蝎毒的热增敏研究
作者：贺会江 祁超 黄静 吴细丕 黄传继 高春芳
单位：贺会江、黄静、黄传继、高春芳：洛阳市(471031) 洛阳解放军150医院肿瘤科； 祁超：郑州市(450002) 河南医科大学附院肿瘤科； 吴细丕：郑州市(450003) 河南省肿瘤研究所
关键词：蝎毒 热增敏 倍增时间 生存时间 细胞凋亡
齐鲁肿瘤杂志990103 【摘 要】 目的 探讨蝎毒对热疗的增敏作用及作用机理。方法 将Lewis肺癌细胞接种在NIH小鼠的右后大腿皮下，当肿瘤平均直径达到6mm时开始实验，观察蝎毒(0.6mg/kg)、热疗(43℃25分钟)及其联合治疗组的肿瘤直径倍增时间(MDDT)、生存时间(AST)、病理改变和细胞凋亡变化。结果 对照组、蝎毒组、热疗组和蝎毒热疗组的MDDT分别为10.2±0.34天、11.5±0.38天、12.7±0.41天和14.1±0.42天，各治疗组均能延长荷瘤小鼠的生存期，引起肿瘤坏死，诱发细胞凋亡，尤以联合治疗效果明显。结论 蝎毒不仅有抗肿瘤作用，而且对热疗有增敏作用，诱发细胞凋亡是其抗肿瘤的主要机制之一。
, 百拇医药
The effect of thermosensitization of scorpion venom
He Huijiang,Qi Chao,Huang Jing,et al.
The 150th Hospital of P.L.A.,Luoyang 471031
【Abstract】 Objective To determine the thermosensitization effect of Scorpion venom (SV) and its mechanism. Methods The Lewis lung carcinoma cells were implanted subcutaneously in right hind leg of the NIH mice.Treatment began when the tumors reached about 6mm in diameter.The effects of SV (0.6mg/kg),Thermotherapy (43℃,25min.HT) and their combination group (SV→HT) on mean diameter doubling time (MDDT),animal survival time (AST),tumor necrosis and apoptosis were observed.Results The MDDT for the control group,SV,HT and SV→HT were 10.2±0.34 days,11.5±0.38 days,12.7±0.41 days and 14.1±0.42 days, respectively.All treatment groups could prolong AST of the mice bearing Lewis lung cacinoma,induce tumor necrosis and apoptosis.The effects of SV→HT were better than the others.Conclusion Scorpion venom has antitumor and thermosensitive effect.Induce apoptosis is one of the antitumor mechanisms.
, 百拇医药
【Key Words】 Scorpion venom Thermosensitization Doubling time (DT) Animal survival time (AST) Apoptosis
近年来，热疗逐渐成为肿瘤治疗的常用手段，由于高热对机体有损伤，限制了温度的提高，使疗效难以进一步提高，因此热增敏的研究正广泛展开。蝎毒是抗癌有效中药全蝎尾节毒囊的分泌物，具有良好的抗癌效应，合理使用安全性较大[1]。我们研究了蝎毒对热疗的增敏效应并探讨了其作用机制，从1983年至今国内外鲜见有关报道。
1 材料与方法
1.1 动物 NIH小鼠，由美国引进，河南省肿瘤研究所繁殖。雌雄各半。6～8周龄，体重18～22g，每组10只。普通饲料喂养，室温18～22℃，湿度60%±5%，饲料及垫料均经消毒处理。实验前小鼠适应环境3天。
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1.2 移植性实验肿瘤 Lewis肺癌细胞株购自中国医科院药物所，C57BL小鼠传代保种。
1.3 药物 蝎毒由洛阳解放军济南军区肛肠中心提供。用无菌生理盐水配制浓度为0.06g/L溶液，4℃冰箱保存；程序性细胞死亡检测试剂盒由美国进口，华美生物工程公司分装、提供。
1.4 加温 肿瘤的局部加温在精密恒温水浴箱中进行。水温用贝克曼温度计(精确度0.01℃)校正，水浴温度控制在±0.01℃以内。荷瘤动物用戊巴比妥钠腹腔麻醉，60mg/kg，将其荷瘤腿浸入水浴中并使瘤体低于水面至少5mm，加温43℃ 25分钟。
1.5 方法 无菌条件下将生长良好的Lewis肺癌病灶从荷瘤小鼠腋下取出，选取正常瘤块，剪碎后用生理盐水按1∶3匀浆、稀释，去掉残渣，以5×105肿瘤细胞接种于NIH小鼠右后肢外侧皮内。随机分为蝎毒组、热疗组、蝎毒→热疗组、盐水对照组，接种后6天左右用游标卡尺测量肿瘤的三个互相垂直的直径，取其平均值(MD)，当MD达到6mm左右时开始实验，蝎毒组一次性腹腔注射蝎毒0.6mg/kg，热疗组按前述要求进行，盐水对照组同样进行腹腔麻醉、等容生理盐水腹腔注射、37℃ 25分钟加温，实验中蝎毒与热疗的联合应用，时间间隔不超过10分钟，上述治疗仅进行一次。
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1.6 观察指标
(1)实验开始后，每隔一天测量一次肿瘤MD。当动物肿瘤MD达到治疗开始时的2倍以上时，停止测量，计算肿瘤倍增时间(MDDT)。被治疗动物一直饲养到自然死亡，计算其存活时间(AST)，即自接种到死亡的天数。
(2)实验开始后第3天脱颈处死小鼠，完整剥离瘤体，10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，取病理切片。一组HE染色，光镜观察肿瘤组织的坏死及细胞形态改变；另一组进行免疫组化实验，观察细胞程序性死亡即凋亡情况。
(3)疗效判断方法：计算各观察组与对照组的MD之差即为d值。若d(联合组)大于或等于d(各个单纯治疗组)之和，为协同相加作用，即增敏作用；若d(联合组)小于d(各个单纯治疗组)之和，为拮抗作用。
2 结果
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2.1 对荷瘤小鼠瘤体和小鼠生存期的影响 d(蝎毒→热疗)等于d(蝎毒)+d(热疗)，说明蝎毒对热疗有协同相加作用。所有治疗组均可延长荷瘤小鼠生存期，联合治疗组效果好于单纯治疗组(表1)。
表1 蝎毒对热疗的增敏意义
组别
例数
MDDT(天)
AST(天)
P※
±s
P※
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d
对照
10
10.2±0.34
31.0±2.4
蝎毒
10
11.5±0.38
<0.05
1.3
45.5±3.2
<0.01
热疗
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10
12.7±0.41
<0.05
2.5
43.8±3.1
<0.01
蝎→热
10
14.1±0.42
<0.01
3.9
47.3±3.4
<0.01
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※ 均与对照组比较
2.2 治疗后瘤组织的病理改变 通过双盲法观察低倍镜下各组坏死区所占瘤组织的面积比例，可以看出蝎毒热疗组比单纯治疗组具有更强的抗肿瘤作用(表2)。
表2 蝎毒对瘤组织病理、细胞凋亡的影响
组别
例数
坏死区
细胞凋亡
(‰)
计算细胞
总数
对照
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3
小局灶
2.04
3640
蝎毒
3
1/6～1/7
8.07
3640
热疗
3
1/4～1/3
7.15
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4065
蝎→热
3
1/3～1/2
10.71
3640
高倍镜观察非坏死区细胞形态，发现在治疗组癌组织中有明显凋亡细胞，表现为：①有凋亡小体(即胞浆内出现的染色质颗粒)；②核固缩核膜厚薄不均，出现皱壁；③染色质积聚成大颗粒，贴近核膜；④细胞肿胀、胞浆红染。对高倍视野内凋亡细胞数进行统计，结果发现与组化方法细胞程序死亡实验得出的结果相同。
2.3 治疗后瘤组织的细胞凋亡 以生物素标定-dmTP免疫组化法标记，细胞核内出现棕色颗粒为阳性，即为凋亡细胞，以双盲法计算出每组各片、各视野的平均数，具体定量方法如下：①选择肿瘤内非坏死区及非边缘瘤组织；②用高倍镜计算每片单个视野中细胞总数；③每张切片中随机选择10个高倍视野，计算凋亡细胞总数，求出每片10个视野的凋亡比例(凋亡的细胞数/总细胞数×1000)，每组计数3片，然后计算出每组的平均数。结果表明蝎毒热疗组的细胞凋亡明显高于各单独治疗组(见表2)。
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3 讨论
蝎毒虽然有一定的毒性，但合理使用安全性较大，大量研究表明，蝎毒具有良好的抗癌效应[2～4]，因此我们研究了蝎毒对热疗的增敏效应并探讨了它的作用机制。
Lewis肺癌发生于C57BL小鼠，并用C57BL小鼠传代，它对热中度敏感，适于肿瘤热疗的实验，而NIH小鼠是生物学特性比较稳定的封闭群实验动物，研究证实，Lewis肺癌在C57BL小鼠和NIH小鼠后肢皮内的生长特性是一致的[5]，因此用荷Lewis肺癌的NIH小鼠做肿瘤热疗的实验模型是合适的。
中药的抗肿瘤作用缓慢而持久，因此临床上常采用多次口服的方法，而在热增敏研究中多主张药物配合热疗，仅使用一次，否则难以解释到底是其抗肿瘤作用还是增敏作用。我们在预实验中发现，小鼠一次腹腔注射蝎毒0.6mg/kg时未出现死亡，0.75mg/kg时出现死亡，其LD50为0.98±0.07mg/kg，所以我们采用一次腹腔注射蝎毒0.6mg/kg的剂量来研究其对热疗的增敏效应。基于国内外研究状况，采用43℃2 5分钟为热疗的剂量。
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肿瘤病人经过治疗，存活时间是重要的疗效指标。本研究观测荷瘤动物的AST和MDDT来评价治疗效果，由于在同一只动物身上观测这两个指标其结果是可靠和有参考价值的。
研究结果表明，一次性腹腔注射蝎毒0.6mg/kg和43℃ 25分钟局部热疗对荷Lewis肺癌的NIH小鼠瘤体均有抑制或杀伤作用，联合治疗效果明显好于单纯治疗，对荷瘤小鼠生存期的影响也是同样的结果，说明一次腹腔注射蝎毒0.6mg/kg对热疗有协同相加作用。至于d(蝎毒→热疗)等于d(蝎毒)+d(热疗)，考虑为一次使用蝎毒剂量较小，难以达到杀伤癌细胞的程度，提示在临床中改进给药方式及剂量，如多次用药并配合热疗将会取得更好的疗效。
从瘤组织的病理观察看来，各治疗组均可引起肿瘤组织的坏死，联合治疗效果更为突出。
细胞凋亡是细胞的程序性死亡，组化实验发现，对照组的凋亡细胞极为少见，单纯治疗组中较为多见，蝎毒→热疗组明显多于单纯治疗组，表明蝎毒、热疗均可诱发细胞凋亡，而联合治疗的诱发作用更为突出。高倍镜观察非坏死区细胞形态，发现在治疗组的癌组织中有明显凋亡细胞，其结果支持用免疫组化实验所得出的细胞凋亡结果。说明细胞凋亡是肿瘤组织被杀伤的主要机制。
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研究表明，蝎毒不仅有抗肿瘤作用，而且对热疗有增敏作用，诱发细胞凋亡是其抗肿瘤的主要机制，它可能是一种值得开发应用的抗肿瘤药物。
参 考 文 献
1 孔天翰，董伟华，田中岭.全蝎及蝎毒抗肿瘤研究进展.河南肿瘤学杂志，1994，7(3)：244.
2 董伟华，孔天翰，郑智敏，等.河南马氏钳蝎粗毒对体外培养的人食管癌细胞株(Eca 109)的毒性.中国病理生理杂志，1992，8(1)：25.
3 吴保平，高春芳，张亚历，等.东亚钳蝎毒生物提取物对大肠癌细胞的体外抑杀实验.中国肛肠病杂志，1993，(4)：3.
4 董伟华，臧梦维，孔天翰，等.蝎毒组分Ⅱ对人喉癌细胞毒性的研究.中国医药学报，1994，9(4)：201.
5 吴细丕，曾金英.NIH小鼠和加温.中国实验动物学报，1993，1(2)：113., http://www.100md.com
单位：贺会江、黄静、黄传继、高春芳：洛阳市(471031) 洛阳解放军150医院肿瘤科； 祁超：郑州市(450002) 河南医科大学附院肿瘤科； 吴细丕：郑州市(450003) 河南省肿瘤研究所
关键词：蝎毒 热增敏 倍增时间 生存时间 细胞凋亡
齐鲁肿瘤杂志990103 【摘 要】 目的 探讨蝎毒对热疗的增敏作用及作用机理。方法 将Lewis肺癌细胞接种在NIH小鼠的右后大腿皮下，当肿瘤平均直径达到6mm时开始实验，观察蝎毒(0.6mg/kg)、热疗(43℃25分钟)及其联合治疗组的肿瘤直径倍增时间(MDDT)、生存时间(AST)、病理改变和细胞凋亡变化。结果 对照组、蝎毒组、热疗组和蝎毒热疗组的MDDT分别为10.2±0.34天、11.5±0.38天、12.7±0.41天和14.1±0.42天，各治疗组均能延长荷瘤小鼠的生存期，引起肿瘤坏死，诱发细胞凋亡，尤以联合治疗效果明显。结论 蝎毒不仅有抗肿瘤作用，而且对热疗有增敏作用，诱发细胞凋亡是其抗肿瘤的主要机制之一。
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The effect of thermosensitization of scorpion venom
He Huijiang,Qi Chao,Huang Jing,et al.
The 150th Hospital of P.L.A.,Luoyang 471031
【Abstract】 Objective To determine the thermosensitization effect of Scorpion venom (SV) and its mechanism. Methods The Lewis lung carcinoma cells were implanted subcutaneously in right hind leg of the NIH mice.Treatment began when the tumors reached about 6mm in diameter.The effects of SV (0.6mg/kg),Thermotherapy (43℃,25min.HT) and their combination group (SV→HT) on mean diameter doubling time (MDDT),animal survival time (AST),tumor necrosis and apoptosis were observed.Results The MDDT for the control group,SV,HT and SV→HT were 10.2±0.34 days,11.5±0.38 days,12.7±0.41 days and 14.1±0.42 days, respectively.All treatment groups could prolong AST of the mice bearing Lewis lung cacinoma,induce tumor necrosis and apoptosis.The effects of SV→HT were better than the others.Conclusion Scorpion venom has antitumor and thermosensitive effect.Induce apoptosis is one of the antitumor mechanisms.
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【Key Words】 Scorpion venom Thermosensitization Doubling time (DT) Animal survival time (AST) Apoptosis
近年来，热疗逐渐成为肿瘤治疗的常用手段，由于高热对机体有损伤，限制了温度的提高，使疗效难以进一步提高，因此热增敏的研究正广泛展开。蝎毒是抗癌有效中药全蝎尾节毒囊的分泌物，具有良好的抗癌效应，合理使用安全性较大[1]。我们研究了蝎毒对热疗的增敏效应并探讨了其作用机制，从1983年至今国内外鲜见有关报道。
1 材料与方法
1.1 动物 NIH小鼠，由美国引进，河南省肿瘤研究所繁殖。雌雄各半。6～8周龄，体重18～22g，每组10只。普通饲料喂养，室温18～22℃，湿度60%±5%，饲料及垫料均经消毒处理。实验前小鼠适应环境3天。
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1.2 移植性实验肿瘤 Lewis肺癌细胞株购自中国医科院药物所，C57BL小鼠传代保种。
1.3 药物 蝎毒由洛阳解放军济南军区肛肠中心提供。用无菌生理盐水配制浓度为0.06g/L溶液，4℃冰箱保存；程序性细胞死亡检测试剂盒由美国进口，华美生物工程公司分装、提供。
1.4 加温 肿瘤的局部加温在精密恒温水浴箱中进行。水温用贝克曼温度计(精确度0.01℃)校正，水浴温度控制在±0.01℃以内。荷瘤动物用戊巴比妥钠腹腔麻醉，60mg/kg，将其荷瘤腿浸入水浴中并使瘤体低于水面至少5mm，加温43℃ 25分钟。
1.5 方法 无菌条件下将生长良好的Lewis肺癌病灶从荷瘤小鼠腋下取出，选取正常瘤块，剪碎后用生理盐水按1∶3匀浆、稀释，去掉残渣，以5×105肿瘤细胞接种于NIH小鼠右后肢外侧皮内。随机分为蝎毒组、热疗组、蝎毒→热疗组、盐水对照组，接种后6天左右用游标卡尺测量肿瘤的三个互相垂直的直径，取其平均值(MD)，当MD达到6mm左右时开始实验，蝎毒组一次性腹腔注射蝎毒0.6mg/kg，热疗组按前述要求进行，盐水对照组同样进行腹腔麻醉、等容生理盐水腹腔注射、37℃ 25分钟加温，实验中蝎毒与热疗的联合应用，时间间隔不超过10分钟，上述治疗仅进行一次。
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1.6 观察指标
(1)实验开始后，每隔一天测量一次肿瘤MD。当动物肿瘤MD达到治疗开始时的2倍以上时，停止测量，计算肿瘤倍增时间(MDDT)。被治疗动物一直饲养到自然死亡，计算其存活时间(AST)，即自接种到死亡的天数。
(2)实验开始后第3天脱颈处死小鼠，完整剥离瘤体，10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，取病理切片。一组HE染色，光镜观察肿瘤组织的坏死及细胞形态改变；另一组进行免疫组化实验，观察细胞程序性死亡即凋亡情况。
(3)疗效判断方法：计算各观察组与对照组的MD之差即为d值。若d(联合组)大于或等于d(各个单纯治疗组)之和，为协同相加作用，即增敏作用；若d(联合组)小于d(各个单纯治疗组)之和，为拮抗作用。
2 结果
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2.1 对荷瘤小鼠瘤体和小鼠生存期的影响 d(蝎毒→热疗)等于d(蝎毒)+d(热疗)，说明蝎毒对热疗有协同相加作用。所有治疗组均可延长荷瘤小鼠生存期，联合治疗组效果好于单纯治疗组(表1)。
表1 蝎毒对热疗的增敏意义
组别
例数
MDDT(天)
AST(天)
P※
±sP※
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d
对照
10
10.2±0.34
31.0±2.4
蝎毒
10
11.5±0.38
<0.05
1.3
45.5±3.2
<0.01
热疗
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10
12.7±0.41
<0.05
2.5
43.8±3.1
<0.01
蝎→热
10
14.1±0.42
<0.01
3.9
47.3±3.4
<0.01
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※ 均与对照组比较
2.2 治疗后瘤组织的病理改变 通过双盲法观察低倍镜下各组坏死区所占瘤组织的面积比例，可以看出蝎毒热疗组比单纯治疗组具有更强的抗肿瘤作用(表2)。
表2 蝎毒对瘤组织病理、细胞凋亡的影响
组别
例数
坏死区
细胞凋亡
(‰)
计算细胞
总数
对照
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3
小局灶
2.04
3640
蝎毒
3
1/6～1/7
8.07
3640
热疗
3
1/4～1/3
7.15
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蝎→热
3
1/3～1/2
10.71
3640
高倍镜观察非坏死区细胞形态，发现在治疗组癌组织中有明显凋亡细胞，表现为：①有凋亡小体(即胞浆内出现的染色质颗粒)；②核固缩核膜厚薄不均，出现皱壁；③染色质积聚成大颗粒，贴近核膜；④细胞肿胀、胞浆红染。对高倍视野内凋亡细胞数进行统计，结果发现与组化方法细胞程序死亡实验得出的结果相同。
2.3 治疗后瘤组织的细胞凋亡 以生物素标定-dmTP免疫组化法标记，细胞核内出现棕色颗粒为阳性，即为凋亡细胞，以双盲法计算出每组各片、各视野的平均数，具体定量方法如下：①选择肿瘤内非坏死区及非边缘瘤组织；②用高倍镜计算每片单个视野中细胞总数；③每张切片中随机选择10个高倍视野，计算凋亡细胞总数，求出每片10个视野的凋亡比例(凋亡的细胞数/总细胞数×1000)，每组计数3片，然后计算出每组的平均数。结果表明蝎毒热疗组的细胞凋亡明显高于各单独治疗组(见表2)。
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蝎毒虽然有一定的毒性，但合理使用安全性较大，大量研究表明，蝎毒具有良好的抗癌效应[2～4]，因此我们研究了蝎毒对热疗的增敏效应并探讨了它的作用机制。
Lewis肺癌发生于C57BL小鼠，并用C57BL小鼠传代，它对热中度敏感，适于肿瘤热疗的实验，而NIH小鼠是生物学特性比较稳定的封闭群实验动物，研究证实，Lewis肺癌在C57BL小鼠和NIH小鼠后肢皮内的生长特性是一致的[5]，因此用荷Lewis肺癌的NIH小鼠做肿瘤热疗的实验模型是合适的。
中药的抗肿瘤作用缓慢而持久，因此临床上常采用多次口服的方法，而在热增敏研究中多主张药物配合热疗，仅使用一次，否则难以解释到底是其抗肿瘤作用还是增敏作用。我们在预实验中发现，小鼠一次腹腔注射蝎毒0.6mg/kg时未出现死亡，0.75mg/kg时出现死亡，其LD50为0.98±0.07mg/kg，所以我们采用一次腹腔注射蝎毒0.6mg/kg的剂量来研究其对热疗的增敏效应。基于国内外研究状况，采用43℃2 5分钟为热疗的剂量。
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肿瘤病人经过治疗，存活时间是重要的疗效指标。本研究观测荷瘤动物的AST和MDDT来评价治疗效果，由于在同一只动物身上观测这两个指标其结果是可靠和有参考价值的。
研究结果表明，一次性腹腔注射蝎毒0.6mg/kg和43℃ 25分钟局部热疗对荷Lewis肺癌的NIH小鼠瘤体均有抑制或杀伤作用，联合治疗效果明显好于单纯治疗，对荷瘤小鼠生存期的影响也是同样的结果，说明一次腹腔注射蝎毒0.6mg/kg对热疗有协同相加作用。至于d(蝎毒→热疗)等于d(蝎毒)+d(热疗)，考虑为一次使用蝎毒剂量较小，难以达到杀伤癌细胞的程度，提示在临床中改进给药方式及剂量，如多次用药并配合热疗将会取得更好的疗效。
从瘤组织的病理观察看来，各治疗组均可引起肿瘤组织的坏死，联合治疗效果更为突出。
细胞凋亡是细胞的程序性死亡，组化实验发现，对照组的凋亡细胞极为少见，单纯治疗组中较为多见，蝎毒→热疗组明显多于单纯治疗组，表明蝎毒、热疗均可诱发细胞凋亡，而联合治疗的诱发作用更为突出。高倍镜观察非坏死区细胞形态，发现在治疗组的癌组织中有明显凋亡细胞，其结果支持用免疫组化实验所得出的细胞凋亡结果。说明细胞凋亡是肿瘤组织被杀伤的主要机制。
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研究表明，蝎毒不仅有抗肿瘤作用，而且对热疗有增敏作用，诱发细胞凋亡是其抗肿瘤的主要机制，它可能是一种值得开发应用的抗肿瘤药物。
参 考 文 献
1 孔天翰，董伟华，田中岭.全蝎及蝎毒抗肿瘤研究进展.河南肿瘤学杂志，1994，7(3)：244.
2 董伟华，孔天翰，郑智敏，等.河南马氏钳蝎粗毒对体外培养的人食管癌细胞株(Eca 109)的毒性.中国病理生理杂志，1992，8(1)：25.
3 吴保平，高春芳，张亚历，等.东亚钳蝎毒生物提取物对大肠癌细胞的体外抑杀实验.中国肛肠病杂志，1993，(4)：3.
4 董伟华，臧梦维，孔天翰，等.蝎毒组分Ⅱ对人喉癌细胞毒性的研究.中国医药学报，1994，9(4)：201.
5 吴细丕，曾金英.NIH小鼠和加温.中国实验动物学报，1993，1(2)：113., http://www.100md.com