慢性染铅对大鼠海马区神经细胞Ca2+浓度及Ca2+-ATP酶活性的影响
作者：刘素媛 孙黎光 邢伟 万伯建
单位：刘素媛 孙黎光 邢 伟 (中国医科大学基础医学院生化教研室 沈阳 110001)； 万伯建 (中国医科大学预防医学系毒理教研室)
关键词：铅；细胞内Ca2+浓度；Ca2+-ATP酶
卫生毒理学杂志990105 内容摘要 目的：观察慢性染铅对大鼠海马区神经细胞Ca2+浓度及Ca2+-ATP酶活性的影响。方法：用0.15%醋酸铅饲养大鼠建立慢性染铅动物模型，参照Dildy法和徐友涵法测定海马神经细胞Ca2+浓度及Ca2+-ATP酶活性。结果发现：细胞内Ca2+浓度，染铅组(203.83±30.50)nmol/L,对照组(97.62±19.83)nmol/L，t=8.31 P<0.005；Ca2+-ATP酶活性，染铅组(326.42±40.06)nmol(Pi).mg-1.min-1，对照组(253.07±25.40)nmol(Pi).mg-1.min-1，t=3.54，P<0.01。结论：慢性染铅可使大鼠海马区神经细胞内Ca2+浓度升高，Ca2+-ATP酶活性增强。
, 百拇医药
The effect of chronic lead exposure on hippocampal intraneuronal [Ca2+] and activity of Ca2+-ATPase in rats
Liu Su-yuan Sun Li-guang Xing Wei et al.
(Depart.of Biochemistry,China Medical University,Shenyang,110001)
The objective of this experiment is to study the effect of lead on intracellular[Ca2+] and the relationship between Ca2+ level and Ca2+-ATPase.Method:Chronic lead-treated animal model is acquired by feeding the rats with 0.15% Pb(Ac)2 in drinking water for 3 months.Intracellular[Ca2+] and activity of Ca2+-ATPase are determined with dildy and a respectively.Result:1.Intracellular[Ca2+]lead-treated group:203.83±30.50nmol/L control group:97.62±19.83nmol/L(P<0.005)； 2.Ca2+-ATPase activity:lead-treated group:326.42±40.06nmol pi mg-1 min-1,control group:253.07±25.40nmol pi ng-1 min-1 (P<0.01).Conclusion chronic leadexposure can significantly increase intracellular Ca2+ level and activity of Ca2+-ATPase.in hippocampal neurons.
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Key words:lead;Intracellular free Ca2+ concentration;Ca2+-ATPase
海马区是大脑边缘系统一个非常重要的结构区域，与学习记忆、情感行为及神经内分泌等高级神经活动密切相关。1973年Bliss等在家兔海马区应用高频刺激引起群体锋电位及突触后膜电位呈现长时间持续增强，并将这一现象称为长时程增强(Long-term potentiation,LTP)。后来的许多研究证明LTP与学习、记忆功能密切相关，是学习和记忆储存的功能单位。Ca2+参与LTP的诱发及维持，尤其在LTP的诱发阶段起重要作用；铅可影响细胞内Ca2+水平进而干扰LTP，引起中枢神经系统功能紊乱，学习和记忆能力下降。离体脑片急性铅处理后细胞内Ca2+浓度升高，Ca2+-ATP酶活性降低[1，2]，本实验用醋酸铅饲养Wistar大鼠建立慢性染铅动物模型，观察慢性染铅对大鼠海马区神经细胞内Ca2+浓度及Ca2+-ATP酶活性的影响，取得了很好的结果，为进一步研究慢性染铅与细胞内Ca2+浓度及LTP之间的关系打下基础。
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材料与方法
1.材料：实验用Wistar大鼠由中国医科大学实验动物部提供；Fura-2/Am购自北京医科院药物所，ATP购自Sigma公司，其余试剂分析纯。
2.方法：
(1)染铅动物模型：选断乳后健康、雄性Wistar大鼠，体重30g，随机分成实验组和对照组，对照组饮蒸馏水，实验组饮0.15%醋酸铅水溶液，3个月后用于各项指标测定。
(2)大鼠血铅浓度测定：原子吸收石墨炉法。
(3)海马区神经细胞分离及Ca2+浓度测定：参照文献[3，4]方法，实验在0℃冰水浴中进行：新鲜海马加0.125%胰蛋白酶液于37℃消化20分，10%牛血清培养液终止消化后过200目不锈钢筛网，台氏液洗3次，用2%牛血清白蛋白台氏液稀释至细胞数106个/ml，取1ml细胞悬液加入Fura-2/Am(200μmol/L)10μl，37℃孵育45分，台氏液洗3次后将细胞悬于1ml台氏液中，测定荧光强度值(激发波长340nm，发射波长505nm)。
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(4)海马区神经细胞Ca2+-ATP酶活力测定：取海马加入1ml缓冲液(2mmol/L EDTA,10mmol/L EGTA，20mmol/L Tris-HCl pH7.4，250mmol/L Sucrose)，于冰水浴中超声粉碎，加10ml 50mmol pH7.4 Tris-HCl缓冲液，3000r/min离心10分，取上清33000r/min离心1小时，沉淀用50mmol pH7.4 Tris-HCl缓冲液洗1次，稀释至蛋白含量约0.1mg/ml，用于酶活力测定。Ca2+-ATP酶活力测定参照文献[5]方法，蛋白浓度测定按改良Lowry法，标准蛋白为牛血清白蛋白。
结果与讨论
铅作为环境中一种主要的神经毒物，其毒性作用机制已越来越为人们所关注，在分子水平多集中在铅与钙离子的关系上。Ca2+是细胞内重要的第二信使，在细胞活动的各种生理生化反应和疾病的发生发展中起着极其重要的作用。
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本实验中慢性染铅使大鼠海马神经细胞Ca2+浓度明显增加，与对照组相比差异非常显著(见附表)。胞浆Ca2+浓度升高可能有两方面的原因。一是Ca2+流入增加。Kaczmerek[6]的研究显示：PKC可激活钙通道使Ca2+流入增多，而Pg级的Pb2+即可激活PKC。我们以前的研究结果也证实，慢性染铅使大鼠海马区神经细胞PKC活性明显增加，并且胞浆PKC向胞膜转移。PKC激活后可减少Mg2+对电压依赖性钙通道的阻挡作用，使胞外Ca2+内流，同时使线粒体、内质网上钙通道激活，胞内钙贮备释放，胞浆Ca2+浓度升高。使Ca2+流出减少，胞内Ca2+流出主要依靠Ca2+-ATP酶的转运，该酶存在于细胞膜和内质网、线粒体膜上，将Ca2+从胞浆转运到胞外或内质网、线粒体内，是维持细胞Ca2+浓度稳定的重要酶类，任何抑制Ca2+-ATP酶活性的因素都可使胞内Ca2+流出受阻，浓度升高，体外急性染铅测得Pb2+可明显抑制Ca2+-ATP酶活性(IC50值为6μmol/L)[7]，我们测得慢性染铅组Ca2+-ATP酶活性明显增加，其活力为对照组的128.9%，差异非常显著(见附表)。这一结果与急性染铅的实验结果相反，可能与胞外Pb2+对Ca2+-ATP酶活性产生部分抑制作用，加之PKC激活后钙通道的进一步开放，胞外Ca2+流入增多，胞内钙贮备释放，使胞内Ca2+浓度处于高水平，从而刺激机体Ca2+-ATP酶合成增多有关，是机体的一种代偿机制，此结果提示在慢性染铅过程中Pb2+对Ca2+-ATP酶活性的抑制作用不是引起胞内Ca2+浓度升高的主要原因。
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附表 染铅大鼠海马区神经细胞Ca2+浓度和Ca2+-ATP酶活性的改变(
±s) 分组
n
细胞内Ca2+浓度
(nmol/L)
Ca2+-ATP酶活性
(nmol(Pi).mg-1.min-1)
血铅浓度
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(μmol/L)
染铅组
11
203.83±30.50**
326.42±40.06**
3.20±0.76**
对照组
13
97.62±19.83
253.07±25.40
0.25±0.12
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与对照组比较 **P<0.01
总之，在本实验条件下，铅引起大鼠海马区神经细胞Ca2+浓度升高，Ca2+-ATP酶活性增强。胞内Ca2+浓度的增高可影响LTP的产生及维持，导致中枢神经系统功能异常，但体内慢性染铅海马神经细胞Ca2+浓度增高情况下LTP的改变及与Ca2+有关的细胞内其它生化机制尚待进一步研究。
国家自然科学基金资助课题(39470620)
参考文献
1.Bettaiya R，Yallapragada PR，Hall E，et al.Ecotoxicol Environ Saf.1996,33(2):157～162.
2.Goldstein GW.Neurotoxicology，1993,14(2-3):97.
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3.Dildy J.Leslie S.Brain Res，1989,499:383～387.
4.Virgilio FD.Cell Calcium，1990，11:57～62.
5.徐友涵、宋
华.生物化学与生物物理进展.1986，(4)：162～165.
6.Kaczmerek LK.Trends Neurosci，1987,10:30～34.
7.AL.Modhefer A，Bradbury M，Simons T.Clin Sci，1991;(81):823～829.
(修回日期 1998年6月), http://www.100md.com
单位：刘素媛 孙黎光 邢 伟 (中国医科大学基础医学院生化教研室 沈阳 110001)； 万伯建 (中国医科大学预防医学系毒理教研室)
关键词：铅；细胞内Ca2+浓度；Ca2+-ATP酶
卫生毒理学杂志990105 内容摘要 目的：观察慢性染铅对大鼠海马区神经细胞Ca2+浓度及Ca2+-ATP酶活性的影响。方法：用0.15%醋酸铅饲养大鼠建立慢性染铅动物模型，参照Dildy法和徐友涵法测定海马神经细胞Ca2+浓度及Ca2+-ATP酶活性。结果发现：细胞内Ca2+浓度，染铅组(203.83±30.50)nmol/L,对照组(97.62±19.83)nmol/L，t=8.31 P<0.005；Ca2+-ATP酶活性，染铅组(326.42±40.06)nmol(Pi).mg-1.min-1，对照组(253.07±25.40)nmol(Pi).mg-1.min-1，t=3.54，P<0.01。结论：慢性染铅可使大鼠海马区神经细胞内Ca2+浓度升高，Ca2+-ATP酶活性增强。
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The effect of chronic lead exposure on hippocampal intraneuronal [Ca2+] and activity of Ca2+-ATPase in rats
Liu Su-yuan Sun Li-guang Xing Wei et al.
(Depart.of Biochemistry,China Medical University,Shenyang,110001)
The objective of this experiment is to study the effect of lead on intracellular[Ca2+] and the relationship between Ca2+ level and Ca2+-ATPase.Method:Chronic lead-treated animal model is acquired by feeding the rats with 0.15% Pb(Ac)2 in drinking water for 3 months.Intracellular[Ca2+] and activity of Ca2+-ATPase are determined with dildy and a respectively.Result:1.Intracellular[Ca2+]lead-treated group:203.83±30.50nmol/L control group:97.62±19.83nmol/L(P<0.005)； 2.Ca2+-ATPase activity:lead-treated group:326.42±40.06nmol pi mg-1 min-1,control group:253.07±25.40nmol pi ng-1 min-1 (P<0.01).Conclusion chronic leadexposure can significantly increase intracellular Ca2+ level and activity of Ca2+-ATPase.in hippocampal neurons.
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Key words:lead;Intracellular free Ca2+ concentration;Ca2+-ATPase
海马区是大脑边缘系统一个非常重要的结构区域，与学习记忆、情感行为及神经内分泌等高级神经活动密切相关。1973年Bliss等在家兔海马区应用高频刺激引起群体锋电位及突触后膜电位呈现长时间持续增强，并将这一现象称为长时程增强(Long-term potentiation,LTP)。后来的许多研究证明LTP与学习、记忆功能密切相关，是学习和记忆储存的功能单位。Ca2+参与LTP的诱发及维持，尤其在LTP的诱发阶段起重要作用；铅可影响细胞内Ca2+水平进而干扰LTP，引起中枢神经系统功能紊乱，学习和记忆能力下降。离体脑片急性铅处理后细胞内Ca2+浓度升高，Ca2+-ATP酶活性降低[1，2]，本实验用醋酸铅饲养Wistar大鼠建立慢性染铅动物模型，观察慢性染铅对大鼠海马区神经细胞内Ca2+浓度及Ca2+-ATP酶活性的影响，取得了很好的结果，为进一步研究慢性染铅与细胞内Ca2+浓度及LTP之间的关系打下基础。
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材料与方法
1.材料：实验用Wistar大鼠由中国医科大学实验动物部提供；Fura-2/Am购自北京医科院药物所，ATP购自Sigma公司，其余试剂分析纯。
2.方法：
(1)染铅动物模型：选断乳后健康、雄性Wistar大鼠，体重30g，随机分成实验组和对照组，对照组饮蒸馏水，实验组饮0.15%醋酸铅水溶液，3个月后用于各项指标测定。
(2)大鼠血铅浓度测定：原子吸收石墨炉法。
(3)海马区神经细胞分离及Ca2+浓度测定：参照文献[3，4]方法，实验在0℃冰水浴中进行：新鲜海马加0.125%胰蛋白酶液于37℃消化20分，10%牛血清培养液终止消化后过200目不锈钢筛网，台氏液洗3次，用2%牛血清白蛋白台氏液稀释至细胞数106个/ml，取1ml细胞悬液加入Fura-2/Am(200μmol/L)10μl，37℃孵育45分，台氏液洗3次后将细胞悬于1ml台氏液中，测定荧光强度值(激发波长340nm，发射波长505nm)。
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(4)海马区神经细胞Ca2+-ATP酶活力测定：取海马加入1ml缓冲液(2mmol/L EDTA,10mmol/L EGTA，20mmol/L Tris-HCl pH7.4，250mmol/L Sucrose)，于冰水浴中超声粉碎，加10ml 50mmol pH7.4 Tris-HCl缓冲液，3000r/min离心10分，取上清33000r/min离心1小时，沉淀用50mmol pH7.4 Tris-HCl缓冲液洗1次，稀释至蛋白含量约0.1mg/ml，用于酶活力测定。Ca2+-ATP酶活力测定参照文献[5]方法，蛋白浓度测定按改良Lowry法，标准蛋白为牛血清白蛋白。
结果与讨论
铅作为环境中一种主要的神经毒物，其毒性作用机制已越来越为人们所关注，在分子水平多集中在铅与钙离子的关系上。Ca2+是细胞内重要的第二信使，在细胞活动的各种生理生化反应和疾病的发生发展中起着极其重要的作用。
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本实验中慢性染铅使大鼠海马神经细胞Ca2+浓度明显增加，与对照组相比差异非常显著(见附表)。胞浆Ca2+浓度升高可能有两方面的原因。一是Ca2+流入增加。Kaczmerek[6]的研究显示：PKC可激活钙通道使Ca2+流入增多，而Pg级的Pb2+即可激活PKC。我们以前的研究结果也证实，慢性染铅使大鼠海马区神经细胞PKC活性明显增加，并且胞浆PKC向胞膜转移。PKC激活后可减少Mg2+对电压依赖性钙通道的阻挡作用，使胞外Ca2+内流，同时使线粒体、内质网上钙通道激活，胞内钙贮备释放，胞浆Ca2+浓度升高。使Ca2+流出减少，胞内Ca2+流出主要依靠Ca2+-ATP酶的转运，该酶存在于细胞膜和内质网、线粒体膜上，将Ca2+从胞浆转运到胞外或内质网、线粒体内，是维持细胞Ca2+浓度稳定的重要酶类，任何抑制Ca2+-ATP酶活性的因素都可使胞内Ca2+流出受阻，浓度升高，体外急性染铅测得Pb2+可明显抑制Ca2+-ATP酶活性(IC50值为6μmol/L)[7]，我们测得慢性染铅组Ca2+-ATP酶活性明显增加，其活力为对照组的128.9%，差异非常显著(见附表)。这一结果与急性染铅的实验结果相反，可能与胞外Pb2+对Ca2+-ATP酶活性产生部分抑制作用，加之PKC激活后钙通道的进一步开放，胞外Ca2+流入增多，胞内钙贮备释放，使胞内Ca2+浓度处于高水平，从而刺激机体Ca2+-ATP酶合成增多有关，是机体的一种代偿机制，此结果提示在慢性染铅过程中Pb2+对Ca2+-ATP酶活性的抑制作用不是引起胞内Ca2+浓度升高的主要原因。
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附表 染铅大鼠海马区神经细胞Ca2+浓度和Ca2+-ATP酶活性的改变(
±s) 分组n
细胞内Ca2+浓度
(nmol/L)
Ca2+-ATP酶活性
(nmol(Pi).mg-1.min-1)
血铅浓度
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(μmol/L)
染铅组
11
203.83±30.50**
326.42±40.06**
3.20±0.76**
对照组
13
97.62±19.83
253.07±25.40
0.25±0.12
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与对照组比较 **P<0.01
总之，在本实验条件下，铅引起大鼠海马区神经细胞Ca2+浓度升高，Ca2+-ATP酶活性增强。胞内Ca2+浓度的增高可影响LTP的产生及维持，导致中枢神经系统功能异常，但体内慢性染铅海马神经细胞Ca2+浓度增高情况下LTP的改变及与Ca2+有关的细胞内其它生化机制尚待进一步研究。
国家自然科学基金资助课题(39470620)
参考文献
1.Bettaiya R，Yallapragada PR，Hall E，et al.Ecotoxicol Environ Saf.1996,33(2):157～162.
2.Goldstein GW.Neurotoxicology，1993,14(2-3):97.
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3.Dildy J.Leslie S.Brain Res，1989,499:383～387.
4.Virgilio FD.Cell Calcium，1990，11:57～62.
5.徐友涵、宋
华.生物化学与生物物理进展.1986，(4)：162～165.6.Kaczmerek LK.Trends Neurosci，1987,10:30～34.
7.AL.Modhefer A，Bradbury M，Simons T.Clin Sci，1991;(81):823～829.
(修回日期 1998年6月), http://www.100md.com