聚合酶链反应在梅毒诊断中的应用
作者：李建民
单位：广西南宁市第二人民医院(南宁 530031)
关键词：
右江民族医学院学报/9902109 近年来，梅毒在国内的发病人数日益增多。然而梅毒的各种血清学试验因敏感度和特异性尚不能达到早期和准确的要求，给临床诊断带来一定的困难。我们应用聚合酶链反应(PCR)技术快速检测梅毒螺旋体，得到满意结果，现报告如下：
1 材料和方法
1.1 对象 42例可疑梅毒患者血清和分泌物标本均来自我院皮肤科性病专科门诊。其中男38例，女4例，年龄20～62岁，病期7天～3个月。硬下疳31例，扁平湿疣3例，梅毒性斑丘疹8例。
1.2 试剂 Taq酶、dNTP购自伊利康生物技术有限公司。梅毒螺旋体抗体血凝试验(TPHA)试剂盒由日本富士株式会社生产，快速血浆反应素测定(RPR)试剂由兰州生物制品研究所生产。
, 百拇医药
1.3 方法 引物设计选择梅毒螺旋体39KD基底膜蛋白基因序列，扩增片断为535bp。
P1、5'-CAGGTAACGGATGCTGAAGT-3'
P2、5'-CGTGGAAGTAACCGAGTCT-3'
模板制备取皮肤溃疡分泌物悬于1ml生理盐水中，取200μl加入0.5ml管中，10000r/min离心
10min，去上清液，于管中加裂解液50μl，煮涨10min，10000r/min离心5min，上清液可作扩增模板。PCR扩增与产物检测：取反应液20μl、模板5μl、Taq酶IU/μl，经94℃30s、55℃30s、72℃60s，共35个循环，最后于72℃延伸5min。取扩增产物15μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，紫外灯下观察结果[1]。
, 百拇医药
2 结果
2.1 42例分别抽血做RPR、TPHA检查，取皮肤溃疡分泌物做PCR检查，阳性率分别为71.4%
(30/42)，85.7%(36/42)，90.4%(38/42)。
2.2 31例硬下疳患者，其中有1例RPR(+)、TPHA(-)，4例RPR(-)、TPHA(+)，4例RPR(-)、TPHA
(-)。但这9例患者PCR(+)。11例Ⅱ期梅毒患者RPR(+)、TPHA(+)。
3 讨论
传统的梅毒诊断方法是暗视野视显微镜直接找螺旋体，阳性率低。而血清学试验(VDRL、USR、RPR、TPHA)虽然广泛应用于梅毒诊断，但此类方法特异性和敏感性不够强，也不能鉴别性病和非性病性螺旋体病[2]。而且对潜伏期长的Ⅰ期梅毒阳性率不高、特异性不强。检查梅素螺旋体最敏感可靠的方法是家兔感染试验，但其手续繁琐，不切合实际[3]，PCR检测是一种运用体外扩增特定的基因片段和限制性内切酶，以识别双链DNA中特异性核苷酸序列和切割DNA的特性
, http://www.100md.com
[4]，因此可做为诊断梅毒的一个有效手段。早期梅素硬下疳渗出物含有大量梅毒螺旋体，有利于PCR检测。本试验结果显示：PCR检测方法敏感度和特异性均优于血清学试验，且操作较易、快速，故特别适合于梅毒的早期诊断。但当患者下疳愈合或无扁平湿疣、湿丘疹和其他粘膜损害等表现，则血清学试验仍应是主要的检测方法。
参考文献
[1] 张信江，主编.皮肤病性病实验诊断学.贵阳：贵州科技出版社，1995：89
[2] 龚匡隆.梅毒的实验诊断技术.国外医学(皮肤性病学分册)，1994；20(1)：33
[3] 刘海燕，苏明权.实用PCR检验技术.郑州：河南科技出版社，1996：68
[4] 汪仲铭.非淋菌性尿道(宫颈)炎沙眼衣原体PCR检测.中国皮肤性病学杂志，1997；11(5)：282
[5] 黎志刚.聚合酶链反应检测生殖器疱疹患者单纯疱疹病毒.中国皮肤性病学杂志，1997；11(4)：210
(1998-04-01收稿), http://www.100md.com
单位：广西南宁市第二人民医院(南宁 530031)
关键词：
右江民族医学院学报/9902109 近年来，梅毒在国内的发病人数日益增多。然而梅毒的各种血清学试验因敏感度和特异性尚不能达到早期和准确的要求，给临床诊断带来一定的困难。我们应用聚合酶链反应(PCR)技术快速检测梅毒螺旋体，得到满意结果，现报告如下：
1 材料和方法
1.1 对象 42例可疑梅毒患者血清和分泌物标本均来自我院皮肤科性病专科门诊。其中男38例，女4例，年龄20～62岁，病期7天～3个月。硬下疳31例，扁平湿疣3例，梅毒性斑丘疹8例。
1.2 试剂 Taq酶、dNTP购自伊利康生物技术有限公司。梅毒螺旋体抗体血凝试验(TPHA)试剂盒由日本富士株式会社生产，快速血浆反应素测定(RPR)试剂由兰州生物制品研究所生产。
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1.3 方法 引物设计选择梅毒螺旋体39KD基底膜蛋白基因序列，扩增片断为535bp。
P1、5'-CAGGTAACGGATGCTGAAGT-3'
P2、5'-CGTGGAAGTAACCGAGTCT-3'
模板制备取皮肤溃疡分泌物悬于1ml生理盐水中，取200μl加入0.5ml管中，10000r/min离心
10min，去上清液，于管中加裂解液50μl，煮涨10min，10000r/min离心5min，上清液可作扩增模板。PCR扩增与产物检测：取反应液20μl、模板5μl、Taq酶IU/μl，经94℃30s、55℃30s、72℃60s，共35个循环，最后于72℃延伸5min。取扩增产物15μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，紫外灯下观察结果[1]。
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2 结果
2.1 42例分别抽血做RPR、TPHA检查，取皮肤溃疡分泌物做PCR检查，阳性率分别为71.4%
(30/42)，85.7%(36/42)，90.4%(38/42)。
2.2 31例硬下疳患者，其中有1例RPR(+)、TPHA(-)，4例RPR(-)、TPHA(+)，4例RPR(-)、TPHA
(-)。但这9例患者PCR(+)。11例Ⅱ期梅毒患者RPR(+)、TPHA(+)。
3 讨论
传统的梅毒诊断方法是暗视野视显微镜直接找螺旋体，阳性率低。而血清学试验(VDRL、USR、RPR、TPHA)虽然广泛应用于梅毒诊断，但此类方法特异性和敏感性不够强，也不能鉴别性病和非性病性螺旋体病[2]。而且对潜伏期长的Ⅰ期梅毒阳性率不高、特异性不强。检查梅素螺旋体最敏感可靠的方法是家兔感染试验，但其手续繁琐，不切合实际[3]，PCR检测是一种运用体外扩增特定的基因片段和限制性内切酶，以识别双链DNA中特异性核苷酸序列和切割DNA的特性
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[4]，因此可做为诊断梅毒的一个有效手段。早期梅素硬下疳渗出物含有大量梅毒螺旋体，有利于PCR检测。本试验结果显示：PCR检测方法敏感度和特异性均优于血清学试验，且操作较易、快速，故特别适合于梅毒的早期诊断。但当患者下疳愈合或无扁平湿疣、湿丘疹和其他粘膜损害等表现，则血清学试验仍应是主要的检测方法。
参考文献
[1] 张信江，主编.皮肤病性病实验诊断学.贵阳：贵州科技出版社，1995：89
[2] 龚匡隆.梅毒的实验诊断技术.国外医学(皮肤性病学分册)，1994；20(1)：33
[3] 刘海燕，苏明权.实用PCR检验技术.郑州：河南科技出版社，1996：68
[4] 汪仲铭.非淋菌性尿道(宫颈)炎沙眼衣原体PCR检测.中国皮肤性病学杂志，1997；11(5)：282
[5] 黎志刚.聚合酶链反应检测生殖器疱疹患者单纯疱疹病毒.中国皮肤性病学杂志，1997；11(4)：210
(1998-04-01收稿), http://www.100md.com