急性坏死性胰腺炎血清TNF活性与胰组织损害
作者：田伯乐 张肇达 付 岚 陈晓理 严律南 蒋俊明
单位：田伯乐 张肇达 陈晓理 严律南 华西医科大学附属第一医院普外科(成都 610041)；付 岚 肿瘤生物治疗中心； 蒋俊明 中西医结合科
关键词：急性坏死性胰腺炎；肿瘤坏死因子；胰组织损害
中国普外基础与临床杂志990105 摘要 为了观察血清肿瘤坏死因子(TNF)活性与胰腺炎时胰组织损害的关系，采用胰胆管逆行注射法制成SD大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)模型，尔后分批处死动物，取血测定其血清TNF活性，并同步观察胰组织损害情况。结果：实验组(n＝30)血清TNF活性从0.5小时开始升高，4小时时达最高峰；胰腺病理损害随着时间的延长而逐渐加重；血清TNF活性与胰组织损害程度密切相关(r＝0.63，P<0.01)。由此提示，TNF对ANP的病理损害可能具有重要的促进作用。
, 百拇医药
A STUDY OF SERUM TUMOR NECROSIS FACTOR ACTIVITY AND PANCREATIC TISSUE DAMAGE IN ACUTE NECROTIZING PANCREATITIS
Tian Bole, Zhang Zhaoda, Fu Lan, et al.
Department of Surgery, First Affiliated Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
Abstract In order to observe activity of tumor necrosis factor (TNF) in the serum, pancreatic histopathological damage, as well as their relationships in acute necrotizing pancreatitis (ANP), thirty five SD rats were randomly divided into 7 groups according to their sampling time with 5 in each group. ANP was induced by retrograde infusion of 5% sodium taurocholate through biliopancreatic duct in 6 experimental groups (Group B1～B6).Blood and pancreatic tissue samples were obtained at hour 0,0.5,2,4,6 or 8 respectively when the animals were sacrificed.Results showed that serum level of TNF activity rose significantly in Group B2,and reached the maximal value in Group B4.The pancreatic histopathological damage in ANP rats was getting worse along with time. Serum TNF activity had close relation to pancreatic histopathological score (r=0.63, P<0.01),suggesting that serum TNF may play an important role in the process of deterioration of pancreatic tissue damage during ANP.
, 百拇医药
Key words Acute necrotizing pancreatitis Tumor necrosis factor Pancreatic tissue damage
急性坏死性胰腺炎(ANP)发病机理迄今尚不明确。90年代以来，人们开始注意到ANP伴有肿瘤坏死因子(TNF)等炎症介质的增多，部分实验还显示TNF的升高与病情严重程度相关〔1〕，但血清TNF活性与胰组织损害的关系目前尚无定论。本实验旨在通过动态观测ANP大鼠血清TNF活性的变化，探讨TNF与胰组织损害的关系，以期为用新的方法阻断ANP病程进展提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
健康雄性SD大鼠35只，体重200g左右，本校实验动物中心提供。随机分为7组，每组5只。A组为对照组，其余6组均为实验组。各实验组按同一方法制成ANP模型，并根据处死时间的不同分别命名为B1～B6组。
, 百拇医药
1.2 动物模型制作
各组动物术前12小时禁食，自由饮水。用3%戊巴比妥钠(5mg/100g)腹腔注射麻醉后在无菌条件下作上腹正中纵形切口入腹，看清胰胆管走向，用4.5号钝头针于十二指肠对系膜缘穿刺肠壁，在浆膜下潜行约0.3cm后再刺入肠腔，针头逆行插入胰胆管约0.2cm。用无损伤血管钳轻轻夹闭胰胆管肝门端，向实验组大鼠胰胆管内匀速逆行推注5%牛磺胆酸钠(Sigma公司) 0.1ml/100g体重，5分钟内推完，推注完毕取除胰胆管肝门端血管钳，关腹并开始计时。实验组推注药液后胰腺逐渐变苍白、肿胀，继而浆膜下出现瘀斑瘀点。对照组仅作胰胆管逆行插管和夹闭胰胆管肝门端5分钟，不注射任何药物，其余操作同实验组。
1.3 标本收集及检测
各实验组(B1～B6组)动物分别于术后0、0.5、2、4、6及8小时处死，对照组(A组)动物于术后8小时处死。然后在无菌条件下开腹，从下腔静脉采血2ml，血凝固后4 000r/min离心10分钟，取上清液-20℃保存。TNF测定采用传代细胞株L929生物活性法。按试剂说明书，TNF活性由下式算出：
, 百拇医药
各组大鼠处死时观察胰腺及胰周情况，并取相同部位胰腺组织用10%甲醛固定作病理学检查。
1.4 统计学处理
血清TNF活性和胰腺组织学评分结果用
±s表示，组间比较用方差分析；相关性分析采用等级相关分析。
2 结果
2.1 血清TNF活性
对照组(A组)可查见低水平TNF活性。实验组中，B1组血清TNF活性比A组稍有上升，但无统计学差异(P>0.05)。B2组开始明显升高，B4组达最高峰，以后逐渐降低(表1)。
表1 各组大鼠血清TNF活性(IU/ml，±s) 组别
, 百拇医药
n
TNF活性
A组
5
17.8±3.49
B1组
5
19.8±2.68
B2组
5
25.8±3.70*
B3组
, 百拇医药
5
44.2±4.82*
B4组
5
52.0±3.87*
B5组
5
40.8±2.95*
B6组
5
35.6±3.05*
, 百拇医药
*与A组比较，P<0.05
2.2 病理学检查
处死大鼠时见B2～B6组腹腔内有不等量的血性腹水，胰腺体积增大，呈紫红至紫黑色，胰周组织也出现不同程度的水肿。B1组胰腺呈苍白色，有散在瘀斑瘀点。A组无腹水，胰腺及腹腔其余脏器肉眼未见异常改变。光镜检查发现：A组部分大鼠胰腺有很轻微的水肿，偶见少量炎细胞浸润，无出血坏死；B1～B6组均见胰腺腺泡坏死，其病理改变及炎性反应随时间的延长逐渐明显。腺泡早期(B1～B3组)的病理改变为细胞体积增大、肿胀、胞浆嗜酸性减弱或消失、胞核体积增大、聚集成团；继后(B4～B6组)则表现为细胞周界消失、核崩解呈碎片状，同时可见明显的充血、水肿、大片出血坏死及大量炎细胞浸润。胰腺病理损害按改良Grewal标准〔2〕，对水肿、血管反应、脂肪坏死、腺泡坏死和炎细胞浸润情况进行评分，结果见表2。
, 百拇医药
表2 各组大鼠胰腺组织学评分(±s) 组别
n
评分结果
A组
5
0.8±0.27
B1组
5
2.5±0.79*△
B2组
, 百拇医药
5
3.5±0.71*
B3组
5
3.3±1.10*
B4组
5
4.2±1.15*△
B5组
5
4.2±0.62*
, http://www.100md.com
B6组
5
5.1±0.65*△
*与A组比较，P<0.05；△与各自上组比较，P<0.05
相关性分析发现，血清TNF活性与胰组织损害程度密切相关(r＝0.63，P<0.01)。
3 讨论
TNF是一种具有广泛生物活性的非特异性炎症介质。内源性TNF包括TNFα和TNFβ，虽然二者的主要来源不同，但却具有相似的生物学特性。脓毒症时TNF所起的不利作用已经引起人们的重视。ANP时由于胰酶入血、胰腺及胰周组织的破坏及并发感染等原因引起机体免疫系统的激活，大量炎症介质的释放，TNF是最早出现水平增高的炎症介质之一。适量的TNF对维持机体正常的免疫功能是必不可少的，而过量或持续存在的TNF则能导致白细胞的过度激活，机体产生超强的炎症反应，引起自身组织损伤〔3〕。
, 百拇医药
动物实验及临床研究均已证实急性胰腺炎时TNF增高，TNF的异常增高可能与胰腺炎时并发症的发生有关〔4，5〕，但与病情的严重程度及预后的关系尚有不同结论。本实验发现，制成大鼠ANP模型后半小时，血清TNF活性即显著上升，4小时时达最高峰。同时观察到，TNF活性高低与胰腺损害程度有显著相关性，从而说明TNF参与了ANP的病理损害过程。对照组也能测得低水平TNF活性，这可能与麻醉和手术创伤有关。
由于血循环中TNF半衰期短(5～25分钟)、血中TNF抑制物和可溶性TNF受体(sTNF-R)的干扰、胰腺炎症局部释放入血的大量水解酶的破坏以及患者入院时间的早迟、健康状况和免疫功能状态等因素均可对TNF的检测结果构成影响。加之血循环中TNFα和TNFβ以多种形式存在，而真正起作用的是其中具有生物活性那一小部分。因此，不同的检测方法也可能得出不同的实验结论。故TNF在人类ANP病理损害过程中的作用及地位尚需做更深入的研究。
参 考 文 献
, http://www.100md.com
1 Exley AR, Leese T, Holliday MP, et al. Endotoxaemia and tumor necrosis factor as prognostic markers in severe acute pancreatitis.Gut, 1992; 33(8)∶1126
2 Grewal HP, Mohey el Din A, Gaber L, et al. Amelioration of the physiologic and biochemical changes of acute pancreatitis using an anti-TNFα polyclonal antibody. Am J Surg, 1994; 167(1)∶214
3 Eichacker PQ, Hoffman WD, Farese A, et al. TNF but not IL-1 in dogs causes lethal injury and multiple organ dysfunction similar to human sepsis. J Appl Physiol, 1991; 71(5)∶1979
4 Mckay CJ, Gallayher G, Brooks B, et al. Increased monocyte cytokine production in association with systemic complication in acute pancreatitis. Br J Surg, 1996; 83(7)∶919
5 王建承，赵小团，袁祖荣等. 肿瘤坏死因子在急性胰腺炎及并发多器官衰竭中作用的研究. 中华医学杂志， 1995； 75(3)∶133
(1997-11-29收稿，1998-06-03修回), 百拇医药
单位：田伯乐 张肇达 陈晓理 严律南 华西医科大学附属第一医院普外科(成都 610041)；付 岚 肿瘤生物治疗中心； 蒋俊明 中西医结合科
关键词：急性坏死性胰腺炎；肿瘤坏死因子；胰组织损害
中国普外基础与临床杂志990105 摘要 为了观察血清肿瘤坏死因子(TNF)活性与胰腺炎时胰组织损害的关系，采用胰胆管逆行注射法制成SD大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)模型，尔后分批处死动物，取血测定其血清TNF活性，并同步观察胰组织损害情况。结果：实验组(n＝30)血清TNF活性从0.5小时开始升高，4小时时达最高峰；胰腺病理损害随着时间的延长而逐渐加重；血清TNF活性与胰组织损害程度密切相关(r＝0.63，P<0.01)。由此提示，TNF对ANP的病理损害可能具有重要的促进作用。
, 百拇医药
A STUDY OF SERUM TUMOR NECROSIS FACTOR ACTIVITY AND PANCREATIC TISSUE DAMAGE IN ACUTE NECROTIZING PANCREATITIS
Tian Bole, Zhang Zhaoda, Fu Lan, et al.
Department of Surgery, First Affiliated Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
Abstract In order to observe activity of tumor necrosis factor (TNF) in the serum, pancreatic histopathological damage, as well as their relationships in acute necrotizing pancreatitis (ANP), thirty five SD rats were randomly divided into 7 groups according to their sampling time with 5 in each group. ANP was induced by retrograde infusion of 5% sodium taurocholate through biliopancreatic duct in 6 experimental groups (Group B1～B6).Blood and pancreatic tissue samples were obtained at hour 0,0.5,2,4,6 or 8 respectively when the animals were sacrificed.Results showed that serum level of TNF activity rose significantly in Group B2,and reached the maximal value in Group B4.The pancreatic histopathological damage in ANP rats was getting worse along with time. Serum TNF activity had close relation to pancreatic histopathological score (r=0.63, P<0.01),suggesting that serum TNF may play an important role in the process of deterioration of pancreatic tissue damage during ANP.
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Key words Acute necrotizing pancreatitis Tumor necrosis factor Pancreatic tissue damage
急性坏死性胰腺炎(ANP)发病机理迄今尚不明确。90年代以来，人们开始注意到ANP伴有肿瘤坏死因子(TNF)等炎症介质的增多，部分实验还显示TNF的升高与病情严重程度相关〔1〕，但血清TNF活性与胰组织损害的关系目前尚无定论。本实验旨在通过动态观测ANP大鼠血清TNF活性的变化，探讨TNF与胰组织损害的关系，以期为用新的方法阻断ANP病程进展提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
健康雄性SD大鼠35只，体重200g左右，本校实验动物中心提供。随机分为7组，每组5只。A组为对照组，其余6组均为实验组。各实验组按同一方法制成ANP模型，并根据处死时间的不同分别命名为B1～B6组。
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1.2 动物模型制作
各组动物术前12小时禁食，自由饮水。用3%戊巴比妥钠(5mg/100g)腹腔注射麻醉后在无菌条件下作上腹正中纵形切口入腹，看清胰胆管走向，用4.5号钝头针于十二指肠对系膜缘穿刺肠壁，在浆膜下潜行约0.3cm后再刺入肠腔，针头逆行插入胰胆管约0.2cm。用无损伤血管钳轻轻夹闭胰胆管肝门端，向实验组大鼠胰胆管内匀速逆行推注5%牛磺胆酸钠(Sigma公司) 0.1ml/100g体重，5分钟内推完，推注完毕取除胰胆管肝门端血管钳，关腹并开始计时。实验组推注药液后胰腺逐渐变苍白、肿胀，继而浆膜下出现瘀斑瘀点。对照组仅作胰胆管逆行插管和夹闭胰胆管肝门端5分钟，不注射任何药物，其余操作同实验组。
1.3 标本收集及检测
各实验组(B1～B6组)动物分别于术后0、0.5、2、4、6及8小时处死，对照组(A组)动物于术后8小时处死。然后在无菌条件下开腹，从下腔静脉采血2ml，血凝固后4 000r/min离心10分钟，取上清液-20℃保存。TNF测定采用传代细胞株L929生物活性法。按试剂说明书，TNF活性由下式算出：
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各组大鼠处死时观察胰腺及胰周情况，并取相同部位胰腺组织用10%甲醛固定作病理学检查。
1.4 统计学处理
血清TNF活性和胰腺组织学评分结果用
±s表示，组间比较用方差分析；相关性分析采用等级相关分析。2 结果
2.1 血清TNF活性
对照组(A组)可查见低水平TNF活性。实验组中，B1组血清TNF活性比A组稍有上升，但无统计学差异(P>0.05)。B2组开始明显升高，B4组达最高峰，以后逐渐降低(表1)。
表1 各组大鼠血清TNF活性(IU/ml，
±s) 组别, 百拇医药
n
TNF活性
A组
5
17.8±3.49
B1组
5
19.8±2.68
B2组
5
25.8±3.70*
B3组
, 百拇医药
5
44.2±4.82*
B4组
5
52.0±3.87*
B5组
5
40.8±2.95*
B6组
5
35.6±3.05*
, 百拇医药
*与A组比较，P<0.05
2.2 病理学检查
处死大鼠时见B2～B6组腹腔内有不等量的血性腹水，胰腺体积增大，呈紫红至紫黑色，胰周组织也出现不同程度的水肿。B1组胰腺呈苍白色，有散在瘀斑瘀点。A组无腹水，胰腺及腹腔其余脏器肉眼未见异常改变。光镜检查发现：A组部分大鼠胰腺有很轻微的水肿，偶见少量炎细胞浸润，无出血坏死；B1～B6组均见胰腺腺泡坏死，其病理改变及炎性反应随时间的延长逐渐明显。腺泡早期(B1～B3组)的病理改变为细胞体积增大、肿胀、胞浆嗜酸性减弱或消失、胞核体积增大、聚集成团；继后(B4～B6组)则表现为细胞周界消失、核崩解呈碎片状，同时可见明显的充血、水肿、大片出血坏死及大量炎细胞浸润。胰腺病理损害按改良Grewal标准〔2〕，对水肿、血管反应、脂肪坏死、腺泡坏死和炎细胞浸润情况进行评分，结果见表2。
, 百拇医药
表2 各组大鼠胰腺组织学评分(
±s) 组别n
评分结果
A组
5
0.8±0.27
B1组
5
2.5±0.79*△
B2组
, 百拇医药
5
3.5±0.71*
B3组
5
3.3±1.10*
B4组
5
4.2±1.15*△
B5组
5
4.2±0.62*
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B6组
5
5.1±0.65*△
*与A组比较，P<0.05；△与各自上组比较，P<0.05
相关性分析发现，血清TNF活性与胰组织损害程度密切相关(r＝0.63，P<0.01)。
3 讨论
TNF是一种具有广泛生物活性的非特异性炎症介质。内源性TNF包括TNFα和TNFβ，虽然二者的主要来源不同，但却具有相似的生物学特性。脓毒症时TNF所起的不利作用已经引起人们的重视。ANP时由于胰酶入血、胰腺及胰周组织的破坏及并发感染等原因引起机体免疫系统的激活，大量炎症介质的释放，TNF是最早出现水平增高的炎症介质之一。适量的TNF对维持机体正常的免疫功能是必不可少的，而过量或持续存在的TNF则能导致白细胞的过度激活，机体产生超强的炎症反应，引起自身组织损伤〔3〕。
, 百拇医药
动物实验及临床研究均已证实急性胰腺炎时TNF增高，TNF的异常增高可能与胰腺炎时并发症的发生有关〔4，5〕，但与病情的严重程度及预后的关系尚有不同结论。本实验发现，制成大鼠ANP模型后半小时，血清TNF活性即显著上升，4小时时达最高峰。同时观察到，TNF活性高低与胰腺损害程度有显著相关性，从而说明TNF参与了ANP的病理损害过程。对照组也能测得低水平TNF活性，这可能与麻醉和手术创伤有关。
由于血循环中TNF半衰期短(5～25分钟)、血中TNF抑制物和可溶性TNF受体(sTNF-R)的干扰、胰腺炎症局部释放入血的大量水解酶的破坏以及患者入院时间的早迟、健康状况和免疫功能状态等因素均可对TNF的检测结果构成影响。加之血循环中TNFα和TNFβ以多种形式存在，而真正起作用的是其中具有生物活性那一小部分。因此，不同的检测方法也可能得出不同的实验结论。故TNF在人类ANP病理损害过程中的作用及地位尚需做更深入的研究。
参 考 文 献
, http://www.100md.com
1 Exley AR, Leese T, Holliday MP, et al. Endotoxaemia and tumor necrosis factor as prognostic markers in severe acute pancreatitis.Gut, 1992; 33(8)∶1126
2 Grewal HP, Mohey el Din A, Gaber L, et al. Amelioration of the physiologic and biochemical changes of acute pancreatitis using an anti-TNFα polyclonal antibody. Am J Surg, 1994; 167(1)∶214
3 Eichacker PQ, Hoffman WD, Farese A, et al. TNF but not IL-1 in dogs causes lethal injury and multiple organ dysfunction similar to human sepsis. J Appl Physiol, 1991; 71(5)∶1979
4 Mckay CJ, Gallayher G, Brooks B, et al. Increased monocyte cytokine production in association with systemic complication in acute pancreatitis. Br J Surg, 1996; 83(7)∶919
5 王建承，赵小团，袁祖荣等. 肿瘤坏死因子在急性胰腺炎及并发多器官衰竭中作用的研究. 中华医学杂志， 1995； 75(3)∶133
(1997-11-29收稿，1998-06-03修回), 百拇医药