复聪片对老年大鼠蜗内神经结构影响的实验研究①
作者：刘佳运 徐绍勤 彭 斌 李凡成
单位：刘佳运 徐绍勤 彭 斌 李凡成(湖南中医学院附属第二医院 长沙410005)
关键词：复聪片；大鼠；老年性聋；耳蜗；神经结构；黄芪 淫羊藿
湖南中医学院学报/990101 提要 为探讨复聪片防治老年性聋的机制，以老年大鼠疆孔内神经纤维和螺旋神经为观察指标，发现复聪片能有效支持上述蜗内神经结构。提示蜗内神经结构的退变可能是老年性聋的主要病理基础。复聪片支持蜗内神经结构可能基于如下途径：1)促进神经生长因子与其受体的结合；2)通过保护毛细胞，间接促进神经生长因子的产生。
中国图书分类号 R764.43
复聪片是我院谭敬书教授治疗耳聋的有效验方，用之于老年性聋疗效颇佳。为深入探讨其治疗机制，我们进行了本项实验，现概述如下。
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1 材料与方法
1.1 药物
复聪片浓缩煎剂和生理盐水。复聪片由熟地、骨碎补、淫羊藿、当归、川芎、磁石、丹参、水蛭、石菖蒲等药组成，其浓缩煎剂每ml含生药量lg。以上药物均由湖南中医学院附二院制剂室提供。
1.2 实验动物及分组
健康6月龄SD大鼠10只，体重130～150g，平均(138.4±20.8)g，18月龄健康SD大鼠24只，体重400～500g，平均(453.7±47.4)g，均雌雄各半，由上海必凯实验动物中心提供。
将18月龄大鼠在低噪音环境下，普通饲料喂养半年后，与第二批购得的6月龄大鼠同室适应性喂养1周，并剔除中耳有炎性改变的动物。10只6月龄大鼠为青年对照组。24只24月龄大鼠按体重分层，随机分为老年对照组，复聪片组，每组12只。
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1.3 实验方法
复聪片组：每天灌胃复聪片煎剂，按体表计算等效药量，为3.2g/kg/d，3个月后，处死取材。
老年对照组：每天灌胃生理盐水2.5ml/d，3个月后，处死取材。
青年对照组：未予任何药物，即行处死取材。
1.4 观察项目与标本制备
1.4.1 耳蜗疆孔内神经纤维计数 大鼠瞬间断头处死，取出右耳颞骨，打开听泡，暴露骨性耳蜗，挑开圆窗膜，充分暴露前庭窗并夹取镫骨底板，使鼓阶和前庭阶在两窗处开放，再于蜗尖打孔，2%戊二醛(pH＝7.4)蜗尖灌流固定7～8次。将耳蜗浸入上述固定液4℃冷藏固定24h。随后以0.1M EDTA(pH＝7.4)脱钙7天，PBS缓冲液漂洗后，梯度酒精脱水，石蜡包埋。用石蜡切片机平行蜗轴中轴面连续切片，片厚5μm，透明后以1%复制伊红染色，封片，于1000倍光镜下观察，选取第二回中段骨螺旋板内5个疆孔，计数神经纤维。
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1.4.2 扫描电镜标本准备 选取光镜标本后的第1～5张石蜡连续切片，二甲苯充分脱蜡后，梯度酒精脱水，醋酸异戊脂置换，日立HCP1-2型临界点干燥仪干燥，IB-5型离子溅射仪喷镀白金，在日立H-500型扫描电镜下观察。
1.4.3 透射电镜标本制备 耳蜗同前法灌流固定后，在解剖显微镜下尽量修薄耳蜗岩侧骨质，沿蜗尖方向，以眼科弯剪小心开放蜗神经孔。线性挑开耳蜗壶侧骨壁，尽可能地暴露壶侧螺旋韧带，再以弯剪从耳蜗基底岩侧骨质沿耳蜗盘旋方向轻剪，崩去岩侧骨质，充分孤立蜗轴，以细针在底回起始段截断蜗轴，将蜗轴以1%锇酸后固定24h，梯度丙酮脱水、Epon-821包埋，行超薄切片，铅铀染。置日立H-600型透射电镜下观察。
2 结果
2.1 一般情况
3个月内，老年对照组、复聪片组分别死亡3只、2只，经尸检证实为呼吸系统感染所致。
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2.2 疆孔神经纤维计数
大鼠随增龄，疆孔内神经纤维数目降低。27月龄的老年对照组疆孔内神经纤维数目与6月龄大鼠有非常显著性差异。而复聪片组神经纤维数目虽较6月龄大鼠为少(P<0.05)，但显著高于老年对照组(P<0.05)，表明复聪片能有效保护支持蜗内神经结构，见表1。
附表 神经纤维数 (
±s) 组 别
月龄
耳数
神经纤维数(根)
Ⅰ青年对照组
6
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10
128.6±17.5
Ⅱ复聪片组
27
10
99.4±21.6
Ⅲ老年对照组
27
9
72.3±15.6
F＝21.45，P<0.01 Ⅰ与Ⅱ，F＝4.45，P<0.05
Ⅰ与Ⅲ，F＝9.96，P<0.01 Ⅱ与Ⅲ，F＝4.32，P<0.05
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2.3 扫描电镜
扫描电镜下，老年对照组疆孔内神经纤维表现为大团纤维间出现空白区，并可见少量粘丝样残留，少数动物可见神经纤维肿胀(附图1)。复聪片组疆孔内神经纤维呈基本正常排列(附图2)。
2.4 透射电镜
透射电镜下，老年对照组动物螺旋神经节细胞线粒体肿胀，嵴紊乱、断裂或消失，呈空泡样变。胞浆出现密集水泡和高密度电子颗粒堆积。神经纤维表现微管融合不清，纤维内线粒体尚正常(附图3)。复聪片组大部分螺旋神经节细胞内线粒体嵴、溶酶体、内质网等细胞器清晰可辨(附图4)，表明损害较空白组明显为轻。
1、老年对照组，疆孔内神经纤维缺失，并见牵丝样残留。5000×
, http://www.100md.com 2、复聪片组，疆孔内神经纤维呈基本正常排列。5000×
3、老年对照组，螺旋神经节细胞内线粒体肿胀，嵴紊乱或消失，呈空泡样变。20000×
4、复聪片组，螺旋神经节细胞内各细胞器清晰可辨。
30000×
附图 疆孔内神经纤维和螺旋神经电镜图
3 讨论
神经型老年性聋仅为Schukneckt所划分的四型老年聋之一，然而，较多的研究表明这四型界限并不是那样清楚。血管纹、支持细胞、毛细胞，尤其是后者，作为对听神经元的发生和保持正常起着重要作用的多种营养因子的来源，它们的退变均可导致蜗内神经结构的退变[1]。同时也有证据表明听神经元的病变可以通过疆孔内神经纤维导致耳蜗毛细胞的坏死。周边的病变也可以通过疆孔内神经纤维引起听神经元的退变[2]，因此，观察蜗内神经结构的改变可以较全面地了解老年性聋的发生程度。也由于疆孔是螺旋神经节与Corti氏器联系的唯一通道，其中有神经纤维和血管通过，因此疆孔内的神经纤维数量可以作为研究耳蜗神经分布和神经元病变的客观指标之一。
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音觉的产生首先须由毛细胞将声能转化为电信号，经神经纤维的传输和听神经元的编码后再传至听觉中枢。神经纤维的变性和缺失必然导致音信号传输数量和速率的下降，也必然导致听力下降。同时，螺旋神经节的变性会使其对音信号的处理和编码功能下降，使听中枢音定位结构紊乱，最终使听中枢对听力下降的自我修复效果下降。
复聪片具补肾填精，益气养血，通窍聪耳功能，其中主药黄芪、淫羊藿等能促进神经生长因子与其受体的结合[3]。神经生长因子是神经元重要的存活剂和轴突形成的催化剂，对防止神经元变性并促使神经元及其支配的纤维的修复有着重要作用。复聪片中的一些活血药物可以通过增加耳蜗血流量，改善Corti氏器血氧分压，为毛细胞换能提供能量，从而达到保护毛细胞的目的[4]。毛细胞是多种神经营养因子的来源之一，保护毛细胞亦可间接支持蜗内神经结构。
①国家新药研究基金课题(1994.101)
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参考文献
[1] Ph.P.Leferbvre,B.Malgrange,T.Vater Water and Moonen Regeration of the neurosensory sturctures in the mammalion inner ear Acta oto-rhinolaryngologica belg 1997,(51):1～10
[2] Zheng XY,Henderson D.Mc Fadden SL,et al.The role of the cochlear efferent system in acquired resistance to noise-induced hearing loss.Hearing Research,1997,104:191～203
[3] 江黎明，李志明，韩宝路.神经生长因子受体活性中草药及其成分的筛选.中草药，1994，25：79～81
[4] 徐绍勤，刘佳运，彭斌，等.复聪片及拆方拮抗豚鼠庆大霉素耳毒性反应的实验研究.中西医结合杂志，1998，18(6)：365～367
(收稿日期 1998-11-18)
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单位：刘佳运 徐绍勤 彭 斌 李凡成(湖南中医学院附属第二医院 长沙410005)
关键词：复聪片；大鼠；老年性聋；耳蜗；神经结构；黄芪 淫羊藿
湖南中医学院学报/990101 提要 为探讨复聪片防治老年性聋的机制，以老年大鼠疆孔内神经纤维和螺旋神经为观察指标，发现复聪片能有效支持上述蜗内神经结构。提示蜗内神经结构的退变可能是老年性聋的主要病理基础。复聪片支持蜗内神经结构可能基于如下途径：1)促进神经生长因子与其受体的结合；2)通过保护毛细胞，间接促进神经生长因子的产生。
中国图书分类号 R764.43
复聪片是我院谭敬书教授治疗耳聋的有效验方，用之于老年性聋疗效颇佳。为深入探讨其治疗机制，我们进行了本项实验，现概述如下。
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1 材料与方法
1.1 药物
复聪片浓缩煎剂和生理盐水。复聪片由熟地、骨碎补、淫羊藿、当归、川芎、磁石、丹参、水蛭、石菖蒲等药组成，其浓缩煎剂每ml含生药量lg。以上药物均由湖南中医学院附二院制剂室提供。
1.2 实验动物及分组
健康6月龄SD大鼠10只，体重130～150g，平均(138.4±20.8)g，18月龄健康SD大鼠24只，体重400～500g，平均(453.7±47.4)g，均雌雄各半，由上海必凯实验动物中心提供。
将18月龄大鼠在低噪音环境下，普通饲料喂养半年后，与第二批购得的6月龄大鼠同室适应性喂养1周，并剔除中耳有炎性改变的动物。10只6月龄大鼠为青年对照组。24只24月龄大鼠按体重分层，随机分为老年对照组，复聪片组，每组12只。
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1.3 实验方法
复聪片组：每天灌胃复聪片煎剂，按体表计算等效药量，为3.2g/kg/d，3个月后，处死取材。
老年对照组：每天灌胃生理盐水2.5ml/d，3个月后，处死取材。
青年对照组：未予任何药物，即行处死取材。
1.4 观察项目与标本制备
1.4.1 耳蜗疆孔内神经纤维计数 大鼠瞬间断头处死，取出右耳颞骨，打开听泡，暴露骨性耳蜗，挑开圆窗膜，充分暴露前庭窗并夹取镫骨底板，使鼓阶和前庭阶在两窗处开放，再于蜗尖打孔，2%戊二醛(pH＝7.4)蜗尖灌流固定7～8次。将耳蜗浸入上述固定液4℃冷藏固定24h。随后以0.1M EDTA(pH＝7.4)脱钙7天，PBS缓冲液漂洗后，梯度酒精脱水，石蜡包埋。用石蜡切片机平行蜗轴中轴面连续切片，片厚5μm，透明后以1%复制伊红染色，封片，于1000倍光镜下观察，选取第二回中段骨螺旋板内5个疆孔，计数神经纤维。
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1.4.2 扫描电镜标本准备 选取光镜标本后的第1～5张石蜡连续切片，二甲苯充分脱蜡后，梯度酒精脱水，醋酸异戊脂置换，日立HCP1-2型临界点干燥仪干燥，IB-5型离子溅射仪喷镀白金，在日立H-500型扫描电镜下观察。
1.4.3 透射电镜标本制备 耳蜗同前法灌流固定后，在解剖显微镜下尽量修薄耳蜗岩侧骨质，沿蜗尖方向，以眼科弯剪小心开放蜗神经孔。线性挑开耳蜗壶侧骨壁，尽可能地暴露壶侧螺旋韧带，再以弯剪从耳蜗基底岩侧骨质沿耳蜗盘旋方向轻剪，崩去岩侧骨质，充分孤立蜗轴，以细针在底回起始段截断蜗轴，将蜗轴以1%锇酸后固定24h，梯度丙酮脱水、Epon-821包埋，行超薄切片，铅铀染。置日立H-600型透射电镜下观察。
2 结果
2.1 一般情况
3个月内，老年对照组、复聪片组分别死亡3只、2只，经尸检证实为呼吸系统感染所致。
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2.2 疆孔神经纤维计数
大鼠随增龄，疆孔内神经纤维数目降低。27月龄的老年对照组疆孔内神经纤维数目与6月龄大鼠有非常显著性差异。而复聪片组神经纤维数目虽较6月龄大鼠为少(P<0.05)，但显著高于老年对照组(P<0.05)，表明复聪片能有效保护支持蜗内神经结构，见表1。
附表 神经纤维数 (
±s) 组 别月龄
耳数
神经纤维数(根)
Ⅰ青年对照组
6
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10
128.6±17.5
Ⅱ复聪片组
27
10
99.4±21.6
Ⅲ老年对照组
27
9
72.3±15.6
F＝21.45，P<0.01 Ⅰ与Ⅱ，F＝4.45，P<0.05
Ⅰ与Ⅲ，F＝9.96，P<0.01 Ⅱ与Ⅲ，F＝4.32，P<0.05
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2.3 扫描电镜
扫描电镜下，老年对照组疆孔内神经纤维表现为大团纤维间出现空白区，并可见少量粘丝样残留，少数动物可见神经纤维肿胀(附图1)。复聪片组疆孔内神经纤维呈基本正常排列(附图2)。
2.4 透射电镜
透射电镜下，老年对照组动物螺旋神经节细胞线粒体肿胀，嵴紊乱、断裂或消失，呈空泡样变。胞浆出现密集水泡和高密度电子颗粒堆积。神经纤维表现微管融合不清，纤维内线粒体尚正常(附图3)。复聪片组大部分螺旋神经节细胞内线粒体嵴、溶酶体、内质网等细胞器清晰可辨(附图4)，表明损害较空白组明显为轻。
1、老年对照组，疆孔内神经纤维缺失，并见牵丝样残留。5000×
, http://www.100md.com 2、复聪片组，疆孔内神经纤维呈基本正常排列。5000×
3、老年对照组，螺旋神经节细胞内线粒体肿胀，嵴紊乱或消失，呈空泡样变。20000×
4、复聪片组，螺旋神经节细胞内各细胞器清晰可辨。
30000×
附图 疆孔内神经纤维和螺旋神经电镜图
3 讨论
神经型老年性聋仅为Schukneckt所划分的四型老年聋之一，然而，较多的研究表明这四型界限并不是那样清楚。血管纹、支持细胞、毛细胞，尤其是后者，作为对听神经元的发生和保持正常起着重要作用的多种营养因子的来源，它们的退变均可导致蜗内神经结构的退变[1]。同时也有证据表明听神经元的病变可以通过疆孔内神经纤维导致耳蜗毛细胞的坏死。周边的病变也可以通过疆孔内神经纤维引起听神经元的退变[2]，因此，观察蜗内神经结构的改变可以较全面地了解老年性聋的发生程度。也由于疆孔是螺旋神经节与Corti氏器联系的唯一通道，其中有神经纤维和血管通过，因此疆孔内的神经纤维数量可以作为研究耳蜗神经分布和神经元病变的客观指标之一。
, 百拇医药
音觉的产生首先须由毛细胞将声能转化为电信号，经神经纤维的传输和听神经元的编码后再传至听觉中枢。神经纤维的变性和缺失必然导致音信号传输数量和速率的下降，也必然导致听力下降。同时，螺旋神经节的变性会使其对音信号的处理和编码功能下降，使听中枢音定位结构紊乱，最终使听中枢对听力下降的自我修复效果下降。
复聪片具补肾填精，益气养血，通窍聪耳功能，其中主药黄芪、淫羊藿等能促进神经生长因子与其受体的结合[3]。神经生长因子是神经元重要的存活剂和轴突形成的催化剂，对防止神经元变性并促使神经元及其支配的纤维的修复有着重要作用。复聪片中的一些活血药物可以通过增加耳蜗血流量，改善Corti氏器血氧分压，为毛细胞换能提供能量，从而达到保护毛细胞的目的[4]。毛细胞是多种神经营养因子的来源之一，保护毛细胞亦可间接支持蜗内神经结构。
①国家新药研究基金课题(1994.101)
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参考文献
[1] Ph.P.Leferbvre,B.Malgrange,T.Vater Water and Moonen Regeration of the neurosensory sturctures in the mammalion inner ear Acta oto-rhinolaryngologica belg 1997,(51):1～10
[2] Zheng XY,Henderson D.Mc Fadden SL,et al.The role of the cochlear efferent system in acquired resistance to noise-induced hearing loss.Hearing Research,1997,104:191～203
[3] 江黎明，李志明，韩宝路.神经生长因子受体活性中草药及其成分的筛选.中草药，1994，25：79～81
[4] 徐绍勤，刘佳运，彭斌，等.复聪片及拆方拮抗豚鼠庆大霉素耳毒性反应的实验研究.中西医结合杂志，1998，18(6)：365～367
(收稿日期 1998-11-18)
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