32例脑干出血CT分析
作者：王海林 江新青 成秋生等
单位：
关键词：
哈尔滨医科大学学报000101 摘 要：目的 探讨T细胞的杀伤机制。方法 采用51Cr释放试验，检测了3种T细胞系(OE4、4Q11、BK1)对瘤细胞TA3的细胞毒作用。结果 CD4+T细胞系BK1，4Q11也具有特异的杀伤作用。结论 除CD8+ CTL外，还存在CD4+ CTL，其杀伤作用依赖于Fas/FasL途径。
分类号：R392.12 文献标识码：A
文章编号：1000-1905(2000)01-0001-02
Cytotoxicity comparison of 3 kinds of T cell lines
, 百拇医药
ZHANG Feng-yun FAN Yong-jun CHEN Jun-ping et al
(Department of Immunology,Harbin Medical University,Harbin 150086,China)
Abstract：Objective To investigate the cytotoxicity T of lymphocyte.Methods 3 kinds of T cell lines(OE4,4Q11,BK1) were used in specific51Cr release assay,target cell line was TA3.Results CD8+ CTL line OE4 caused highly specific lysis of target cells.4Q11 and activated BK1 were expressed directional cytotoxicity for target cell eventhough they are CD4+ T cells.Conclusion Besides CD8+ CTL,some of CD4+ T cells can specifically kill target cells through Fas/FasL pathway.
, 百拇医药
Key words：CD4+ CTL;Fas/FasL;killing▲
细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)介导的细胞毒作用在机体抗病毒、抗肿瘤中有重要意义。CD8+CTL的作用机制已基本明了，主要是通过释放穿孔素(perforin)和颗粒酶(granuloenzyme)特异地杀伤靶细胞。Tita[1]首先提出存在一种CD4+CTL，但是，作为辅助性T细胞(Th)的CD4+细胞具有杀伤功能的观点尚不能为人们所接受，而且其杀伤机制不清楚。CD4+CTL的杀伤作用不能用穿孔素和颗粒酶解释。在CD4+CTL中不能分离出引起细胞毒的颗粒[2]；靶细胞溶解不依赖钙离子的作用[3]；MHCⅡ类基因限制性的CD4+CTL的穿孔素mRNA表达为阴性[4]。曾有人推测，CD4+ T细胞的杀伤作用是TNF和IFN-γ介导的非特异性靶细胞溶解，但研究表明，CD4+ T细胞的杀伤作用和CD8+CTL类似，是有特异性的，不造成邻近细胞的非特异损伤；而且，某些被CD4+CTL杀伤的靶细胞能抵抗高浓度TNF和IFN-γ的作用[5]。最近的报道指出，CD4+CTL的细胞毒作用依赖于Fas/FasL途径[6]。为了进一步探讨CD4+CTL的杀伤机制，我们检测了3种T细胞系对靶细胞的细胞毒作用，现报告如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞系
T细胞系及肿瘤细胞均为日本北里大学医学部免疫教研室原信贤教授惠赠。BK1是来源于BALB/c小鼠的钥孔金戚血兰素(keyhole limpet hemocyanin,KLH)-特异的I-Ed限制性的CD4+T细胞系。抗原活化后的BK1表达FasL;OE4为来源于C57BL/6J小鼠的H-2d限制性的CD8+T细胞系；4Q11为来源于CD8+T细胞系QM11TCR转基因C57BL/6J小鼠的CD4+，I-AK限制性的T细胞系。靶细胞为TA3，是B细胞杂交瘤[(BALB/c x A/J)F1杂交瘤]，表型为H-2d/a，MHCⅠ类及Ⅱ类基因限制性。
, http://www.100md.com
T细胞系培养在含4%TCGF-10%FCS-DMEM中，每2周以X射线照射(2000拉德/次)的同系小鼠脾细胞(抗原递呈细胞)刺激1次，BK1需同时加KLH，瘤细胞培养在含5%FCS-DMEM中。
1.2 细胞毒活性检测
以51Cr释放试验检测T细胞系的细胞毒活性，5%FCS-DMEM中含1×107个靶细胞。加50μCi,Na251CrO4,37℃,10% CO2培养箱中孵育1h，每15min振荡1次。洗3次后，将靶细胞及T细胞加入96孔U型反应板中，每孔加100μl靶细胞(2.5×103个)及100μlT细胞。OE4，4Q11，BK1细胞与靶细胞的比例(E/T)分别为2/1,16/1,32/1。自然释放孔仅加入100μlDMEM培养液，最大释放孔加入100μl N-P40，每组设3个复孔。将反应板置37℃，10% CO2培养箱中孵育6h后，收集上清，以γ-液闪仪(Auto-gamma,COBRATM Ⅱ)检测。细胞毒活性以特异的51Cr释放活性的百分数表示，计算方法如下：释放活性(%)=(实验组释放活性-自然释放活性)/(最大释放活性-自然释放活性)×100。
, 百拇医药
2 结果
3种T细胞系细胞毒活性如附图所示。
附图 特异性51Cr释放试验结果
A OE4(CD8+，穿孔素+，Fas配体+)的细胞毒作用
B 4Q11(CD4+，Fas配体+，FasL+)的细胞毒作用
C BK1(CD4+，静止的BK1 FasL-；活化的BK1 BasL+)的细胞毒作用
, 百拇医药
3 讨论
人们公认，CD8+CTL细胞具有特异性杀伤作用，其杀伤机制主要为：①穿孔素-颗粒酶途径：CD8+CTL释放穿孔素，在酶的聚合作用及Ca2+存在的条件下，靶细胞产生多聚穿孔素(polyperforin)孔道，CTL释放含降解酶(degradative enzyme)和其它毒性物质的颗粒通过孔道进入靶细胞，引起靶细胞损伤。②Fas/FasL途径：Fas(CD95)是Ⅰ型膜蛋白，属TNF受体家族；FasL是Ⅱ型膜蛋白，属TNF家族。许多种细胞表达Fas,而只有激活的T淋巴细胞表达FasL，当FasL与Fas结合时，引起靶细胞凋亡。我们的实验结果指出，CD8+CTL细胞系OE4对靶细胞TA3表现了很强的细胞毒作用(附图A)。本实验中应用的CD4+T细胞4Q11及抗原活化的BK1也表现了对TA3的杀伤活性(附图B、C)。4Q11表达FasL，不表达穿孔素，因此，其对靶细胞的杀伤依赖于Fas/FasL途径。以前的检测证明，BK1不表达穿孔素及FasL，但活化后的BK1表达FasL，能直接特异地杀伤表达Fas分子的细胞，由于Fas和FasL的作用，导致表达Fas的细胞发生凋亡[7]。
, 百拇医药
实验证明，不仅CD8+T细胞具有特异杀伤作用，某些CD4+ T细胞也具有特异杀伤作用。但是，CD4+ T细胞在体内的特异性细胞毒作用还有待进一步证明。■
基金项目：黑龙江省自然科学基金资助项目(编号9622D)
作者简介：张凤蕴(1944-)，女，教授，硕士研究生导师
参考文献：
[1]Tite JP,Powell MB,Ruddle NH.Protein-antigen specific Ia-restricted cytolytic T cell:analysis of frequency,target cell susceptibility,and mechanism of cytolysis[J].J Immunol,1985,135:25.
, 百拇医药
[2]Berke G,Rosen D.Higher lytic in vivo primed cytolytic T lymphocytes devoid of lytic granules and BLT-esterase activity acqueired these constituents in the presence of T cell growth factors upon blast transformation in vitro[J].J Immunol,1988,141:1429.
[3]Trenn G,Takayama H,Sitkovsky MV.Exocytosis of cytolytic granules may not be required for target cell lysis by cytotoxic T lymphocytes[J].Nature,1987,330:72.
[4]Takayama H,Shinohara N,Kawasaki A,et al.Antigen-specific directional target cell lysis by perforin negative T lymphocyte clones[J].Int Immunol,1991,3(11):1149-1156.
, http://www.100md.com
[5]Ju ST,Strack P,Stromquist D,et al.Cytolytic activity of Ia restracted T cell clones and hybridomas:Evedence for a cytolytic mechanism independent of interferon-r,lymphotoxin and tumor necrosis factor-a[J].Cell Immunol,1988,117:399-413.
[6]Hanabuchi S,Koyanagi M,Kawasaki A,et al.Fas and its ligand in agenaral mechanism of T-cell -mediated cytotoxicity[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:4930-4934.
[7]Shinohara N,Yi-Ying Huang,Muroyama Akiko.Specific suppression of antibody response by soluble protein-specific,class Ⅱ-restricted cytolytic T lymphocyte clones[J].Eur J Immunol,1991,21:23-27.
收稿日期：1999-11-15, http://www.100md.com
单位：
关键词：
哈尔滨医科大学学报000101 摘 要：目的 探讨T细胞的杀伤机制。方法 采用51Cr释放试验，检测了3种T细胞系(OE4、4Q11、BK1)对瘤细胞TA3的细胞毒作用。结果 CD4+T细胞系BK1，4Q11也具有特异的杀伤作用。结论 除CD8+ CTL外，还存在CD4+ CTL，其杀伤作用依赖于Fas/FasL途径。
分类号：R392.12 文献标识码：A
文章编号：1000-1905(2000)01-0001-02
Cytotoxicity comparison of 3 kinds of T cell lines
, 百拇医药
ZHANG Feng-yun FAN Yong-jun CHEN Jun-ping et al
(Department of Immunology,Harbin Medical University,Harbin 150086,China)
Abstract：Objective To investigate the cytotoxicity T of lymphocyte.Methods 3 kinds of T cell lines(OE4,4Q11,BK1) were used in specific51Cr release assay,target cell line was TA3.Results CD8+ CTL line OE4 caused highly specific lysis of target cells.4Q11 and activated BK1 were expressed directional cytotoxicity for target cell eventhough they are CD4+ T cells.Conclusion Besides CD8+ CTL,some of CD4+ T cells can specifically kill target cells through Fas/FasL pathway.
, 百拇医药
Key words：CD4+ CTL;Fas/FasL;killing▲
细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)介导的细胞毒作用在机体抗病毒、抗肿瘤中有重要意义。CD8+CTL的作用机制已基本明了，主要是通过释放穿孔素(perforin)和颗粒酶(granuloenzyme)特异地杀伤靶细胞。Tita[1]首先提出存在一种CD4+CTL，但是，作为辅助性T细胞(Th)的CD4+细胞具有杀伤功能的观点尚不能为人们所接受，而且其杀伤机制不清楚。CD4+CTL的杀伤作用不能用穿孔素和颗粒酶解释。在CD4+CTL中不能分离出引起细胞毒的颗粒[2]；靶细胞溶解不依赖钙离子的作用[3]；MHCⅡ类基因限制性的CD4+CTL的穿孔素mRNA表达为阴性[4]。曾有人推测，CD4+ T细胞的杀伤作用是TNF和IFN-γ介导的非特异性靶细胞溶解，但研究表明，CD4+ T细胞的杀伤作用和CD8+CTL类似，是有特异性的，不造成邻近细胞的非特异损伤；而且，某些被CD4+CTL杀伤的靶细胞能抵抗高浓度TNF和IFN-γ的作用[5]。最近的报道指出，CD4+CTL的细胞毒作用依赖于Fas/FasL途径[6]。为了进一步探讨CD4+CTL的杀伤机制，我们检测了3种T细胞系对靶细胞的细胞毒作用，现报告如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞系
T细胞系及肿瘤细胞均为日本北里大学医学部免疫教研室原信贤教授惠赠。BK1是来源于BALB/c小鼠的钥孔金戚血兰素(keyhole limpet hemocyanin,KLH)-特异的I-Ed限制性的CD4+T细胞系。抗原活化后的BK1表达FasL;OE4为来源于C57BL/6J小鼠的H-2d限制性的CD8+T细胞系；4Q11为来源于CD8+T细胞系QM11TCR转基因C57BL/6J小鼠的CD4+，I-AK限制性的T细胞系。靶细胞为TA3，是B细胞杂交瘤[(BALB/c x A/J)F1杂交瘤]，表型为H-2d/a，MHCⅠ类及Ⅱ类基因限制性。
, http://www.100md.com
T细胞系培养在含4%TCGF-10%FCS-DMEM中，每2周以X射线照射(2000拉德/次)的同系小鼠脾细胞(抗原递呈细胞)刺激1次，BK1需同时加KLH，瘤细胞培养在含5%FCS-DMEM中。
1.2 细胞毒活性检测
以51Cr释放试验检测T细胞系的细胞毒活性，5%FCS-DMEM中含1×107个靶细胞。加50μCi,Na251CrO4,37℃,10% CO2培养箱中孵育1h，每15min振荡1次。洗3次后，将靶细胞及T细胞加入96孔U型反应板中，每孔加100μl靶细胞(2.5×103个)及100μlT细胞。OE4，4Q11，BK1细胞与靶细胞的比例(E/T)分别为2/1,16/1,32/1。自然释放孔仅加入100μlDMEM培养液，最大释放孔加入100μl N-P40，每组设3个复孔。将反应板置37℃，10% CO2培养箱中孵育6h后，收集上清，以γ-液闪仪(Auto-gamma,COBRATM Ⅱ)检测。细胞毒活性以特异的51Cr释放活性的百分数表示，计算方法如下：释放活性(%)=(实验组释放活性-自然释放活性)/(最大释放活性-自然释放活性)×100。
, 百拇医药
2 结果
3种T细胞系细胞毒活性如附图所示。
附图 特异性51Cr释放试验结果
A OE4(CD8+，穿孔素+，Fas配体+)的细胞毒作用
B 4Q11(CD4+，Fas配体+，FasL+)的细胞毒作用
C BK1(CD4+，静止的BK1 FasL-；活化的BK1 BasL+)的细胞毒作用
, 百拇医药
3 讨论
人们公认，CD8+CTL细胞具有特异性杀伤作用，其杀伤机制主要为：①穿孔素-颗粒酶途径：CD8+CTL释放穿孔素，在酶的聚合作用及Ca2+存在的条件下，靶细胞产生多聚穿孔素(polyperforin)孔道，CTL释放含降解酶(degradative enzyme)和其它毒性物质的颗粒通过孔道进入靶细胞，引起靶细胞损伤。②Fas/FasL途径：Fas(CD95)是Ⅰ型膜蛋白，属TNF受体家族；FasL是Ⅱ型膜蛋白，属TNF家族。许多种细胞表达Fas,而只有激活的T淋巴细胞表达FasL，当FasL与Fas结合时，引起靶细胞凋亡。我们的实验结果指出，CD8+CTL细胞系OE4对靶细胞TA3表现了很强的细胞毒作用(附图A)。本实验中应用的CD4+T细胞4Q11及抗原活化的BK1也表现了对TA3的杀伤活性(附图B、C)。4Q11表达FasL，不表达穿孔素，因此，其对靶细胞的杀伤依赖于Fas/FasL途径。以前的检测证明，BK1不表达穿孔素及FasL，但活化后的BK1表达FasL，能直接特异地杀伤表达Fas分子的细胞，由于Fas和FasL的作用，导致表达Fas的细胞发生凋亡[7]。
, 百拇医药
实验证明，不仅CD8+T细胞具有特异杀伤作用，某些CD4+ T细胞也具有特异杀伤作用。但是，CD4+ T细胞在体内的特异性细胞毒作用还有待进一步证明。■
基金项目：黑龙江省自然科学基金资助项目(编号9622D)
作者简介：张凤蕴(1944-)，女，教授，硕士研究生导师
参考文献：
[1]Tite JP,Powell MB,Ruddle NH.Protein-antigen specific Ia-restricted cytolytic T cell:analysis of frequency,target cell susceptibility,and mechanism of cytolysis[J].J Immunol,1985,135:25.
, 百拇医药
[2]Berke G,Rosen D.Higher lytic in vivo primed cytolytic T lymphocytes devoid of lytic granules and BLT-esterase activity acqueired these constituents in the presence of T cell growth factors upon blast transformation in vitro[J].J Immunol,1988,141:1429.
[3]Trenn G,Takayama H,Sitkovsky MV.Exocytosis of cytolytic granules may not be required for target cell lysis by cytotoxic T lymphocytes[J].Nature,1987,330:72.
[4]Takayama H,Shinohara N,Kawasaki A,et al.Antigen-specific directional target cell lysis by perforin negative T lymphocyte clones[J].Int Immunol,1991,3(11):1149-1156.
, http://www.100md.com
[5]Ju ST,Strack P,Stromquist D,et al.Cytolytic activity of Ia restracted T cell clones and hybridomas:Evedence for a cytolytic mechanism independent of interferon-r,lymphotoxin and tumor necrosis factor-a[J].Cell Immunol,1988,117:399-413.
[6]Hanabuchi S,Koyanagi M,Kawasaki A,et al.Fas and its ligand in agenaral mechanism of T-cell -mediated cytotoxicity[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:4930-4934.
[7]Shinohara N,Yi-Ying Huang,Muroyama Akiko.Specific suppression of antibody response by soluble protein-specific,class Ⅱ-restricted cytolytic T lymphocyte clones[J].Eur J Immunol,1991,21:23-27.
收稿日期：1999-11-15, http://www.100md.com