RT-PCR检测HCV的应用与问题
作者：覃志坚
单位：右江民族医学院附属医院检验科(百色 533000)
关键词：
右江民族医学院学报/9902112 自1990年Weiner等[1]首次将逆转录—聚合酶链反应(Reverse transcripation polymerase chain reaction RT-PCR)用于丙肝病毒(HCV)的检测以来，该技术不断革新，日臻完善，现已广泛应用于HCV分子生物学研究、临床诊断、治疗效果的评价等诸多方面。然而，由于HCVRNA的血中浓度非常低，大约每毫升血液中有10a个拷贝数，且由于RNA酶(RNase)的降解作用，在血液标本HCVRNA往往迅速被破坏。此外HCV基因序列高度变异的特性直接影响RT-PCR HCVRNA的阳性检出率。笔者在临床检测工作中也发现，HCV的PCR检测常出现假阳性，假阴性现象，这除了以操作过程中标本处理不当，微量DNA污染或RNA被丢失外，引物设计、质量控制等原因也造成检测不稳定、重复性差的结果。现就影响RT-PCR HCVRNA检测结果的诸多因素作一简述。
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1 提取方法的影响
HCV模板RNA的产量，很大程度上取决于提取过程中是否能有效地抑制RNase、RNA的质量和纯度，取决于能否确保RNA不因抽提而断裂，降解。同时，能有效地去除蛋白、脂质DNA以及残留的有机溶剂和金属离子等。近年来已发展起来了多种核酸抽提方法，如玻粉法，二氧化硅及硅藻法，碘化钠一步法，快速亲和膜分离法以及异硫氰酸胍/酚/氯仿一步抽提法(AGPC)等[2]。这些方法都免去了传统的氯化铯超速离心过程，使核酸的抽提不再是一种耗时费力，代价昂贵的实验。
玻璃粉、二氧化硅和硅藻在高浓度的盐离子溶液中能特异性吸附核酸，在水中温育可以将核酸洗脱下来。但玻粉法只能提取约1～2Kb长度的核酸，二氧化硅提取法的核酸产量大约为50%～60%，且需时间较长，这两种方法都不能十分有效地分离DNA和RNA，不适于提取微量的HCVRNA。碘化钠一步法虽然能快速，高产量地提取完整的核酸，但同样不能有效地分离DNA和RNA。目前较多采用AGPC法，因为胍盐是最有效的核酸抑制剂之一。Castillo等[3]比较了三种不同提取RNA的方法，结果表明AGPC法最好。AGPC法是用4.2mol/L异硫氰酸胍-0.5%+二烷基肌酸钠-25mmol/L/Tris-HCl(pH8.0)550μl和200μl样品混合，经离心后，将上清液用酚/氯仿(1∶1)抽提1次，然后用100%乙醇沉淀，70%乙醇洗涤，得到RNA纯品。内源性RNase来源于血清或组织细胞，在采样或处理标本过程中，即使发生少量细胞破裂，也会导致大量的RNase释放，迅速降解RNA。RNase可以耐受多种处理而不被灭活，但却被异硫氰酸胍等高离子液序列的试剂所灭活，所以这种抽提方法备受重视。
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大部分核酸丢失发生在乙醇沉淀过程，建议在100%乙醇液中加入终浓度0.3mol/L的乙酸钠，有助于RNA的沉淀。传统的乙醇沉淀往往将样品在-20℃静置2h或更长时间，现在已知无此必要，一般15min即可。用70%乙醇再洗涤1次抽提物，可以提高RNA的纯度[4]。
2 标本处理与储存过程的影响
RT-PCR对HCV感染有独到的诊断价值。PCR检测HCVRNA的敏感性取决于标本的保存，检测的标本量以及所用的引物等因素。笔者曾把分离出的血清在室温下放置24～48h或冻融3次均不影响HCVRNA的检出(试验8例阳性标本结果一致)，但如果标本处理不当，如溶血或不分离血清存储等，极易造成HCVRNA被酶降解而丢失。还有人报道，置室温太久，或反复冻融次数太多均可损伤RNA的包膜蛋白，使RNA的含量明显降低[5]。
3 引物设计的影响
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由于HCV的高度变异的特性使许多学者认识到，在HCVRNAPCR试验中引物的设计是十分重要的。Castillo等[3]比较HCV不同区引物的检出率，结果与5′端非编码区(s′NCR)阳性率90%，C区20%，Nsα区20%，Ns3/4区60%。由于5′NCR最保守，故目前最常用源于该区的引物。但在5′uT区设计的引物，也不能排除因为HCV基因不同而出现假阴性结果的可能。Burh等[6]从全世界各地不同国家，不同民族的人群中收集到了114份Anti-HCV阳性血清和500份阴性对照血清，分别用4对不同区域的引物进行PCR扩增，结果84份HCVRNA阳性。比较4对不同区域引物的灵敏度，只有5′uT区54-301核苷酸之间的引物可以100%地检出阳性血清。由于此区和痘病毒类似，其同源性高达45%～49%，很可能反映了病毒的进化过程，Houghton等[7]曾指出，在此区设计引物一定要注意，防止未知的人类痘病毒感染所造成的鉴别诊断上的困难。有关在我国各地区传播的HCV基因型，各型之间的变异程度等方面的研究资料尚不充分。在设计引物时，尤其应当持谨慎态度，避免由于引物设计不当而使PCR试验的灵敏度下降。
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4 RT-PCR检测HCVRNA的质量控制
为了标准化HCV-RT-PCR，欧州病毒性肝炎专家小组向欧州、美国和日本的38个实验室分别送检322份相同标本，3份阳性，1份弱阳性，6份阴性和10倍稀释(102-10-7)的两个HCVRNA阳性系列标本，仅10个实验室(32%)检测正确，双份标本均检测正确的实验室仅有5个。11个实验室(35%)检测弱阳性标本结果为阴性，还有4%的实验室将强阳性标本也检测为阴性。值得一提的是阴性标本，11%的实验室检查结果为阳性[8]。另有报道[9]，正在接受干扰素治疗的患者血清标本HCVRNA可减少或者清除。以上提示目前RT-PCR检测HCVRNA的可靠性有待提高，由于污染造成的假阳性不容忽视，故对检测结果的解释一定要慎重。进行HCV检测时，应常规设计阴性、阳性和弱阳性对照以监测污染造成的假结果。
参考文献
, 百拇医药
[1] Weiner AJ, Kuo G, Bradley DW, et al. Detection of hepatitis C viral sequences in non-A. non-B hepatitis. Lancet，1990；335：1
[2] Chomczynski P, Sacchi N, Single-step method of RNA isolation by acid guauidinum thioyanate-phenol-chloroform extraction, Anal Blochem，1987；162：156
[3] Castillo I, Bartolome, Quiroga JA, et al. Comparison of several PCR procedure of detection of serum HCV-RNA using different regions of the HCV genome, J Virol Method，1992；38：71
, http://www.100md.com
[4] Cristino K, Bisceglie AMD, Hoofnagle JH, et al. Hepatitis C viral RNA in serum of patients with Chronicnon-A, non-B hepatitis: detection by the polymerase chain reaction using multiple primer sets. Hepatol，1991；14(1)：51
[5] Busch MP, Wilber JC. HCV Replication, The New England J of Medicine，1992；326(1)：64
[6] Burh J, Prurcell RH, Miller RH. Importance of primer selection for the detction of hepatitis C virus RNA with the polymerase chain reaction assay Ploc Natl Aead Sci USA，1992；89：187
, http://www.100md.com
[7] Houghton M, Weiner A, Hau J, et al. Molecular biology of the hepatitis C Viruses, implications for diagnosis, development and coutrol of Viral diease. Hepatology，1991；14：381
[8] Zaaijer HL, Cuypers HT, Reesink HW, et al. Reliability of polymerase chain reaction for detection of hepatitis C virus. Lancet，1993；341：722
[9] 雷周云，逯好英，韩凤连，等.丙型肝炎患者血清抗丙型肝炎病毒抗IgM HCVRNA检测结果的比较.中华实验和临床病学杂志，1997；11(2)：121
(1998-04-01收稿), http://www.100md.com
单位：右江民族医学院附属医院检验科(百色 533000)
关键词：
右江民族医学院学报/9902112 自1990年Weiner等[1]首次将逆转录—聚合酶链反应(Reverse transcripation polymerase chain reaction RT-PCR)用于丙肝病毒(HCV)的检测以来，该技术不断革新，日臻完善，现已广泛应用于HCV分子生物学研究、临床诊断、治疗效果的评价等诸多方面。然而，由于HCVRNA的血中浓度非常低，大约每毫升血液中有10a个拷贝数，且由于RNA酶(RNase)的降解作用，在血液标本HCVRNA往往迅速被破坏。此外HCV基因序列高度变异的特性直接影响RT-PCR HCVRNA的阳性检出率。笔者在临床检测工作中也发现，HCV的PCR检测常出现假阳性，假阴性现象，这除了以操作过程中标本处理不当，微量DNA污染或RNA被丢失外，引物设计、质量控制等原因也造成检测不稳定、重复性差的结果。现就影响RT-PCR HCVRNA检测结果的诸多因素作一简述。
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1 提取方法的影响
HCV模板RNA的产量，很大程度上取决于提取过程中是否能有效地抑制RNase、RNA的质量和纯度，取决于能否确保RNA不因抽提而断裂，降解。同时，能有效地去除蛋白、脂质DNA以及残留的有机溶剂和金属离子等。近年来已发展起来了多种核酸抽提方法，如玻粉法，二氧化硅及硅藻法，碘化钠一步法，快速亲和膜分离法以及异硫氰酸胍/酚/氯仿一步抽提法(AGPC)等[2]。这些方法都免去了传统的氯化铯超速离心过程，使核酸的抽提不再是一种耗时费力，代价昂贵的实验。
玻璃粉、二氧化硅和硅藻在高浓度的盐离子溶液中能特异性吸附核酸，在水中温育可以将核酸洗脱下来。但玻粉法只能提取约1～2Kb长度的核酸，二氧化硅提取法的核酸产量大约为50%～60%，且需时间较长，这两种方法都不能十分有效地分离DNA和RNA，不适于提取微量的HCVRNA。碘化钠一步法虽然能快速，高产量地提取完整的核酸，但同样不能有效地分离DNA和RNA。目前较多采用AGPC法，因为胍盐是最有效的核酸抑制剂之一。Castillo等[3]比较了三种不同提取RNA的方法，结果表明AGPC法最好。AGPC法是用4.2mol/L异硫氰酸胍-0.5%+二烷基肌酸钠-25mmol/L/Tris-HCl(pH8.0)550μl和200μl样品混合，经离心后，将上清液用酚/氯仿(1∶1)抽提1次，然后用100%乙醇沉淀，70%乙醇洗涤，得到RNA纯品。内源性RNase来源于血清或组织细胞，在采样或处理标本过程中，即使发生少量细胞破裂，也会导致大量的RNase释放，迅速降解RNA。RNase可以耐受多种处理而不被灭活，但却被异硫氰酸胍等高离子液序列的试剂所灭活，所以这种抽提方法备受重视。
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大部分核酸丢失发生在乙醇沉淀过程，建议在100%乙醇液中加入终浓度0.3mol/L的乙酸钠，有助于RNA的沉淀。传统的乙醇沉淀往往将样品在-20℃静置2h或更长时间，现在已知无此必要，一般15min即可。用70%乙醇再洗涤1次抽提物，可以提高RNA的纯度[4]。
2 标本处理与储存过程的影响
RT-PCR对HCV感染有独到的诊断价值。PCR检测HCVRNA的敏感性取决于标本的保存，检测的标本量以及所用的引物等因素。笔者曾把分离出的血清在室温下放置24～48h或冻融3次均不影响HCVRNA的检出(试验8例阳性标本结果一致)，但如果标本处理不当，如溶血或不分离血清存储等，极易造成HCVRNA被酶降解而丢失。还有人报道，置室温太久，或反复冻融次数太多均可损伤RNA的包膜蛋白，使RNA的含量明显降低[5]。
3 引物设计的影响
, http://www.100md.com
由于HCV的高度变异的特性使许多学者认识到，在HCVRNAPCR试验中引物的设计是十分重要的。Castillo等[3]比较HCV不同区引物的检出率，结果与5′端非编码区(s′NCR)阳性率90%，C区20%，Nsα区20%，Ns3/4区60%。由于5′NCR最保守，故目前最常用源于该区的引物。但在5′uT区设计的引物，也不能排除因为HCV基因不同而出现假阴性结果的可能。Burh等[6]从全世界各地不同国家，不同民族的人群中收集到了114份Anti-HCV阳性血清和500份阴性对照血清，分别用4对不同区域的引物进行PCR扩增，结果84份HCVRNA阳性。比较4对不同区域引物的灵敏度，只有5′uT区54-301核苷酸之间的引物可以100%地检出阳性血清。由于此区和痘病毒类似，其同源性高达45%～49%，很可能反映了病毒的进化过程，Houghton等[7]曾指出，在此区设计引物一定要注意，防止未知的人类痘病毒感染所造成的鉴别诊断上的困难。有关在我国各地区传播的HCV基因型，各型之间的变异程度等方面的研究资料尚不充分。在设计引物时，尤其应当持谨慎态度，避免由于引物设计不当而使PCR试验的灵敏度下降。
, 百拇医药
4 RT-PCR检测HCVRNA的质量控制
为了标准化HCV-RT-PCR，欧州病毒性肝炎专家小组向欧州、美国和日本的38个实验室分别送检322份相同标本，3份阳性，1份弱阳性，6份阴性和10倍稀释(102-10-7)的两个HCVRNA阳性系列标本，仅10个实验室(32%)检测正确，双份标本均检测正确的实验室仅有5个。11个实验室(35%)检测弱阳性标本结果为阴性，还有4%的实验室将强阳性标本也检测为阴性。值得一提的是阴性标本，11%的实验室检查结果为阳性[8]。另有报道[9]，正在接受干扰素治疗的患者血清标本HCVRNA可减少或者清除。以上提示目前RT-PCR检测HCVRNA的可靠性有待提高，由于污染造成的假阳性不容忽视，故对检测结果的解释一定要慎重。进行HCV检测时，应常规设计阴性、阳性和弱阳性对照以监测污染造成的假结果。
参考文献
, 百拇医药
[1] Weiner AJ, Kuo G, Bradley DW, et al. Detection of hepatitis C viral sequences in non-A. non-B hepatitis. Lancet，1990；335：1
[2] Chomczynski P, Sacchi N, Single-step method of RNA isolation by acid guauidinum thioyanate-phenol-chloroform extraction, Anal Blochem，1987；162：156
[3] Castillo I, Bartolome, Quiroga JA, et al. Comparison of several PCR procedure of detection of serum HCV-RNA using different regions of the HCV genome, J Virol Method，1992；38：71
, http://www.100md.com
[4] Cristino K, Bisceglie AMD, Hoofnagle JH, et al. Hepatitis C viral RNA in serum of patients with Chronicnon-A, non-B hepatitis: detection by the polymerase chain reaction using multiple primer sets. Hepatol，1991；14(1)：51
[5] Busch MP, Wilber JC. HCV Replication, The New England J of Medicine，1992；326(1)：64
[6] Burh J, Prurcell RH, Miller RH. Importance of primer selection for the detction of hepatitis C virus RNA with the polymerase chain reaction assay Ploc Natl Aead Sci USA，1992；89：187
, http://www.100md.com
[7] Houghton M, Weiner A, Hau J, et al. Molecular biology of the hepatitis C Viruses, implications for diagnosis, development and coutrol of Viral diease. Hepatology，1991；14：381
[8] Zaaijer HL, Cuypers HT, Reesink HW, et al. Reliability of polymerase chain reaction for detection of hepatitis C virus. Lancet，1993；341：722
[9] 雷周云，逯好英，韩凤连，等.丙型肝炎患者血清抗丙型肝炎病毒抗IgM HCVRNA检测结果的比较.中华实验和临床病学杂志，1997；11(2)：121
(1998-04-01收稿), http://www.100md.com