非小细胞肺癌的血管生成和血管生成因子表达
作者：江晓丰 董强刚 冯久贤 包国良 沙慧芳 王恩忠
单位：上海胸科医院，上海胸部肿瘤研究所(上海200030)
关键词：血管生成；血管生成因子；微血管密度；癌，非小细胞肺；肺肿瘤
肿瘤990108 肿瘤的血管生成(Angiogenesis)不仅为肿瘤组织的生长提供营养及气体交换，同时也是肿瘤细胞转移的最直接门户。研究发现，肿瘤血管生成受到肿瘤微环境中一系列生物因子的调节，并且由于肿瘤组织类型的差异，其参于血管生成调节的因子谱各不相同，其中血管内皮生长因子(VEGF)和碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)等备受重视，是参于微血管生成的主要正向调节因子[1]。
本文应用免疫组化，RT-PCR等技术，研究了原发性非小细胞肺癌(NSCLC)的微血管密度，血管生成因子及其相应受体的表达，并分析了其与病理特征之间的关系。
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材料与方法
一、组织标本 92例原发性非小细胞肺癌患者，年龄为32～78岁，平均57.3岁，于1996年5～10月在上海市胸科医院胸外科手术，术后留取肿瘤组织置液氮中保存。其中鳞癌36例，腺癌46例，混合型10例；女性40例，男性52例；外科病理分期按照UICC(1986年)标准，其中Ⅰ期50例，Ⅱ～Ⅲ期42例。所有病例的临床和病理资料均经病理科和临床医师确认无误。
二、抗体 抗CD31单抗由意大利Mario Negri药理研究所E. Dejana教授惠赠，抗VEGF(同时识别VEGF121，165，189)，抗flk-1(识别kdr)，抗bFGF和抗Flg-1购于美国Santa Cruz公司，ABC试剂盒购于VECTOR公司。
三、免疫组织化学染色及结果判定 肿瘤组织经甲基纤维素包埋后作5 μm厚冰冻切片。组织切片经5%人AB血清+5%马血清被复37℃，2 h封阻非特异结合位点后，分别加上抗体于4℃过夜，采用ABC方法染色。结果判定，肿瘤微血管密度MVD计数按文献[2]进行，选用40×镜扫视整个切片，寻找高血管密度区，即所谓的“热点”，然后在200×视野下计数染成棕色的血管环(条)数目；VEGF，bFGF阳性染色以见到定位于肿瘤胞浆的棕色染色为准；kdr，Flg-1阳性染色以见到定位于血管内皮细胞膜的棕色染色为准。并以阳性染色细胞占25%以上者定为阳性。
, 百拇医药
四、RT-PCR
运用异硫氰胍一步法提取mRNA。引物由赛百盛公司合成，VEGF顺义链为5’-CACATAGGAGAGATGAGCTTC-3’，反义链5′-CCGCCTCGGCTTGTC-3′。β-actin顺义链为5’-ACT-ATG-TTT-GAG-ACC-TCC-ACC-A-3’，反义链5’-CAT-CTC-TTG-CTC-GAA-GTG-CA-3’。1 μg mRNA进入逆转录体系，42℃ 30 min，然后取逆转录产物5 μl进入PCR体系。于PCR循环仪(PE公司)94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 10 min，35循环，72℃ 10 min。分别扩增VEGF及β-actin基因片段。产物以2%琼脂醣凝胶电泳分析。
五、统计处理 采用Student氏t检验或χ2检验。
结 果
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一、NSCLC的微血管密度
运用抗CD31单抗，对92例NSCLC中血管内皮细胞进行了免疫组化分析，阳性染色局限于血管内皮细胞胞膜，形成条状(纵切面)或环状(横切面)血管结构。计数结果，平均微血管密度(MVD)为6.9±3.2，最高达17(见插页1图3，4)。
图3 NSCLC冰冻切片CD31免疫组化阳性着色局限于血管内皮
细胞胞膜，形成条状(纵切面)或环状(横切面)，血管结构如箭头所示
图4 NSCLC冰冻切片VEGF免疫组化 阳性着色(棕色)定位于肿瘤细胞胞浆内
二、NSCLC中VEGF，bFGF及相应受体的表达
, 百拇医药
免疫组化分析表明，39例原发性NSCLC组织中VEGF和受体kdr的阳性表达率分别为70.8%和71.8%，而bFGF及受体Flg-1阳性率仅为5.1%和23.2%。结果显示VEGF及其受体kdr的表达显著高于bFGF及其受体Flg-1的表达。提示VEGF可能是NSCLC血管生成的主要正向调节因子(见图1)。为进一步证实VEGF的表达，作者运用RT-PCR检查了相应组织中VEGF mRNA的表达，其阳性率达84.3%(见图2)。免疫组化和RT-PCR检测的相符率达80.6%。
图1 NSCLC中的血管生成因子及受体的表达
图2 NSCLC中VEGF及β-actin mRNA的表达1～3行为NSCLC组织标本，主要表达300 bp阳性条带，M为PCR markers(G316i)
, 百拇医药
三、VEGF的MVD的关系
以平均MVD为界，将NSCLC分为两组，观察VEGF的表达情况。表1结果显示：MVD≥6组的VEGF阳性表达率为86.0%，明显高于MVD<6组的51.7%(P<0.025)。
括号内为阳性病例数/阴性病例数
四、MVD和VEGF与外科病理分期的关系
表2显示，Ⅱ～Ⅲ期肺癌MVD平均为8.3±3.5，明显高于Ⅰ期肺癌的5.4±2.8(P<0.01)；Ⅱ～Ⅲ期肺癌VEGF表达率为82.5%明显高于Ⅰ期肺癌的52.0(P<0.01)，具有统计学显著差异。但VEGF和MVD在不同组织类型间的表达无统计学显著差异。
表1 NSCLC MVD与VEGF表达的关系 组别
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VEGF(%)
MVD≥6
86.0(31/36)
MVD<6
51.7(15/29)
P值
P<0.025
表2 微血管密度(MVD)，血管内皮细胞生长因子(VEGF)与NSCLC临床病理的关系 临床病理
例数
MVD
VEGF(%)
, 百拇医药 组织类型
鳞癌
36
7.2±3.4
63.6(14/22)
腺癌
46
6.7±3.5
73%7(28/38)
混合型癌
10
6.9±3.8
80.0(4/5)
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P值
P>0.5
P>0.5
TNM分期
Ⅰ
50
5.4±2.8
52.0(13/25)
Ⅱ～Ⅲ
42
83±3.5
82.5(33/40)
P值
, 百拇医药
P<0.05
P<0.01
括号内为阳性病例数/阴性病例数讨 论
运用一些特异性抗体(如抗Ⅷ因子抗体，抗CD34，CD31等)标记肿瘤组织血管内皮细胞，计数单位面积中的微血管数目，即为微血管密度(MVD)，可由此来衡量肿瘤血管生成的活跃程度。研究表明，在许多实体肿瘤包括胃肠道肿瘤，子宫颈癌，以及肺癌中都存在着活跃的血管生成，并发现其血管生成的活跃程度与这些肿瘤的预后相关[1～3]。本文对92例NSCLC进行了MVD计数，平均MVD为6.9±3.2，最高达17。提示在NSCLC中存在着活跃的血管生成。并且发现Ⅱ～Ⅲ期肺癌MVD明显高于Ⅰ期肺癌，提示MVD能较好地反映NSCLC的病期进展。此结果与文献[2，3]报道吻合。
在肿瘤组织中，肿瘤细胞和许多宿主细胞分泌一系列细胞因子，形成一个有利于血管生成的微环境。研究认为不同组织类型肿瘤其参于血管生成的生长因子谱各不相同。如在纤维肉瘤中碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)是微血管生成的主要正向调节因子[4]，而在胃肠道肿瘤，恶性宫颈癌中则发现血管内皮细胞生长因子(VEGF)是刺激血管生成的主要因子[1，5，6]。因此，确定某一种肿瘤的主要促血管生成因子及其作用机制，对于设计针对血管生成的治疗方案具有指导意义。本文运用RT-PCR及免疫组化技术分析了VEGF，bFGF及其受体的表达，发现在NSCLC中VEGF及其受体kdr高水平地表达，且明显高于bFGF及其受体Flg，提示VEGF在NSCLC血管生成中的重要性。此结果与文献[7]报道相符。
, 百拇医药
VEGF能强烈地刺激血管内皮细胞增殖迁移和形成新生血管。同时，VEGF也具有增加血管通透性的能力，因而又将其称为血管通透因子(VPF)。人类VEGF基因有8个外显子组成，其在mRNA水平上进一步剪切组合，形成4个不同分子量的VEGF异构体，分别为VEGF121，VEGF165，VEGF189，VEGF206[8]。这些异构体均通过其功能性受体kdr或flt-1而发挥其生物学效应[9]。研究认为不同组织类型的肿瘤细胞可表达不同的异构体，但以表达VEGF165较为常见，作者运用一组能同时扩增4种不同分子量VEGF的引物，经RT-PCR扩增发现NSCLC癌细胞主要表达300 bp(VEGF189)的阳性条带，而100 bp(VEGF121)，230 bp(VEGF165)条带的表达较弱，在这一结果提示了NSCLC癌细胞表达VEGF的特殊性。此外，作者检查了39例NSCLC中kdr中的表达，发现28例染色阳性，而且kdr的表达与VEGF的表达具有良好的相关性，几乎所有表达VEGF的肿瘤组织都呈kdr阳性。这种生长因子与其受体的同时表达，为VEGF发挥生物学效应提供了可能。
, 百拇医药
综上所述，在NSCLC中存在着活跃的血管生成，并表达高水平VEGF及其受体，VEGF的表达与MVD相关，提示VEGF是NSCLC血管生成的主要因子。同时，MVD及VEGF的表达与该病的病期发展呈正相关。
第一作者简介 江晓丰 男，肿瘤免疫学硕士，实习研究员。
参 考 文 献
1 Leek A, Harris L,Lewis CE. Cytokine networks in solid human tumors: regulation of angiogenesis. J Leuk Bio, 1994, 56：423.
2 Fontanini G, Bigini D, Vinnati S, et al. Microvessel count predicts metastatic disease and survival in non-small cell lung cancer. J Pathol, 1995, 77：57.
, http://www.100md.com
3 Fontanin G, Vignati S, Bigini D, et al. Neoangiogenesis: a putative marker of malignancy in non-small cell lung cancer (NSCLC) development. Int J Cancer, 1996, 67：615
4 Kandel J,Wetzel B, Radvanyi EF, et al. Neovascularization is associated with a switch to the export of bFGF in the multistep development of fibrosarcoma. Cell, 1991, 66：1095
5 Cawrence F, Berse BB, Robert W J, et al. Expression of vascular permeability factor(Vascular endothelial growth factor) and its receptors in the gastrointestinal tract. Cancer Res, 1993, 53：4727
, 百拇医药
6 Graziella M, Jawdh A, James D F, et al. Strong expression of vascular permeability factor (Vascular endothelial growth factor) and its receptors in ovarian borderline and malignant neoplasms. Lab Invest, 1996, 74：1105
7 Fontanini G, Vignati S, Boldrini L, et al. Vascular endothelial growth factor is associated with neovascularization and influences progression of non-small cell lung carcinoma, Clin Cancer Res, 1997, 3：861.
8 Tischer E, Mitchell R, Hartman T, et al. The human gene for vascular endothelial growth factor. J Biol Chemi, 1991, 266：11947
9 Broun K J, Maynes S F, Bezos A, et al. A novel in vitro assay for human angiogenesis. Lab Invest, 1996, 75：539
(收稿：1998-03-16 修回：1998-08-07), 百拇医药
单位：上海胸科医院，上海胸部肿瘤研究所(上海200030)
关键词：血管生成；血管生成因子；微血管密度；癌，非小细胞肺；肺肿瘤
肿瘤990108 肿瘤的血管生成(Angiogenesis)不仅为肿瘤组织的生长提供营养及气体交换，同时也是肿瘤细胞转移的最直接门户。研究发现，肿瘤血管生成受到肿瘤微环境中一系列生物因子的调节，并且由于肿瘤组织类型的差异，其参于血管生成调节的因子谱各不相同，其中血管内皮生长因子(VEGF)和碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)等备受重视，是参于微血管生成的主要正向调节因子[1]。
本文应用免疫组化，RT-PCR等技术，研究了原发性非小细胞肺癌(NSCLC)的微血管密度，血管生成因子及其相应受体的表达，并分析了其与病理特征之间的关系。
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材料与方法
一、组织标本 92例原发性非小细胞肺癌患者，年龄为32～78岁，平均57.3岁，于1996年5～10月在上海市胸科医院胸外科手术，术后留取肿瘤组织置液氮中保存。其中鳞癌36例，腺癌46例，混合型10例；女性40例，男性52例；外科病理分期按照UICC(1986年)标准，其中Ⅰ期50例，Ⅱ～Ⅲ期42例。所有病例的临床和病理资料均经病理科和临床医师确认无误。
二、抗体 抗CD31单抗由意大利Mario Negri药理研究所E. Dejana教授惠赠，抗VEGF(同时识别VEGF121，165，189)，抗flk-1(识别kdr)，抗bFGF和抗Flg-1购于美国Santa Cruz公司，ABC试剂盒购于VECTOR公司。
三、免疫组织化学染色及结果判定 肿瘤组织经甲基纤维素包埋后作5 μm厚冰冻切片。组织切片经5%人AB血清+5%马血清被复37℃，2 h封阻非特异结合位点后，分别加上抗体于4℃过夜，采用ABC方法染色。结果判定，肿瘤微血管密度MVD计数按文献[2]进行，选用40×镜扫视整个切片，寻找高血管密度区，即所谓的“热点”，然后在200×视野下计数染成棕色的血管环(条)数目；VEGF，bFGF阳性染色以见到定位于肿瘤胞浆的棕色染色为准；kdr，Flg-1阳性染色以见到定位于血管内皮细胞膜的棕色染色为准。并以阳性染色细胞占25%以上者定为阳性。
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四、RT-PCR
运用异硫氰胍一步法提取mRNA。引物由赛百盛公司合成，VEGF顺义链为5’-CACATAGGAGAGATGAGCTTC-3’，反义链5′-CCGCCTCGGCTTGTC-3′。β-actin顺义链为5’-ACT-ATG-TTT-GAG-ACC-TCC-ACC-A-3’，反义链5’-CAT-CTC-TTG-CTC-GAA-GTG-CA-3’。1 μg mRNA进入逆转录体系，42℃ 30 min，然后取逆转录产物5 μl进入PCR体系。于PCR循环仪(PE公司)94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 10 min，35循环，72℃ 10 min。分别扩增VEGF及β-actin基因片段。产物以2%琼脂醣凝胶电泳分析。
五、统计处理 采用Student氏t检验或χ2检验。
结 果
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一、NSCLC的微血管密度
运用抗CD31单抗，对92例NSCLC中血管内皮细胞进行了免疫组化分析，阳性染色局限于血管内皮细胞胞膜，形成条状(纵切面)或环状(横切面)血管结构。计数结果，平均微血管密度(MVD)为6.9±3.2，最高达17(见插页1图3，4)。
图3 NSCLC冰冻切片CD31免疫组化阳性着色局限于血管内皮
细胞胞膜，形成条状(纵切面)或环状(横切面)，血管结构如箭头所示
图4 NSCLC冰冻切片VEGF免疫组化 阳性着色(棕色)定位于肿瘤细胞胞浆内
二、NSCLC中VEGF，bFGF及相应受体的表达
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免疫组化分析表明，39例原发性NSCLC组织中VEGF和受体kdr的阳性表达率分别为70.8%和71.8%，而bFGF及受体Flg-1阳性率仅为5.1%和23.2%。结果显示VEGF及其受体kdr的表达显著高于bFGF及其受体Flg-1的表达。提示VEGF可能是NSCLC血管生成的主要正向调节因子(见图1)。为进一步证实VEGF的表达，作者运用RT-PCR检查了相应组织中VEGF mRNA的表达，其阳性率达84.3%(见图2)。免疫组化和RT-PCR检测的相符率达80.6%。
图1 NSCLC中的血管生成因子及受体的表达
图2 NSCLC中VEGF及β-actin mRNA的表达1～3行为NSCLC组织标本，主要表达300 bp阳性条带，M为PCR markers(G316i)
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三、VEGF的MVD的关系
以平均MVD为界，将NSCLC分为两组，观察VEGF的表达情况。表1结果显示：MVD≥6组的VEGF阳性表达率为86.0%，明显高于MVD<6组的51.7%(P<0.025)。
括号内为阳性病例数/阴性病例数
四、MVD和VEGF与外科病理分期的关系
表2显示，Ⅱ～Ⅲ期肺癌MVD平均为8.3±3.5，明显高于Ⅰ期肺癌的5.4±2.8(P<0.01)；Ⅱ～Ⅲ期肺癌VEGF表达率为82.5%明显高于Ⅰ期肺癌的52.0(P<0.01)，具有统计学显著差异。但VEGF和MVD在不同组织类型间的表达无统计学显著差异。
表1 NSCLC MVD与VEGF表达的关系 组别
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VEGF(%)
MVD≥6
86.0(31/36)
MVD<6
51.7(15/29)
P值
P<0.025
表2 微血管密度(MVD)，血管内皮细胞生长因子(VEGF)与NSCLC临床病理的关系 临床病理
例数
MVD
VEGF(%)
, 百拇医药 组织类型
鳞癌
36
7.2±3.4
63.6(14/22)
腺癌
46
6.7±3.5
73%7(28/38)
混合型癌
10
6.9±3.8
80.0(4/5)
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P值
P>0.5
P>0.5
TNM分期
Ⅰ
50
5.4±2.8
52.0(13/25)
Ⅱ～Ⅲ
42
83±3.5
82.5(33/40)
P值
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P<0.05
P<0.01
括号内为阳性病例数/阴性病例数讨 论
运用一些特异性抗体(如抗Ⅷ因子抗体，抗CD34，CD31等)标记肿瘤组织血管内皮细胞，计数单位面积中的微血管数目，即为微血管密度(MVD)，可由此来衡量肿瘤血管生成的活跃程度。研究表明，在许多实体肿瘤包括胃肠道肿瘤，子宫颈癌，以及肺癌中都存在着活跃的血管生成，并发现其血管生成的活跃程度与这些肿瘤的预后相关[1～3]。本文对92例NSCLC进行了MVD计数，平均MVD为6.9±3.2，最高达17。提示在NSCLC中存在着活跃的血管生成。并且发现Ⅱ～Ⅲ期肺癌MVD明显高于Ⅰ期肺癌，提示MVD能较好地反映NSCLC的病期进展。此结果与文献[2，3]报道吻合。
在肿瘤组织中，肿瘤细胞和许多宿主细胞分泌一系列细胞因子，形成一个有利于血管生成的微环境。研究认为不同组织类型肿瘤其参于血管生成的生长因子谱各不相同。如在纤维肉瘤中碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)是微血管生成的主要正向调节因子[4]，而在胃肠道肿瘤，恶性宫颈癌中则发现血管内皮细胞生长因子(VEGF)是刺激血管生成的主要因子[1，5，6]。因此，确定某一种肿瘤的主要促血管生成因子及其作用机制，对于设计针对血管生成的治疗方案具有指导意义。本文运用RT-PCR及免疫组化技术分析了VEGF，bFGF及其受体的表达，发现在NSCLC中VEGF及其受体kdr高水平地表达，且明显高于bFGF及其受体Flg，提示VEGF在NSCLC血管生成中的重要性。此结果与文献[7]报道相符。
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VEGF能强烈地刺激血管内皮细胞增殖迁移和形成新生血管。同时，VEGF也具有增加血管通透性的能力，因而又将其称为血管通透因子(VPF)。人类VEGF基因有8个外显子组成，其在mRNA水平上进一步剪切组合，形成4个不同分子量的VEGF异构体，分别为VEGF121，VEGF165，VEGF189，VEGF206[8]。这些异构体均通过其功能性受体kdr或flt-1而发挥其生物学效应[9]。研究认为不同组织类型的肿瘤细胞可表达不同的异构体，但以表达VEGF165较为常见，作者运用一组能同时扩增4种不同分子量VEGF的引物，经RT-PCR扩增发现NSCLC癌细胞主要表达300 bp(VEGF189)的阳性条带，而100 bp(VEGF121)，230 bp(VEGF165)条带的表达较弱，在这一结果提示了NSCLC癌细胞表达VEGF的特殊性。此外，作者检查了39例NSCLC中kdr中的表达，发现28例染色阳性，而且kdr的表达与VEGF的表达具有良好的相关性，几乎所有表达VEGF的肿瘤组织都呈kdr阳性。这种生长因子与其受体的同时表达，为VEGF发挥生物学效应提供了可能。
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综上所述，在NSCLC中存在着活跃的血管生成，并表达高水平VEGF及其受体，VEGF的表达与MVD相关，提示VEGF是NSCLC血管生成的主要因子。同时，MVD及VEGF的表达与该病的病期发展呈正相关。
第一作者简介 江晓丰 男，肿瘤免疫学硕士，实习研究员。
参 考 文 献
1 Leek A, Harris L,Lewis CE. Cytokine networks in solid human tumors: regulation of angiogenesis. J Leuk Bio, 1994, 56：423.
2 Fontanini G, Bigini D, Vinnati S, et al. Microvessel count predicts metastatic disease and survival in non-small cell lung cancer. J Pathol, 1995, 77：57.
, http://www.100md.com
3 Fontanin G, Vignati S, Bigini D, et al. Neoangiogenesis: a putative marker of malignancy in non-small cell lung cancer (NSCLC) development. Int J Cancer, 1996, 67：615
4 Kandel J,Wetzel B, Radvanyi EF, et al. Neovascularization is associated with a switch to the export of bFGF in the multistep development of fibrosarcoma. Cell, 1991, 66：1095
5 Cawrence F, Berse BB, Robert W J, et al. Expression of vascular permeability factor(Vascular endothelial growth factor) and its receptors in the gastrointestinal tract. Cancer Res, 1993, 53：4727
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6 Graziella M, Jawdh A, James D F, et al. Strong expression of vascular permeability factor (Vascular endothelial growth factor) and its receptors in ovarian borderline and malignant neoplasms. Lab Invest, 1996, 74：1105
7 Fontanini G, Vignati S, Boldrini L, et al. Vascular endothelial growth factor is associated with neovascularization and influences progression of non-small cell lung carcinoma, Clin Cancer Res, 1997, 3：861.
8 Tischer E, Mitchell R, Hartman T, et al. The human gene for vascular endothelial growth factor. J Biol Chemi, 1991, 266：11947
9 Broun K J, Maynes S F, Bezos A, et al. A novel in vitro assay for human angiogenesis. Lab Invest, 1996, 75：539
(收稿：1998-03-16 修回：1998-08-07), 百拇医药