角结膜缘色素性肿物免疫组织化学及图象分析定量测定研究
作者：李 彬 戴 京 张 勇 李辽青 孙宪丽 田玉旺 邢惠清
单位：李 彬戴京 李辽青 孙宪丽 京北京市眼科研究所，100730；张勇 北京同仁医院病理科；田玉旺邢惠清北京军区总医院病理科
关键词：痣；色素；黑变病；黑色素瘤；免疫组织化学；DNA；图象处理；计算机辅助
眼科990111 摘 要 应用自动图象分析和定量病理学技术，结合免疫组织化学染色方法，对50例角结膜缘结膜色素性肿物(结膜色素痣、黑变病、黑色素瘤)测定细胞核内DNA的含量。结果表明：结膜色素痣和黑变病经Melanoma及P53抗体染色均呈现出阴性结果，PCNA染色有少量病例为弱阳性或少量阳性着染。DNA含量测定显示，二倍体～四倍体细胞(2C～4C)分别平均占测定细胞总数的89.28%和82.09%。五倍体细胞及高异倍体细胞(5C及AN)分别平均占测定细胞总数的10
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.72%和17.91%。在结膜恶性黑色素瘤中，Melanoma及PCNA抗体染色均呈阳性表达，P53亦基本为阳性结果。DNA含量测定结果显示，2C～4C细胞仅占测定细胞总数的8.77%。而5C细胞及AN细胞则占测定细胞总数的91.23%。免疫组化染色显示出同AIAT测定分析基本相符的结果。本研究结果表明，对肿瘤病变进行细胞内DNA含量的定量测定分析，将有助于弥补普通光镜下常规病理诊断的缺陷和不足，提高病理诊断的完整性和准确性，确定病变的生物学特性和增殖活性，并可对其临床发展趋势作出较为客观的评估。
分类号 R730.2
The quantitative measurement of immunohistochemical and automatic image analysis of melanotic neoplasms in limbus/Li Bin…∥OphthalmolCHN.-1999，8(1).-38～42(Beijing Institute of Ophthalmology，Beijing 100730)
, 百拇医药
By using automatic image analysis technology(AIAT) and quantitative pathological method combined with the immunohistochemical stain，we measured DNA content of nuclear in 50 cases of limbus melanotic neoplasm (conjunctival nevus，melanosis ＆ melanoma).The results demonstrated that nevus andmelanosis showed a negative stain with antibodies of Melanoma and P53.A few cases had a weaklypositive stain or few cell was stained with PCNA.The measurement of DNA content revealed that the amount of 2C～4C respectively were 89.28% and 82.09%，5C and AN were 10.72% and 17.91%.In melanoma cases，all tumors were positively stained with antibodies of Melanoma and PCNA，most of cases had positive results with P53.The measurement of DNA showed that the amountof 2C～4C were 8.77%，5C and AN were 91.23%.The immunohistochemical stainhad a coincident result with AIAT.This study indicated that quantitative measurement of DNA content on neoplasm would be helpful to modify the disadvantages in regular pathology diagnosis and enhance perfection and correction of pathlogy diagnosis.It would also beuseful to confirm the biological property and hyperplastic activity of neoplasms and objectively evaluate the developing tendency in clinic.
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Subject terms Nevus，pigmented；Melanosis；Melanoma；Immunohistochemistry；DNA；Image proces-sing，computer assisted
角结膜缘结膜色素性肿物(结膜色素痣、黑变病、黑色素瘤)是眼科临床上比较常见的增殖性病变。作为眼科病理医师，在临床病理诊断工作中，经常会遇到对于有些处于交界性增生和生长活跃的结膜色素性病变，如何判断其生长增殖活性及良恶性程度的难题。单靠常规的光镜方法很难作出正确的诊断。本研究应用近年来发展起来的先进的自动图象分析技术(automatic image analysis technology，AIAT)，结合应用免疫组织化学研究方法，对于眼部结膜色素性病变的不同病变类型以及病变的不同阶段进行定量测定分析研究，以期利用定量病理学的技术进一步研究了解各种病变的生长增殖活性，判别病变的良恶性，从而建立病理诊断的量化指标，作为辅助常规光镜下诊断的手段，并探讨发现对临床病理诊断有价值的规律。
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1 材料和方法
1.1 材料
选用50例北京同仁医院眼科研究所病理室存档的角结膜缘色素性肿物石蜡组织块，其中包括结膜色素痣27例(交界痣15例，复合痣12例)，结膜黑变病7例，结膜恶性黑色素瘤16例进行测定分析。
1.2 方法
1.2.1 组织切片制备 组织切片制作按照常规石蜡切片方法，切片厚度为4μm；连续切片五张，以备不同的染色使用。
1.2.2 组织切片染色 分别将组织切片做常规H-E染色，Feulgen染色和三种免疫组织化学染色。
免疫组织化学抗体及染色方法：本研究中选用了三种单克隆抗体，即：Melanoma(黑色素瘤抗体)，PCNA(proliferation cell nuclear antigen增殖细胞核抗原抗体)和鼠抗人P53抗体，均为北京中山生物技术有限公司产品。本研究采用ABC酶标法，以PBS液替代一抗作为阴性对照，选用已知染色阳性的肿瘤组织切片作为阳性对照。
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1.2.3 图象分析定量测定 本研究采用武汉太阳科技发展公司生产的MPIAS-500型多媒体彩色病理图象分析系统，对病变细胞核内的DNA进行定量测量。
在光学显微镜(×40倍)下选定所要进行测定的病变组织，将光镜下的组织图象经显微摄象系统输入计算机，然后启用自动图象分析系统。首先冻结图象，对所测定组织的背底进行积分光密度测定。然后选取至少50个正常淋巴细胞进行图象测定，取其值作为正常二倍体细胞DNA含量(2C)的参照值。继而，用光标笔采集勾画出拟行测定的细胞轮廓，进行选择性修饰后，通过计算机自动数据统计系统计算出所测细胞核的积分光密度(U值＝光密度×细胞核面积)，并以U值表示细胞核DNA的相对含量，打印出直方图和分析结果。直方图横座标表示DNA含量(2C，3C～4C，5C，AN)，纵座标表示DNA含量细胞的百分比(%)。以测定细胞的平均积分光密度/淋巴细胞平均积分光密度值(DI值即DNA指数)为基值，计算出每例DNA的倍比值。
2 结果
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2.1 免疫组织化学染色结果
免疫组化染色阳性反应物呈棕黄色或棕黑色外观。
(1) Melanoma抗体染色
结膜色素痣27例中，全部呈阴性染色。
结膜黑变病7例中，阴性结果6例。
结膜黑色素瘤16例中，染色均为阳性结果。其中按染色阳性程度，(+)7例，(++)7例，(+++)2例。
(2) PCNA抗体染色
结膜色素痣27例中，色素痣部分细胞或少量细胞染色阳性者9例；弱阳性染色4例；阴性结果14例。
结膜黑变病7例中，阳性染色3例，弱阳性染色2例；阴性2例。
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结膜黑色素瘤16例中，均为阳性染色结果。其中依据阳性染色的程度，(+)者5例，(++)者11例。
(3) P53抗体染色
结膜色素痣27例中，均为阴性结果。
结膜黑变病7例中，全部染色阴性。
结膜黑色素瘤16例中，14例阳性染色，其中弱阳性者4例，2例染色阴性。
2.2 图象分析定量测定结果
27例结膜色素痣中，DNA直方图显示主峰位于整倍体细胞部分(2C～4C细胞)，分布范围在40.98%～100%之间，平均占测定细胞总数的89.28%。其中2C细胞占54.67%；3C～4C细胞占45.33%；五倍体细胞(5C)及高异倍体细胞(AN)分布范围在0～59.02%之间，平均占测定细胞总数的10.72%。
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色素痣27例中有15例交界痣，每例均含一定比例的5C细胞和AN细胞。分布范围在0.83%～59.02%之间不等，平均所占比例为20.03%。在复合痣12例中，8例含有一定比例的5C细胞或/和AN细胞，所占比例范围为1.21%～6.94%，平均占2.27%；复合痣中有4例不含5C和AN细胞，细胞成分仅为2C～4C细胞。
6例结膜黑变病中，DNA直方图的主峰位于2C～4C部分，分布范围在48.69%～100%之间，平均占测定细胞总数的82.09%。其中2C细胞占61.88%；3C～4C细胞占38.12%；5C细胞及AN细胞分布范围在0～51.31%之间，平均占测定细胞总数的17.91%。其中，有4例仅含有2C～4C细胞成分；另3例镜下表现为细胞增生活跃的病变含有不同比例的5C细胞和AN细胞，范围从9.26%～42.86%，平均为18.53%。
16例结膜黑色素瘤中，整倍体细胞(2C～4C)分布范围在0～18.97%之间，平均仅占测定细胞总数的8.77%。DNA直方图主峰位于异倍体细胞(5C及AN)部分，分布范围在81.03%～100%之间，平均占测定细胞总数的91.23%。
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以上三种病变每两两之间经统计学(X2检验)分析处理，结果显示：结膜黑色素痣与黑变病两者之间无显著性差异，而黑色素痣与黑色素瘤之间、黑变病与黑色素瘤之间均具有非常显著性差异(P<0.01)。
3 讨论
医学图像分析是先进的科学技术在医学应用的一个重要领域。近年来，在国内外眼科肿瘤研究领域中，继应用电镜进行超微结构诊断和免疫组织化学诊断技术之后，进一步开始采用先进的自动图像分析技术(AIAT)，已经初步对某些眼部恶性肿瘤，如视网膜母细胞瘤、角结膜缘上皮性肿瘤等进行定量测定分析[1～3]。但是尚无报道将AIAT技术应用于对眼部角结膜缘结膜色素性肿物进行定量分析测定的有关研究。本研究目的旨在应用先进的AIAT技术，从细胞的DNA水平进一步测定分析眼部色素性肿物，借以辅助临床病理诊断，确定病变的生长增殖活性，判别病变的良恶性，用于眼科临床帮助指导眼科医生随访及评估患者的临床预后。
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众所周知，在常规病理诊断工作中，人们对于组织和细胞的病理变化，往往用定性描述来加以诊断。然而，时常会遇到如何判断某些处于交界性增生和生长活跃病变的增殖活性及良恶性程度的棘手问题。眼部色素性新生物(结膜色素痣、黑变病)系眼科临床常见的增殖性病变，也是研究新生物良恶性以及分级诊断的良好范例，可为深入研究其它良恶性肿瘤奠定有价值的基础。而AIAT技术的问世为解决这一难题提供了切实可行的方法和依据。
用石蜡切片进行免疫组织化学染色来分析其免疫表达同DNA含量之间关系的报道很少。
Melanoma抗体是检测恶性黑色素瘤组织的一种较为特异的标记物。本研究中，全部结膜黑色素瘤病例均呈现阳性结果。结膜色素痣及结膜黑变病的病例中，除各有一例表现为仅有少量细胞弱阳性反应之外，总体上表现为阴性反应结果。同AIAT测定结果相对比，两者之间表现出相符的结果。
增殖细胞核抗原(PCNA)是近年来发现的反应细胞增殖的一种很好的标记物。特别是能用于石蜡切片，并很快地被用于肿瘤细胞的增殖活性和对预后的判定。一般认为肿瘤的分化程度越低，其增殖能力越强，恶性程度越高[4]。本研究应用PCNA抗体染色结果表明，恶性肿瘤组织的细胞增殖率明显高于良性肿瘤。全部结膜黑色素瘤病例均呈阳性染色结果。而在结膜色素痣和结膜黑变病的病例中，仅有部分病例中有部分或少量的痣细胞染色弱阳性或阳性，虽然在一定程度上反映了病变的增殖情况，但其阳性反应的程度和着染范围远不及结膜恶性黑色素瘤。经AIAT测定分析，亦证实了这一结果。本研究亦表明，PCNA在常规石蜡病理切片上能够敏感地检测肿瘤细胞的增殖状态。
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已有研究表明[5]，P53蛋白是P53基因编码的产物，经免疫组化法所表达的均为突变型P53基因蛋白。P53蛋白的过度表达同肿瘤的恶性度和恶变倾向有关。本研究结果显示，结膜黑色素瘤病例除2例外均为阳性结果。全部结膜色素痣和结膜黑变病的病例，均表现出阴性的结果。
近年来的研究表明，肿瘤细胞内DNA含量与其生物学行为密切相关，DNA倍体的异常同肿瘤的发生发展及其临床病理特性有着重要的联系，在对临床预后的估价上也具有重要作用[4，6，7]。此技术依据病变组织细胞核内物质发生的质和量的变化，可客观、量化地反映出新生物的增殖活性和生长趋势[8]，有利于判别病变的良恶性[7～9]。细胞内DNA含量与肿瘤病理因素之间的关系一直是许多研究者关注的问题之一[4，5]。文献报道，大多数实体肿瘤细胞DNA含量同病理因素密切相关；肿瘤细胞中的异倍体是恶性肿瘤特征性的标志之一，异倍体随着组织学分级的增高和恶性度的增高而增大[2，3，10]。本研究结果亦充分证实了这一论点。
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本研究结果表明，结膜色素痣中，2C～4C细胞占88.27%，5C细胞及AN细胞仅占11.73%；结膜黑变病中，2C～4C的细胞为82.08%，5C细胞及AN细胞仅占17.92%；而结膜恶性黑色素瘤的病例中，2C～4C细胞仅占8.77%，5C细胞及AN细胞的比例则高达91.23%。进一步分析结膜色素痣呈交界痣或复合痣改变的病例中，有些病变随其细胞增生活跃程度的不同，其2C～4C细胞的比例也表现出不同。光镜下病变表现为交界性增生或增生活跃外观的病变，其2C～4C细胞比例较一般良性增生的色素痣病变中所占比例明显减少，而5C细胞及AN细胞比例增加，提示该病变目前处于增生活跃状态，甚至可能有恶变趋势。
结膜黑变病中有2例光镜下诊断为生长活跃的病例，经DNA含量测定发现，其5C细胞和AN细胞含量可分别达到22.0%和42.86%。
本研究说明，有些病变尽管目前在光镜下尚不能诊断为恶性，但其生物学行为上已有增生活跃或者恶变的潜势，因为细胞中DNA异倍体的出现可以发生在明显的形态学改变之前。因而提醒眼病理医师及临床医师注意，在临床上应密切观察随诊病人。本研究结果表明，对肿瘤病变进行细胞内DNA含量的定量测定分析，将有助于弥补普通光镜下常规病理诊断的缺陷和不足，进一步确定病变的生物学特性和生长增殖活性，提高病理诊断的完整性和准确性，并可对病变的临床发展趋势作出较为客观的评估。
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本课题由北京市科干局北京市青年科技骨干培养基金资助
4 参考文献
[1] 赵进英，靳伟民，李建新，等.视网膜母细胞瘤AgNORs研究.中华眼底病杂志，1993，9：202～204.
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[3] 李 彬，李辽青，孙宪丽，等.角结膜缘上皮性肿瘤DNA含量测定对于病理诊断的意义.眼科，1996，5：48～51.
[4] 李基业，陆连荣，张双喜，等.进展期胃癌DNA含量与生物学特性和预后的关系.中华病理学杂志，1994，23：135～137.
[5] 原志庆，姜红光，许春雷，等.食管鳞状细胞癌DNA倍体异质性研究及其临床病理学意义.中华病理学杂志，1996，25：159～161.
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[6] 何乐健，李佩娟，刘淑荣，等.儿童非何杰金淋巴瘤的DNA含量和免疫表型的研究.中华病理学杂志，1995，24：282～284.
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[8] 王 东，高凤浔.增殖细胞核抗原与骨肉瘤预后的关系.中华病理学杂志，1995，24：55.
[9] 蔡建辉，蒋贻康，张玉印，等.胃肠道平滑肌肿瘤DNA含量与临床病理的关系.中华病理学杂志，1995，24：378～380.
[10] 夏潮涌.肿瘤细胞核DNA含量测定与倍体分析的现状及发展趋势.中华病理学杂志，1996，25：182～184.
(1998-02-11收稿，1998-10-08修回)
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单位：李 彬戴京 李辽青 孙宪丽 京北京市眼科研究所，100730；张勇 北京同仁医院病理科；田玉旺邢惠清北京军区总医院病理科
关键词：痣；色素；黑变病；黑色素瘤；免疫组织化学；DNA；图象处理；计算机辅助
眼科990111 摘 要 应用自动图象分析和定量病理学技术，结合免疫组织化学染色方法，对50例角结膜缘结膜色素性肿物(结膜色素痣、黑变病、黑色素瘤)测定细胞核内DNA的含量。结果表明：结膜色素痣和黑变病经Melanoma及P53抗体染色均呈现出阴性结果，PCNA染色有少量病例为弱阳性或少量阳性着染。DNA含量测定显示，二倍体～四倍体细胞(2C～4C)分别平均占测定细胞总数的89.28%和82.09%。五倍体细胞及高异倍体细胞(5C及AN)分别平均占测定细胞总数的10
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.72%和17.91%。在结膜恶性黑色素瘤中，Melanoma及PCNA抗体染色均呈阳性表达，P53亦基本为阳性结果。DNA含量测定结果显示，2C～4C细胞仅占测定细胞总数的8.77%。而5C细胞及AN细胞则占测定细胞总数的91.23%。免疫组化染色显示出同AIAT测定分析基本相符的结果。本研究结果表明，对肿瘤病变进行细胞内DNA含量的定量测定分析，将有助于弥补普通光镜下常规病理诊断的缺陷和不足，提高病理诊断的完整性和准确性，确定病变的生物学特性和增殖活性，并可对其临床发展趋势作出较为客观的评估。
分类号 R730.2
The quantitative measurement of immunohistochemical and automatic image analysis of melanotic neoplasms in limbus/Li Bin…∥OphthalmolCHN.-1999，8(1).-38～42(Beijing Institute of Ophthalmology，Beijing 100730)
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By using automatic image analysis technology(AIAT) and quantitative pathological method combined with the immunohistochemical stain，we measured DNA content of nuclear in 50 cases of limbus melanotic neoplasm (conjunctival nevus，melanosis ＆ melanoma).The results demonstrated that nevus andmelanosis showed a negative stain with antibodies of Melanoma and P53.A few cases had a weaklypositive stain or few cell was stained with PCNA.The measurement of DNA content revealed that the amount of 2C～4C respectively were 89.28% and 82.09%，5C and AN were 10.72% and 17.91%.In melanoma cases，all tumors were positively stained with antibodies of Melanoma and PCNA，most of cases had positive results with P53.The measurement of DNA showed that the amountof 2C～4C were 8.77%，5C and AN were 91.23%.The immunohistochemical stainhad a coincident result with AIAT.This study indicated that quantitative measurement of DNA content on neoplasm would be helpful to modify the disadvantages in regular pathology diagnosis and enhance perfection and correction of pathlogy diagnosis.It would also beuseful to confirm the biological property and hyperplastic activity of neoplasms and objectively evaluate the developing tendency in clinic.
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Subject terms Nevus，pigmented；Melanosis；Melanoma；Immunohistochemistry；DNA；Image proces-sing，computer assisted
角结膜缘结膜色素性肿物(结膜色素痣、黑变病、黑色素瘤)是眼科临床上比较常见的增殖性病变。作为眼科病理医师，在临床病理诊断工作中，经常会遇到对于有些处于交界性增生和生长活跃的结膜色素性病变，如何判断其生长增殖活性及良恶性程度的难题。单靠常规的光镜方法很难作出正确的诊断。本研究应用近年来发展起来的先进的自动图象分析技术(automatic image analysis technology，AIAT)，结合应用免疫组织化学研究方法，对于眼部结膜色素性病变的不同病变类型以及病变的不同阶段进行定量测定分析研究，以期利用定量病理学的技术进一步研究了解各种病变的生长增殖活性，判别病变的良恶性，从而建立病理诊断的量化指标，作为辅助常规光镜下诊断的手段，并探讨发现对临床病理诊断有价值的规律。
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1 材料和方法
1.1 材料
选用50例北京同仁医院眼科研究所病理室存档的角结膜缘色素性肿物石蜡组织块，其中包括结膜色素痣27例(交界痣15例，复合痣12例)，结膜黑变病7例，结膜恶性黑色素瘤16例进行测定分析。
1.2 方法
1.2.1 组织切片制备 组织切片制作按照常规石蜡切片方法，切片厚度为4μm；连续切片五张，以备不同的染色使用。
1.2.2 组织切片染色 分别将组织切片做常规H-E染色，Feulgen染色和三种免疫组织化学染色。
免疫组织化学抗体及染色方法：本研究中选用了三种单克隆抗体，即：Melanoma(黑色素瘤抗体)，PCNA(proliferation cell nuclear antigen增殖细胞核抗原抗体)和鼠抗人P53抗体，均为北京中山生物技术有限公司产品。本研究采用ABC酶标法，以PBS液替代一抗作为阴性对照，选用已知染色阳性的肿瘤组织切片作为阳性对照。
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1.2.3 图象分析定量测定 本研究采用武汉太阳科技发展公司生产的MPIAS-500型多媒体彩色病理图象分析系统，对病变细胞核内的DNA进行定量测量。
在光学显微镜(×40倍)下选定所要进行测定的病变组织，将光镜下的组织图象经显微摄象系统输入计算机，然后启用自动图象分析系统。首先冻结图象，对所测定组织的背底进行积分光密度测定。然后选取至少50个正常淋巴细胞进行图象测定，取其值作为正常二倍体细胞DNA含量(2C)的参照值。继而，用光标笔采集勾画出拟行测定的细胞轮廓，进行选择性修饰后，通过计算机自动数据统计系统计算出所测细胞核的积分光密度(U值＝光密度×细胞核面积)，并以U值表示细胞核DNA的相对含量，打印出直方图和分析结果。直方图横座标表示DNA含量(2C，3C～4C，5C，AN)，纵座标表示DNA含量细胞的百分比(%)。以测定细胞的平均积分光密度/淋巴细胞平均积分光密度值(DI值即DNA指数)为基值，计算出每例DNA的倍比值。
2 结果
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2.1 免疫组织化学染色结果
免疫组化染色阳性反应物呈棕黄色或棕黑色外观。
(1) Melanoma抗体染色
结膜色素痣27例中，全部呈阴性染色。
结膜黑变病7例中，阴性结果6例。
结膜黑色素瘤16例中，染色均为阳性结果。其中按染色阳性程度，(+)7例，(++)7例，(+++)2例。
(2) PCNA抗体染色
结膜色素痣27例中，色素痣部分细胞或少量细胞染色阳性者9例；弱阳性染色4例；阴性结果14例。
结膜黑变病7例中，阳性染色3例，弱阳性染色2例；阴性2例。
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结膜黑色素瘤16例中，均为阳性染色结果。其中依据阳性染色的程度，(+)者5例，(++)者11例。
(3) P53抗体染色
结膜色素痣27例中，均为阴性结果。
结膜黑变病7例中，全部染色阴性。
结膜黑色素瘤16例中，14例阳性染色，其中弱阳性者4例，2例染色阴性。
2.2 图象分析定量测定结果
27例结膜色素痣中，DNA直方图显示主峰位于整倍体细胞部分(2C～4C细胞)，分布范围在40.98%～100%之间，平均占测定细胞总数的89.28%。其中2C细胞占54.67%；3C～4C细胞占45.33%；五倍体细胞(5C)及高异倍体细胞(AN)分布范围在0～59.02%之间，平均占测定细胞总数的10.72%。
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色素痣27例中有15例交界痣，每例均含一定比例的5C细胞和AN细胞。分布范围在0.83%～59.02%之间不等，平均所占比例为20.03%。在复合痣12例中，8例含有一定比例的5C细胞或/和AN细胞，所占比例范围为1.21%～6.94%，平均占2.27%；复合痣中有4例不含5C和AN细胞，细胞成分仅为2C～4C细胞。
6例结膜黑变病中，DNA直方图的主峰位于2C～4C部分，分布范围在48.69%～100%之间，平均占测定细胞总数的82.09%。其中2C细胞占61.88%；3C～4C细胞占38.12%；5C细胞及AN细胞分布范围在0～51.31%之间，平均占测定细胞总数的17.91%。其中，有4例仅含有2C～4C细胞成分；另3例镜下表现为细胞增生活跃的病变含有不同比例的5C细胞和AN细胞，范围从9.26%～42.86%，平均为18.53%。
16例结膜黑色素瘤中，整倍体细胞(2C～4C)分布范围在0～18.97%之间，平均仅占测定细胞总数的8.77%。DNA直方图主峰位于异倍体细胞(5C及AN)部分，分布范围在81.03%～100%之间，平均占测定细胞总数的91.23%。
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以上三种病变每两两之间经统计学(X2检验)分析处理，结果显示：结膜黑色素痣与黑变病两者之间无显著性差异，而黑色素痣与黑色素瘤之间、黑变病与黑色素瘤之间均具有非常显著性差异(P<0.01)。
3 讨论
医学图像分析是先进的科学技术在医学应用的一个重要领域。近年来，在国内外眼科肿瘤研究领域中，继应用电镜进行超微结构诊断和免疫组织化学诊断技术之后，进一步开始采用先进的自动图像分析技术(AIAT)，已经初步对某些眼部恶性肿瘤，如视网膜母细胞瘤、角结膜缘上皮性肿瘤等进行定量测定分析[1～3]。但是尚无报道将AIAT技术应用于对眼部角结膜缘结膜色素性肿物进行定量分析测定的有关研究。本研究目的旨在应用先进的AIAT技术，从细胞的DNA水平进一步测定分析眼部色素性肿物，借以辅助临床病理诊断，确定病变的生长增殖活性，判别病变的良恶性，用于眼科临床帮助指导眼科医生随访及评估患者的临床预后。
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众所周知，在常规病理诊断工作中，人们对于组织和细胞的病理变化，往往用定性描述来加以诊断。然而，时常会遇到如何判断某些处于交界性增生和生长活跃病变的增殖活性及良恶性程度的棘手问题。眼部色素性新生物(结膜色素痣、黑变病)系眼科临床常见的增殖性病变，也是研究新生物良恶性以及分级诊断的良好范例，可为深入研究其它良恶性肿瘤奠定有价值的基础。而AIAT技术的问世为解决这一难题提供了切实可行的方法和依据。
用石蜡切片进行免疫组织化学染色来分析其免疫表达同DNA含量之间关系的报道很少。
Melanoma抗体是检测恶性黑色素瘤组织的一种较为特异的标记物。本研究中，全部结膜黑色素瘤病例均呈现阳性结果。结膜色素痣及结膜黑变病的病例中，除各有一例表现为仅有少量细胞弱阳性反应之外，总体上表现为阴性反应结果。同AIAT测定结果相对比，两者之间表现出相符的结果。
增殖细胞核抗原(PCNA)是近年来发现的反应细胞增殖的一种很好的标记物。特别是能用于石蜡切片，并很快地被用于肿瘤细胞的增殖活性和对预后的判定。一般认为肿瘤的分化程度越低，其增殖能力越强，恶性程度越高[4]。本研究应用PCNA抗体染色结果表明，恶性肿瘤组织的细胞增殖率明显高于良性肿瘤。全部结膜黑色素瘤病例均呈阳性染色结果。而在结膜色素痣和结膜黑变病的病例中，仅有部分病例中有部分或少量的痣细胞染色弱阳性或阳性，虽然在一定程度上反映了病变的增殖情况，但其阳性反应的程度和着染范围远不及结膜恶性黑色素瘤。经AIAT测定分析，亦证实了这一结果。本研究亦表明，PCNA在常规石蜡病理切片上能够敏感地检测肿瘤细胞的增殖状态。
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已有研究表明[5]，P53蛋白是P53基因编码的产物，经免疫组化法所表达的均为突变型P53基因蛋白。P53蛋白的过度表达同肿瘤的恶性度和恶变倾向有关。本研究结果显示，结膜黑色素瘤病例除2例外均为阳性结果。全部结膜色素痣和结膜黑变病的病例，均表现出阴性的结果。
近年来的研究表明，肿瘤细胞内DNA含量与其生物学行为密切相关，DNA倍体的异常同肿瘤的发生发展及其临床病理特性有着重要的联系，在对临床预后的估价上也具有重要作用[4，6，7]。此技术依据病变组织细胞核内物质发生的质和量的变化，可客观、量化地反映出新生物的增殖活性和生长趋势[8]，有利于判别病变的良恶性[7～9]。细胞内DNA含量与肿瘤病理因素之间的关系一直是许多研究者关注的问题之一[4，5]。文献报道，大多数实体肿瘤细胞DNA含量同病理因素密切相关；肿瘤细胞中的异倍体是恶性肿瘤特征性的标志之一，异倍体随着组织学分级的增高和恶性度的增高而增大[2，3，10]。本研究结果亦充分证实了这一论点。
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本研究结果表明，结膜色素痣中，2C～4C细胞占88.27%，5C细胞及AN细胞仅占11.73%；结膜黑变病中，2C～4C的细胞为82.08%，5C细胞及AN细胞仅占17.92%；而结膜恶性黑色素瘤的病例中，2C～4C细胞仅占8.77%，5C细胞及AN细胞的比例则高达91.23%。进一步分析结膜色素痣呈交界痣或复合痣改变的病例中，有些病变随其细胞增生活跃程度的不同，其2C～4C细胞的比例也表现出不同。光镜下病变表现为交界性增生或增生活跃外观的病变，其2C～4C细胞比例较一般良性增生的色素痣病变中所占比例明显减少，而5C细胞及AN细胞比例增加，提示该病变目前处于增生活跃状态，甚至可能有恶变趋势。
结膜黑变病中有2例光镜下诊断为生长活跃的病例，经DNA含量测定发现，其5C细胞和AN细胞含量可分别达到22.0%和42.86%。
本研究说明，有些病变尽管目前在光镜下尚不能诊断为恶性，但其生物学行为上已有增生活跃或者恶变的潜势，因为细胞中DNA异倍体的出现可以发生在明显的形态学改变之前。因而提醒眼病理医师及临床医师注意，在临床上应密切观察随诊病人。本研究结果表明，对肿瘤病变进行细胞内DNA含量的定量测定分析，将有助于弥补普通光镜下常规病理诊断的缺陷和不足，进一步确定病变的生物学特性和生长增殖活性，提高病理诊断的完整性和准确性，并可对病变的临床发展趋势作出较为客观的评估。
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本课题由北京市科干局北京市青年科技骨干培养基金资助
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(1998-02-11收稿，1998-10-08修回)
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