抗氧化剂阻抑肿瘤坏死因子诱导的U937细胞凋亡
作者：王 媛 曾凡杰 黄晓明 胡向阳 高翼之
单位：曾凡杰 黄晓明 胡向阳 高翼之(南京铁道医学院科研所)；王 媛(中国人民解放军第81医院全军肿瘤中心实验科(南京210002)
关键词：抗氧化剂；肿瘤坏死因子；凋亡；bcl-2
肿瘤990112 近几年来，细胞凋亡(apoptosis)的研究日益深入，凋亡的调控可能与细胞类型及诱发因素有关，某些因素具有普遍性。研究表明，活性氧中间体(reactive oxygen intermediates, ROI)是细胞凋亡的媒介之一，许多理化因素诱导的细胞凋亡都与之有关[1]。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)能诱发白血病U937细胞凋亡，本文探讨了抗氧化剂对TNF诱导U937细胞凋亡的生物学效应。
材料和方法
, 百拇医药
1.细胞系、化学试剂及引物 白血病U937细胞由南京铁道医学院科研所提供。寡核苷酸引物由中科院上海细胞生物学研究所合成。细胞培养试剂RPMI 1640为GIBCO公司产品，rhTNF购自Promega公司；N-乙酰-L-半胱氨酸(NAc)、维生素C、维生素E购自上海伯奥公司。
2.U937细胞培养及药物处理 采用RPMI 1640 完全培养基培养细胞，当细胞生长至对数期时加药处理。
3.细胞存活测定 采用台盼蓝拒染法(Trypan blue exclusion)。
4.透射电镜观察 2×106细胞用4%戊二醛固定2 h，0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗，1%四氧化锇后固定，梯度酒精脱水，Epon-812包埋，LKB-V超薄切片机切薄片，醋酸钠和柠檬酸铅染色，H-300透射电镜观察。
5.DNA断裂分析 5×106细胞用PBS洗涤后置于500 μl细胞裂解液(10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，20 mmol/L EDTA，0.2% TritonX-100)中混匀，离心取上清，加100 μg/ml无DNase活性的RNase A，37℃水浴60 min，加入200 μg/ml蛋白酶K，55℃水浴2 h；酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，真空干燥，TE溶解后进行2%琼脂糖凝胶电泳。
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6.细胞总RNA提取 参照文献[2]方法。
7.逆转录PCR cDNA合成体系为：1 μg总RNA、20U AMV酶、2 μl dNTP(10 mmol/L)、4 μl AMV RT 5×反应缓冲液、1 μl bcl-2反义引物，共20 μl。25℃20 min，42℃ 45 min，反应完毕以未经TNF处理组的cDNA量为标准进行PCR反应：bcl-2上游与下游引物各0.5 μmol/L、10 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0)、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTP、cDNA 25 μl、Taq DNA聚合酶2.5 U，用于扩增的引物序列为：上游5’-GACTTCGCCGAGATGTCGC-3’；下游5’-GTCTTGAGAGACAGCCAGCT-3’，扩增片段为326 bp。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离。
8.Western印迹 10 μg细胞裂解产物经12% SDS-PAGE分离后电转移至硝酸纤维素膜上，经封闭液(1%脱脂奶粉，0.3% TWEEN-20，PBS)封闭后，依次与一抗(兔抗人bcl-2抗体)和二抗(羊抗兔HRP复合物)反应，DAB显色液显色。
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结 果
1.TNF诱导U937细胞凋亡
(1)透射电镜观察结果
未经TNF处理的U937细胞、细胞形态完整，染色质细致均匀，核仁清晰可见，细胞器完整，细胞微绒毛清晰可见。经20 ng/ml TNF处理4 h后的U937细胞，偶见坏死细胞，胞膜皱裂，细胞完整结构消失。可见凋亡细胞，胞膜完整，染色质聚集及凋亡小体。
(2)DNA断裂分析
用10 ng/ml和20 ng/ml的TNF分别处理U937细胞4 h后，提取DNA作片段分析，呈现出阶梯状电泳条带，以20 ng/ml TNF处理组更明显(见图1)。
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图1 DNA断裂分析
1.未加TNF；2.10 ng/ml TNF；
3.20 ng/ml TNF；4.PCR分子量标准
2.抗氧化剂阻抑TNF诱导的U937细胞凋亡
图2 细胞存活计数结果
不同剂量的TNF处理U937细胞24 h后细胞存活计数结果(见图2)，以处理前细胞计数为对照。各种抗氧化剂均不同程度地提高了经TNF处理的U937的细胞的存活率，这表明抗氧化剂可以阻抑TNF诱导的细胞凋亡。
3.抗氧化剂抑制TNF诱发的U937细胞bcl-2表达下降作用
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(1)RT-PCR检测结果
图3 RT-PCR结果
1.PCR分子量标准
2.未加TNF
3.10 ng/ml TNF
4.10 ng/ml TNF+1 mmol/L NAc
5.10 ng/ml TNF+0.5 mmol/L VE
6.10 ng/ml TNF+0.5 mmol/L VC
5×106细胞经药物处理4 h后，RT-PCR结果见图3。与未经TNF处理组相比，TNF处理后的U937细胞bcl-2 mRNA表达下降，加入不同的抗氧化剂都可不同程度地上调bcl-2的mRNA表达水平。
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(2)Western印迹结果
1×107细胞经药物处理4 h后，进行Western印迹杂交。结果表明TNF处理后的U937细胞bcl-2蛋白量下降，加入抗氧化剂可以抑制这种下降作用，与RT-PCR结果一致(见插页第2页图2)
图2 bcl-2蛋白免疫印迹图谱
1.未加TNF；2.10 ng/ml TNF+1 mmol/L NAc;
3.10 ng/ml TNF;4.10 ng/ml TNF+0.5 mmol/l VE
讨 论
TNF是由活化的巨噬细胞或单核细胞分泌的具有多种生物学效应的多肽物质，对许多细胞具有生物毒性作用。TNF既可诱发细胞坏死，又可诱发细胞凋亡，按细胞类型或剂量而异。本实验用10、20 ng/ml的TNF都可以成功地诱导U937细胞凋亡，20 ng/ml TNF的作用更明显。
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TNF诱发细胞凋亡的作用机制至今尚不明确[3～6]，已知TNF诱发细胞凋亡的早期事件是核转录因子NF-κβ的核迁移，NF-κβ可诱导参与炎症反应的一系列基因表达，而活性氧中间产物是活化NF-κβ的重要步骤之一，因此有人提出“氧化压力是凋亡中介体”的概念。本文在探讨抗氧化剂对TNF诱发的U937细胞凋亡的生物学效应时发现，三种抗氧化剂——N-乙酰-L-半胱氨酸、维生素C和维生素E均可不同程度地抑制TNF诱导的U937细胞凋亡，这说明TNF介导的凋亡与它诱发细胞内氧自由基增多有关，活性氧中间体是TNF诱导凋亡的病因机制之一。
本文还从mRNA和蛋白水平对凋亡相关基因bcl-2进行了检测，结果表明，与对照组相比，TNF处理的细胞bcl-2表达下降，而抗氧化剂可以抑制这一下降作用，在作者的另一个实验中还发现，用bcl-2表达载体稳定转染的U937细胞经TNF处理，细胞存活率明显高于未转染细胞[7]。由此可见，bcl-2的表达、氧自由基的存在与TNF诱导的凋亡之间息息相关。与膜结合的bcl-2蛋白主要位于核膜、内质网与线粒体膜上[8]，它可能通过改变线粒体功能来消除活性氧自由基，减少氧化损伤引起的细胞凋亡[9]。
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第一作者简介 王 媛，女，硕士，技师。
参 考 文 献
1 Korsmeyer SJ. Bcl-2 initiates a new category of oncogenes; regulators of cell death. Blood, 1992, 80:879
2 Sambrook J, Fritsch EF, Mniatis T, et al. Molecular cloning, A laboratory mannual, 2nd ed, Cold Spring Laboratory, 1989, Cold Spring Harbor NY
3 Jia L, Jiang XR, Razak K, et al. TNF-mediated killing of human leukaemic cells: effects of endogenous antioxidant levels and TNF-α expression in leukaemic cell lines. Leukemia Res, 1995, 19:187
, 百拇医药
4 Henkel T, Machleidt T, Alkalay I, et al. Rapid proteolysis of 1 κ B-α is necessary for activation of transcription factor NF-κ B. Nature, 1993, 365:182
5 Schutze S, Pottoff K, Machleidt T, et al. TNF activates NF-κ B by phosphatidylcholine-specific phospholipase C-induced "acidic" sphingo-myclin breakdown. Cell, 1992, 71:765
6 Kizaki M, Sakashita O, Kkarmakar A, et al. Regulation of manganese superoxide dismutase and other antioxidant genes in normal and leukaemic haematopoietic cells and their relationship to cytotoxicity by tumor necrosis factor. Blood, 1993, 82:1142
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7 王 媛，曾凡杰，黄晓明，等.Bcl-2基因增强表达对TNF诱导U937细胞凋亡的效应.南京铁道医学院学报，1998，17(2)：92
8 Hockenbery DM, Oitval ZN, Yin XM, et al. Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis. Cell, 1993, 75:241
9 Jacobson MD, Raff MC. Programmed cell death and bcl-2 protection in very low oxygen. Nature, 1995, 374:814
(收稿：1998-03-09 修回：1998-05-19), 百拇医药
单位：曾凡杰 黄晓明 胡向阳 高翼之(南京铁道医学院科研所)；王 媛(中国人民解放军第81医院全军肿瘤中心实验科(南京210002)
关键词：抗氧化剂；肿瘤坏死因子；凋亡；bcl-2
肿瘤990112 近几年来，细胞凋亡(apoptosis)的研究日益深入，凋亡的调控可能与细胞类型及诱发因素有关，某些因素具有普遍性。研究表明，活性氧中间体(reactive oxygen intermediates, ROI)是细胞凋亡的媒介之一，许多理化因素诱导的细胞凋亡都与之有关[1]。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)能诱发白血病U937细胞凋亡，本文探讨了抗氧化剂对TNF诱导U937细胞凋亡的生物学效应。
材料和方法
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1.细胞系、化学试剂及引物 白血病U937细胞由南京铁道医学院科研所提供。寡核苷酸引物由中科院上海细胞生物学研究所合成。细胞培养试剂RPMI 1640为GIBCO公司产品，rhTNF购自Promega公司；N-乙酰-L-半胱氨酸(NAc)、维生素C、维生素E购自上海伯奥公司。
2.U937细胞培养及药物处理 采用RPMI 1640 完全培养基培养细胞，当细胞生长至对数期时加药处理。
3.细胞存活测定 采用台盼蓝拒染法(Trypan blue exclusion)。
4.透射电镜观察 2×106细胞用4%戊二醛固定2 h，0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗，1%四氧化锇后固定，梯度酒精脱水，Epon-812包埋，LKB-V超薄切片机切薄片，醋酸钠和柠檬酸铅染色，H-300透射电镜观察。
5.DNA断裂分析 5×106细胞用PBS洗涤后置于500 μl细胞裂解液(10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，20 mmol/L EDTA，0.2% TritonX-100)中混匀，离心取上清，加100 μg/ml无DNase活性的RNase A，37℃水浴60 min，加入200 μg/ml蛋白酶K，55℃水浴2 h；酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，真空干燥，TE溶解后进行2%琼脂糖凝胶电泳。
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6.细胞总RNA提取 参照文献[2]方法。
7.逆转录PCR cDNA合成体系为：1 μg总RNA、20U AMV酶、2 μl dNTP(10 mmol/L)、4 μl AMV RT 5×反应缓冲液、1 μl bcl-2反义引物，共20 μl。25℃20 min，42℃ 45 min，反应完毕以未经TNF处理组的cDNA量为标准进行PCR反应：bcl-2上游与下游引物各0.5 μmol/L、10 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0)、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTP、cDNA 25 μl、Taq DNA聚合酶2.5 U，用于扩增的引物序列为：上游5’-GACTTCGCCGAGATGTCGC-3’；下游5’-GTCTTGAGAGACAGCCAGCT-3’，扩增片段为326 bp。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离。
8.Western印迹 10 μg细胞裂解产物经12% SDS-PAGE分离后电转移至硝酸纤维素膜上，经封闭液(1%脱脂奶粉，0.3% TWEEN-20，PBS)封闭后，依次与一抗(兔抗人bcl-2抗体)和二抗(羊抗兔HRP复合物)反应，DAB显色液显色。
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结 果
1.TNF诱导U937细胞凋亡
(1)透射电镜观察结果
未经TNF处理的U937细胞、细胞形态完整，染色质细致均匀，核仁清晰可见，细胞器完整，细胞微绒毛清晰可见。经20 ng/ml TNF处理4 h后的U937细胞，偶见坏死细胞，胞膜皱裂，细胞完整结构消失。可见凋亡细胞，胞膜完整，染色质聚集及凋亡小体。
(2)DNA断裂分析
用10 ng/ml和20 ng/ml的TNF分别处理U937细胞4 h后，提取DNA作片段分析，呈现出阶梯状电泳条带，以20 ng/ml TNF处理组更明显(见图1)。
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图1 DNA断裂分析
1.未加TNF；2.10 ng/ml TNF；
3.20 ng/ml TNF；4.PCR分子量标准
2.抗氧化剂阻抑TNF诱导的U937细胞凋亡
图2 细胞存活计数结果
不同剂量的TNF处理U937细胞24 h后细胞存活计数结果(见图2)，以处理前细胞计数为对照。各种抗氧化剂均不同程度地提高了经TNF处理的U937的细胞的存活率，这表明抗氧化剂可以阻抑TNF诱导的细胞凋亡。
3.抗氧化剂抑制TNF诱发的U937细胞bcl-2表达下降作用
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(1)RT-PCR检测结果
图3 RT-PCR结果
1.PCR分子量标准
2.未加TNF
3.10 ng/ml TNF
4.10 ng/ml TNF+1 mmol/L NAc
5.10 ng/ml TNF+0.5 mmol/L VE
6.10 ng/ml TNF+0.5 mmol/L VC
5×106细胞经药物处理4 h后，RT-PCR结果见图3。与未经TNF处理组相比，TNF处理后的U937细胞bcl-2 mRNA表达下降，加入不同的抗氧化剂都可不同程度地上调bcl-2的mRNA表达水平。
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(2)Western印迹结果
1×107细胞经药物处理4 h后，进行Western印迹杂交。结果表明TNF处理后的U937细胞bcl-2蛋白量下降，加入抗氧化剂可以抑制这种下降作用，与RT-PCR结果一致(见插页第2页图2)
图2 bcl-2蛋白免疫印迹图谱
1.未加TNF；2.10 ng/ml TNF+1 mmol/L NAc;
3.10 ng/ml TNF;4.10 ng/ml TNF+0.5 mmol/l VE
讨 论
TNF是由活化的巨噬细胞或单核细胞分泌的具有多种生物学效应的多肽物质，对许多细胞具有生物毒性作用。TNF既可诱发细胞坏死，又可诱发细胞凋亡，按细胞类型或剂量而异。本实验用10、20 ng/ml的TNF都可以成功地诱导U937细胞凋亡，20 ng/ml TNF的作用更明显。
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TNF诱发细胞凋亡的作用机制至今尚不明确[3～6]，已知TNF诱发细胞凋亡的早期事件是核转录因子NF-κβ的核迁移，NF-κβ可诱导参与炎症反应的一系列基因表达，而活性氧中间产物是活化NF-κβ的重要步骤之一，因此有人提出“氧化压力是凋亡中介体”的概念。本文在探讨抗氧化剂对TNF诱发的U937细胞凋亡的生物学效应时发现，三种抗氧化剂——N-乙酰-L-半胱氨酸、维生素C和维生素E均可不同程度地抑制TNF诱导的U937细胞凋亡，这说明TNF介导的凋亡与它诱发细胞内氧自由基增多有关，活性氧中间体是TNF诱导凋亡的病因机制之一。
本文还从mRNA和蛋白水平对凋亡相关基因bcl-2进行了检测，结果表明，与对照组相比，TNF处理的细胞bcl-2表达下降，而抗氧化剂可以抑制这一下降作用，在作者的另一个实验中还发现，用bcl-2表达载体稳定转染的U937细胞经TNF处理，细胞存活率明显高于未转染细胞[7]。由此可见，bcl-2的表达、氧自由基的存在与TNF诱导的凋亡之间息息相关。与膜结合的bcl-2蛋白主要位于核膜、内质网与线粒体膜上[8]，它可能通过改变线粒体功能来消除活性氧自由基，减少氧化损伤引起的细胞凋亡[9]。
, http://www.100md.com
第一作者简介 王 媛，女，硕士，技师。
参 考 文 献
1 Korsmeyer SJ. Bcl-2 initiates a new category of oncogenes; regulators of cell death. Blood, 1992, 80:879
2 Sambrook J, Fritsch EF, Mniatis T, et al. Molecular cloning, A laboratory mannual, 2nd ed, Cold Spring Laboratory, 1989, Cold Spring Harbor NY
3 Jia L, Jiang XR, Razak K, et al. TNF-mediated killing of human leukaemic cells: effects of endogenous antioxidant levels and TNF-α expression in leukaemic cell lines. Leukemia Res, 1995, 19:187
, 百拇医药
4 Henkel T, Machleidt T, Alkalay I, et al. Rapid proteolysis of 1 κ B-α is necessary for activation of transcription factor NF-κ B. Nature, 1993, 365:182
5 Schutze S, Pottoff K, Machleidt T, et al. TNF activates NF-κ B by phosphatidylcholine-specific phospholipase C-induced "acidic" sphingo-myclin breakdown. Cell, 1992, 71:765
6 Kizaki M, Sakashita O, Kkarmakar A, et al. Regulation of manganese superoxide dismutase and other antioxidant genes in normal and leukaemic haematopoietic cells and their relationship to cytotoxicity by tumor necrosis factor. Blood, 1993, 82:1142
, 百拇医药
7 王 媛，曾凡杰，黄晓明，等.Bcl-2基因增强表达对TNF诱导U937细胞凋亡的效应.南京铁道医学院学报，1998，17(2)：92
8 Hockenbery DM, Oitval ZN, Yin XM, et al. Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis. Cell, 1993, 75:241
9 Jacobson MD, Raff MC. Programmed cell death and bcl-2 protection in very low oxygen. Nature, 1995, 374:814
(收稿：1998-03-09 修回：1998-05-19), 百拇医药