinoshita S，Ohashi Y，et al Ocular surface abnormalities in aniridia.Am J Ophthalmol，1995，120：368-375.
[5] Tan DTH，Ficker LA，Buckley RJ.Limbal transplantation.Ophthalmology 1996 103：29-36.
, 百拇医药
[6] Copeland RA Jr，Char DH.Limbal autograft reconstruction after conjunctive squamous cell carcinoma.Am J Ophthalmol，1990，110：412-415.
[7Jenkins CTuft SLiu Cet al.Limbal transplantation in the management of chronic contact lens-associated epitheliopathy.Eye，1993，7：629-633.
[8] Kenyon KR，Tseng SCG.Limbal autograft transplantation for ocular surface disorders.Ophthalmology，1989，90：709-723.
(1998-01-19收稿，1998-10-15修回), http://www.100md.com