小鼠骨髓巨噬细胞培养液的造血抑制活性研究
作者：蒲晓允 罗成基
单位：第三军医大学预防医学系防原医学教研室
关键词：骨髓巨噬细胞；造血抑制；辐射
重庆医学990202
摘 要 观察了小鼠骨髓型正常巨噬细胞株(Ana-1)经6Gy60Co照射后细胞培养上清对CFU-E和CFU-GM形成的影响。结果未照射和照射后(1d、3d、7d、10d)Ana-l细胞培养上清对CFU-E和CFU-GM的形成均有显著的抑制活性，但照射后抑制活性更强，上清经灭活后抑制活性减弱。结论：小鼠骨髓巨噬细胞的培养上清对CFU-E和CFU-GM均有显著的抑制活性，这种抑制活性可能是抑制因子和细胞毒共同作用的结果。
Experiment Study of Hematopoietic Activity of Mouse Bone Marrow Macrophage Culture Media
, http://www.100md.com
Dept of Antiatomic Medicine,The Faculty of
Pu xiaoyun,Luo Chengji
Preventive Military,The 3rd Mififarg Medical Liniversity,Chongqing 400038
Abstract:We have studied the effect of culture media of mouse bone marrow macrophage line(Ana-1)irradiated by 6Gy 60CO on CFU-E and CFU-GM，The results suggested that not only both the nonirradiation and irradiation Ana-I cell culture media had marked inhibiting activity on CFU-E and CFU-GM，but also the suppression activity of the latter was strongger.After the media was inactivated ,the inhibiting activity dromaticly dropped.It is suggested that the Suppression activity of the media on CFU-E and CFU-GM may be the result of synergetic action of cytotoxic activity with certain inhibiting factors.
, 百拇医药
Key Word:Bone marrow Macrophage Hematopoietic suppression Irradiation Ana-1细胞株是由J2(V-raf/V-myc)重组逆转录病毒转染小鼠(C57B16/6)骨髓巨噬细胞建立的具有正常骨髓巨噬细胞功能的细胞株[1]。该细胞株与造血的关系，尤其是经放射线照射后对造血的影响，尚未见报道，为了了解骨髓巨噬细胞在造血中的作用，对Ana-1细胞进行了观察。
材料与方法
一、Ana-1细胞培养：Ana-1细胞购于中科院上海细胞所，培养体系：胎牛血清20%(中科院)、马血清10%(天津)、DMEM(Gibco)，青霉素100u/ml、链霉素100u/ml、细胞浓度2×105个细胞/ml，放入37℃5%CO2孵箱培养。
二、照射细胞：将Ana-1细胞制成2×105个细胞/ml，并悬浮于上述培养体系，放射源60CO，照射剂量6Gy，剂量率1.23Gy/min。照射后将细胞浓度调至2×105个细胞/ml。分装于25ml培养瓶，于照射后1d、3d、7d、10d收集培养上清放-20℃备用。
, http://www.100md.com
三、粒单系祖细胞(CFU-GM)培养。培养体系：马血清25%、小鼠肌浸液10%、骨髓有核细胞1×105个细胞/ml，不同浓度及时间的Ana-1细胞上清或灭活上清(55℃，30min)，甲基纤维素，充分混匀后分装于35mm培养皿，放入37℃，5%CO2孵箱中，7d天后低倍镜下计数CFU-GM集落，以大于50个细胞组成的细胞团作为一个集落。
四、红系祖细胞(CFU-E)培养：按刘秀珍方法[2]。
结 果
d一、未照射Ana-1细胞培养上清对CF-E和CFU-GM的影响
分别以10%肌浸液和重组促红细胞生成素(EPO.1u/ml)作为刺激条件(对照组)，然后加入不同浓度的Ana-1细胞上清，结果Ana-1细胞培养上清对CFU-E和CFU-GM均有显著的抑制活性，且随上清浓度的增加抑制活性增强，结果见表1。
, 百拇医药
表1 不同浓度Ana-1细胞培养上清时CFU-E和CFU-GM的抑制活性 培养液(%)
例 数
CFU-E
CFU-GM
对照组
12
30.25±5.19
212.51±25.10
1
11
31.35±6.78
19.32±26.41
, http://www.100md.com
5
12
28.45±7.42
165.54±17.16△
10
9
27.01±6.71
88.45±14.31△△
15
9
22.30±4.31
68.45±8.43△△
, http://www.100md.com
20
10
18.35±4.08
68.20±8.54△△
△P<0.05 △△P<0.05 与对照组比较
二、Ana-1细胞培养上清对CFU-E的抑制活性
以EPO(1u/ml)为刺激条件(对照组)，以不同时间(即未)照射和照射后1d、3d、7d、10d)收集的10%Ana-1细胞上清代替培养体系中的1640液，显示不同时相点上清液对CFU-E均有抑制活性，而上清自身并无刺激活性(形成的集落仅为1%左右)，不同时相点的上清抑制活性不同，以照射后第3d为最高，抑制率为47.79%，第10d抑制活性有所减弱。结果见表2。
, http://www.100md.com
三、Ana-1细胞培养上清对CFU-GM的抑制活性
以10%肌浸液作为刺激条件(对照组)显示不同时相点Ana-1细胞培养上清对CFU-GM抑制活性大致与对CFU-E的抑制活性相似，但照射后上清对CFU-GM抑制活性大致与对CFU-E的抑制活性相似，但照射后上清对CFU-GM的抑制活性更强，抑制率分别为1d 51.28%、3d 43.97%、7d 40.42%、10d 32.68%，上清经灭活后对CFU-GM的抑制活性明显减弱，但仍保持一定的抑制活性，结果见表3。表2 不同时间Ana-1细胞培养上清时CFU-E的抑制活性 对照组(EPO)
未照射组
(B)
EPO+B
照射组
, 百拇医药 照射上清+EPO
1d
3d
7d
10d
1d
3d
7d
10d
32.70
0.40
25.51△
0.30
, http://www.100md.com
0.50
1.10
1.33
19.25△
16.55△△
20.88
23.33△
±2.96
±0..7
±3.21
±0.64
±1.20
±1.37
, 百拇医药
±1.41
±4.60
±2.80
±4.81
±3.91
抑制率(%)
-
19.5
-
-
-
-
39.43
, 百拇医药
47.79
34.134
26.4
△P<0.05 △△P<0.05 与对照组比较表3 不同时间Ana-1细胞上清及灭活上清对CFU-GM的影响 对照组(CSF)
未照射组
(B)
CSF+B
照射组
照射上清+CSF
1d
3d
, 百拇医药 7d
10d
1d
3d
7d
10d
208.37
0.63
181.63△
0.53
0.50
0.75
1.53
, 百拇医药
101.50△△*
116.73△△*
124.75△△*
140.28△△
±19.06
±0.69
±15.39
±0.73
±0.71
±0.83
±1.33
±47.04
, http://www.100md.com
±38.44
±33.76
±33.45
抑制率(%)
-
12.83
-
-
-
-
51.28
43.97
40.13
, 百拇医药
32.67
☆210.42
0.34
182.34△
0
0.30
0
0.45
163.50△
162.43△
171.32△△
170.31△
±17.54
, http://www.100md.com
±0.85
±14.35
0
±0.8
0
±0.70
±13.40
±17.65
±20.01
±21.21
抑制率(%)
-
13.34
, http://www.100md.com
-
-
-
-
22.23
23.18
18.58
19.06
△P<0.05 △△P<0.05 与对照组比较 ☆：灭活上清组.P<0.05 与灭活上清比较
讨 论
造血细胞的生成需要适合的微环境，骨髓基质细胞是造血微环境的主要组成成份之一，其中骨髓巨噬细胞仅占基质细胞总数的3～6%，但由于其功能活跃，同时还表达多种与造血有关的细胞因子，因此骨髓巨噬细胞在血细胞生成中起着重要的调节作用。但是骨髓巨噬细胞在骨髓有核细胞中所占比例很小，分离难度大，分出的细胞数量有限，因此研究骨髓巨噬细胞在造血中的作用受到很大限制，以往一般是从肺或腹腔灌洗液中提取巨噬细胞，并研究其与造血的关系[3]，这些结果虽对我们推断骨髓巨噬细胞在造血中的作用有很重要的意义，但是缺乏直接的证据。Ana-1细胞株的建立为我们直接研究骨髓巨噬细胞成为可能。
, 百拇医药
本实验结果表现Ana-1细胞无论是未经照射还是被照射以后，其培养的上清对CFU-E和CFU-GM均有较显著的掏作用，而且放射后抑制活性增强，这种抑制作用一般来自于两方面的因素：即细胞毒和抑制因子的作用，前者主要由细胞释放的酶及补体对血细胞的损伤作用，经灭活后其作用消失。本实验结果提示培养下清经灭活后其抑制活性显著降低，表明培养上清对CFU-GM的抑制作用中，细胞毒作用是存在的，但即使灭活后其上清仍然表现出较强的抑制活性，以3d为例CFU-GM的抑制率仍为22.81%，表明还有其他因素参与CFU-GM形成的抑制作用。其他因素的物质基础是什么，目前尚不清楚，是否与骨髓巨噬细胞能表达多种对造血干细胞有较强的抑制作用，从而影响CFU-E和CFU-GM形成的。细胞抑制因子如TGF-β、MIP-α、TNF-α等有关[4]?我们正在做这方面的工作。
照射后Ana-1细胞上清无论是灭活前还是灭活后对CFU-GM的抑制活性均较未照射上清为强，其原因可能是细胞毒作用增强或者是细胞某些活性因子表达增强共同作用的结果。从实验结果看未照射上清对CFU-GM的抑制率为12.83%，而照射后上清的抑制率达到51.28%，上清经灭活后抑制率减小，降至20%左右，但未照射组Ana-1上清灭活前后抑制活性无 明显变化，表是有放射线所致抑制活性的增加，主要与细胞毒作用增强有关。最近陈家佩发现被放射线照射后的人血浆对CFU-E和CFU-GM也有明显抑制作用[5]，这种抑制作用是否与巨噬细胞有关有待于证实。
, 百拇医药
总之，骨髓巨噬细胞对血细胞的生成不仅有正向调节作用，也有负向调节作用，尤其是放射线损伤后负向调节作用还会显著增加，因此后者应当引起足够重视。
参考文献
1 Blasi E,Radzioch D,Durum S et al.A murine macrophage cell line inmortalized by v-raf and v-my concogene exhibits normal macrophage fumction.Eur J Immunol,1987,17:1491-1498
2 刘秀珍著.造血祖细胞培养技术实验手册.北京：北京出版社，1993：99
3 Wang CQ,Kondetthorr B.The role of macrophages in the regulation of erthroid growth in vitro.Blood,1992,80(7):1702-1709
4 Broxmeyer HE,Sherry B,Cooper S,et al.Comparative analysis of the human macrophage inflammatory protein family of cytokines on proliferation of human myloid progentor cells.J Immunol,1993,150(8):3448-3458
5 陈家佩，从玉元，马平等.吉林放射事故病人血浆造血活性观察，中华放射医学与防护杂志，1997：26-29, 百拇医药
单位：第三军医大学预防医学系防原医学教研室
关键词：骨髓巨噬细胞；造血抑制；辐射
重庆医学990202
摘 要 观察了小鼠骨髓型正常巨噬细胞株(Ana-1)经6Gy60Co照射后细胞培养上清对CFU-E和CFU-GM形成的影响。结果未照射和照射后(1d、3d、7d、10d)Ana-l细胞培养上清对CFU-E和CFU-GM的形成均有显著的抑制活性，但照射后抑制活性更强，上清经灭活后抑制活性减弱。结论：小鼠骨髓巨噬细胞的培养上清对CFU-E和CFU-GM均有显著的抑制活性，这种抑制活性可能是抑制因子和细胞毒共同作用的结果。
Experiment Study of Hematopoietic Activity of Mouse Bone Marrow Macrophage Culture Media
, http://www.100md.com
Dept of Antiatomic Medicine,The Faculty of
Pu xiaoyun,Luo Chengji
Preventive Military,The 3rd Mififarg Medical Liniversity,Chongqing 400038
Abstract:We have studied the effect of culture media of mouse bone marrow macrophage line(Ana-1)irradiated by 6Gy 60CO on CFU-E and CFU-GM，The results suggested that not only both the nonirradiation and irradiation Ana-I cell culture media had marked inhibiting activity on CFU-E and CFU-GM，but also the suppression activity of the latter was strongger.After the media was inactivated ,the inhibiting activity dromaticly dropped.It is suggested that the Suppression activity of the media on CFU-E and CFU-GM may be the result of synergetic action of cytotoxic activity with certain inhibiting factors.
, 百拇医药
Key Word:Bone marrow Macrophage Hematopoietic suppression Irradiation Ana-1细胞株是由J2(V-raf/V-myc)重组逆转录病毒转染小鼠(C57B16/6)骨髓巨噬细胞建立的具有正常骨髓巨噬细胞功能的细胞株[1]。该细胞株与造血的关系，尤其是经放射线照射后对造血的影响，尚未见报道，为了了解骨髓巨噬细胞在造血中的作用，对Ana-1细胞进行了观察。
材料与方法
一、Ana-1细胞培养：Ana-1细胞购于中科院上海细胞所，培养体系：胎牛血清20%(中科院)、马血清10%(天津)、DMEM(Gibco)，青霉素100u/ml、链霉素100u/ml、细胞浓度2×105个细胞/ml，放入37℃5%CO2孵箱培养。
二、照射细胞：将Ana-1细胞制成2×105个细胞/ml，并悬浮于上述培养体系，放射源60CO，照射剂量6Gy，剂量率1.23Gy/min。照射后将细胞浓度调至2×105个细胞/ml。分装于25ml培养瓶，于照射后1d、3d、7d、10d收集培养上清放-20℃备用。
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三、粒单系祖细胞(CFU-GM)培养。培养体系：马血清25%、小鼠肌浸液10%、骨髓有核细胞1×105个细胞/ml，不同浓度及时间的Ana-1细胞上清或灭活上清(55℃，30min)，甲基纤维素，充分混匀后分装于35mm培养皿，放入37℃，5%CO2孵箱中，7d天后低倍镜下计数CFU-GM集落，以大于50个细胞组成的细胞团作为一个集落。
四、红系祖细胞(CFU-E)培养：按刘秀珍方法[2]。
结 果
d一、未照射Ana-1细胞培养上清对CF-E和CFU-GM的影响
分别以10%肌浸液和重组促红细胞生成素(EPO.1u/ml)作为刺激条件(对照组)，然后加入不同浓度的Ana-1细胞上清，结果Ana-1细胞培养上清对CFU-E和CFU-GM均有显著的抑制活性，且随上清浓度的增加抑制活性增强，结果见表1。
, 百拇医药
表1 不同浓度Ana-1细胞培养上清时CFU-E和CFU-GM的抑制活性 培养液(%)
例 数
CFU-E
CFU-GM
对照组
12
30.25±5.19
212.51±25.10
1
11
31.35±6.78
19.32±26.41
, http://www.100md.com
5
12
28.45±7.42
165.54±17.16△
10
9
27.01±6.71
88.45±14.31△△
15
9
22.30±4.31
68.45±8.43△△
, http://www.100md.com
20
10
18.35±4.08
68.20±8.54△△
△P<0.05 △△P<0.05 与对照组比较
二、Ana-1细胞培养上清对CFU-E的抑制活性
以EPO(1u/ml)为刺激条件(对照组)，以不同时间(即未)照射和照射后1d、3d、7d、10d)收集的10%Ana-1细胞上清代替培养体系中的1640液，显示不同时相点上清液对CFU-E均有抑制活性，而上清自身并无刺激活性(形成的集落仅为1%左右)，不同时相点的上清抑制活性不同，以照射后第3d为最高，抑制率为47.79%，第10d抑制活性有所减弱。结果见表2。
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三、Ana-1细胞培养上清对CFU-GM的抑制活性
以10%肌浸液作为刺激条件(对照组)显示不同时相点Ana-1细胞培养上清对CFU-GM抑制活性大致与对CFU-E的抑制活性相似，但照射后上清对CFU-GM抑制活性大致与对CFU-E的抑制活性相似，但照射后上清对CFU-GM的抑制活性更强，抑制率分别为1d 51.28%、3d 43.97%、7d 40.42%、10d 32.68%，上清经灭活后对CFU-GM的抑制活性明显减弱，但仍保持一定的抑制活性，结果见表3。表2 不同时间Ana-1细胞培养上清时CFU-E的抑制活性 对照组(EPO)
未照射组
(B)
EPO+B
照射组
, 百拇医药 照射上清+EPO
1d
3d
7d
10d
1d
3d
7d
10d
32.70
0.40
25.51△
0.30
, http://www.100md.com
0.50
1.10
1.33
19.25△
16.55△△
20.88
23.33△
±2.96
±0..7
±3.21
±0.64
±1.20
±1.37
, 百拇医药
±1.41
±4.60
±2.80
±4.81
±3.91
抑制率(%)
-
19.5
-
-
-
-
39.43
, 百拇医药
47.79
34.134
26.4
△P<0.05 △△P<0.05 与对照组比较表3 不同时间Ana-1细胞上清及灭活上清对CFU-GM的影响 对照组(CSF)
未照射组
(B)
CSF+B
照射组
照射上清+CSF
1d
3d
, 百拇医药 7d
10d
1d
3d
7d
10d
208.37
0.63
181.63△
0.53
0.50
0.75
1.53
, 百拇医药
101.50△△*
116.73△△*
124.75△△*
140.28△△
±19.06
±0.69
±15.39
±0.73
±0.71
±0.83
±1.33
±47.04
, http://www.100md.com
±38.44
±33.76
±33.45
抑制率(%)
-
12.83
-
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-
51.28
43.97
40.13
, 百拇医药
32.67
☆210.42
0.34
182.34△
0
0.30
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0.45
163.50△
162.43△
171.32△△
170.31△
±17.54
, http://www.100md.com
±0.85
±14.35
0
±0.8
0
±0.70
±13.40
±17.65
±20.01
±21.21
抑制率(%)
-
13.34
, http://www.100md.com
-
-
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22.23
23.18
18.58
19.06
△P<0.05 △△P<0.05 与对照组比较 ☆：灭活上清组.P<0.05 与灭活上清比较
讨 论
造血细胞的生成需要适合的微环境，骨髓基质细胞是造血微环境的主要组成成份之一，其中骨髓巨噬细胞仅占基质细胞总数的3～6%，但由于其功能活跃，同时还表达多种与造血有关的细胞因子，因此骨髓巨噬细胞在血细胞生成中起着重要的调节作用。但是骨髓巨噬细胞在骨髓有核细胞中所占比例很小，分离难度大，分出的细胞数量有限，因此研究骨髓巨噬细胞在造血中的作用受到很大限制，以往一般是从肺或腹腔灌洗液中提取巨噬细胞，并研究其与造血的关系[3]，这些结果虽对我们推断骨髓巨噬细胞在造血中的作用有很重要的意义，但是缺乏直接的证据。Ana-1细胞株的建立为我们直接研究骨髓巨噬细胞成为可能。
, 百拇医药
本实验结果表现Ana-1细胞无论是未经照射还是被照射以后，其培养的上清对CFU-E和CFU-GM均有较显著的掏作用，而且放射后抑制活性增强，这种抑制作用一般来自于两方面的因素：即细胞毒和抑制因子的作用，前者主要由细胞释放的酶及补体对血细胞的损伤作用，经灭活后其作用消失。本实验结果提示培养下清经灭活后其抑制活性显著降低，表明培养上清对CFU-GM的抑制作用中，细胞毒作用是存在的，但即使灭活后其上清仍然表现出较强的抑制活性，以3d为例CFU-GM的抑制率仍为22.81%，表明还有其他因素参与CFU-GM形成的抑制作用。其他因素的物质基础是什么，目前尚不清楚，是否与骨髓巨噬细胞能表达多种对造血干细胞有较强的抑制作用，从而影响CFU-E和CFU-GM形成的。细胞抑制因子如TGF-β、MIP-α、TNF-α等有关[4]?我们正在做这方面的工作。
照射后Ana-1细胞上清无论是灭活前还是灭活后对CFU-GM的抑制活性均较未照射上清为强，其原因可能是细胞毒作用增强或者是细胞某些活性因子表达增强共同作用的结果。从实验结果看未照射上清对CFU-GM的抑制率为12.83%，而照射后上清的抑制率达到51.28%，上清经灭活后抑制率减小，降至20%左右，但未照射组Ana-1上清灭活前后抑制活性无 明显变化，表是有放射线所致抑制活性的增加，主要与细胞毒作用增强有关。最近陈家佩发现被放射线照射后的人血浆对CFU-E和CFU-GM也有明显抑制作用[5]，这种抑制作用是否与巨噬细胞有关有待于证实。
, 百拇医药
总之，骨髓巨噬细胞对血细胞的生成不仅有正向调节作用，也有负向调节作用，尤其是放射线损伤后负向调节作用还会显著增加，因此后者应当引起足够重视。
参考文献
1 Blasi E,Radzioch D,Durum S et al.A murine macrophage cell line inmortalized by v-raf and v-my concogene exhibits normal macrophage fumction.Eur J Immunol,1987,17:1491-1498
2 刘秀珍著.造血祖细胞培养技术实验手册.北京：北京出版社，1993：99
3 Wang CQ,Kondetthorr B.The role of macrophages in the regulation of erthroid growth in vitro.Blood,1992,80(7):1702-1709
4 Broxmeyer HE,Sherry B,Cooper S,et al.Comparative analysis of the human macrophage inflammatory protein family of cytokines on proliferation of human myloid progentor cells.J Immunol,1993,150(8):3448-3458
5 陈家佩，从玉元，马平等.吉林放射事故病人血浆造血活性观察，中华放射医学与防护杂志，1997：26-29, 百拇医药