生物传感器在环境监测中的应用
作者：蔡豪斌
单位：广西桂林医学院生物工程研究所 广西桂林市 541004
关键词：
华夏医学990287
传感器是能感受规定的待测量并按一定规律转换成可测信号(如电、光、声等)的器件或装置。传统的传感器有物理传感器和化学传感器，分别能感知力、热、光、磁等物理量及离子、分子等化学量的变化。生物传感器最初由化学传感器衍生而来，现已发展成为传感器的一个重要类别，引起了全世界范围的关注[1]。在欧洲，生物传感器的研究及商品化计划列入了著名的“尤里卡”计划中；在我国，国家科委公布的本世纪末下世纪初要重点跟踪的高新技术项目中，生物传感器技术榜上有名；1992年4月美国国家环境保护署(EPA)发出公告[2]，向全世界征集用于人体内外环境中有害物质监测的生物传感技术。EPA认为只有生物传感器技术才能对人体内外环境中有害物质实施现场、实时而又价廉的监测。
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1 生物传感器的基本工作原理
图1是生物传感器的基本结构示意图。生物识别元件对待测样品中特定底物的响应与信号转换元件的物理的或化学的变化相耦联，最终转换出随样品中待测底物浓度不同而变化的电信号供电子仪器检测，这就是生物传感器的基本工作原理[3]。在这里，生物识别元件是生物传感器的关键，其可以是酶、微生物和组织活细胞、细胞器、抗原或抗体以及某些化学受体等等。信号转换元件选择能与生物识别元件的响应相耦联的化学或物理传感器，如电化学电极(包括氧电极、过氧化氢电极、二氧化碳电极、氨电极、pH电极及各种离子敏感电极、氧化还原电极和原电池电极等等)、离子敏场效应晶体管(ENFET)，光敏晶体管，光寻址电位传感器(LAPs)，石英晶体(SAW)，表面等离子体(SPR)等等。
图1 生物传感器基本结构示意图
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2 监测生物化学需氧量(BOD)的生物传感器
实现对污水中生物化学需氧量(Biochemical Oxygen Demand, BOD)的快速、自动化测试，是生物传感器技术应用于环境监测的一个成功范例。传统的BOD测定法，需要在20℃条件下恒温培养5d，操作繁琐，费时、耗电，无法及时获得污水中BOD的动态。配备BOD生物传感器的BOD测定仪，可在30min内测出水中的BOD值，测得值与BOD205法保持高度的一致，且测量重现性CV≤8%，大大优于美国公共卫生协会规定的CV≤18%的标准。
图2是Karube等人发表的第一支BOD生物传感器结构示意图[4]，这是一支使用微生物活细胞为敏感元件的电化学生物传感器，信号转换元件为一支极谱型溶氧电极，固定在醋酸纤维滤膜上的好气菌系从活性污泥中分离培养而获得，仍然具有同化污水中有机物的能力。当溶液中不含有机物时，溶液中的溶解氧穿过醋酸纤维滤膜向溶氧电极扩散，达平衡时，
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图2 BOD生物传感器结构示意图
溶氧电极输出一个稳定的电流I0，此时加入污水样，其中含有的有机物为固定在滤膜上的好气菌同化，因而伴随有溶解氧的消耗，使原有的平衡状态被打破，溶氧电极的输出电流下降，一定时间(一般在30min)内，溶氧的消耗与扩散将达到一个新的平衡，溶氧电极输出一个新的电流Ii：
Ii - I0 = ΔI
ΔI与污水中有机物的含量在一定范围内呈正比例关系，使用已知BOD值的标准溶液(1:1谷氨酸/葡萄糖混合液)作一标准曲线，即可从测得的ΔI值换算出BOD值。
Riedel等人报道了一种新颖的BOD生物传感器[5]，其仍然是一支以溶氧电极为信号转换元件的电化学生物传感器，所不同的是采用了动力学的测量技术：在记录了传感器输出电流的I0值后，对加入污水样后生物传感器输出电流随时间的变化量(输出电流对时间的微分值Ip)予以记录。结果表明：电流改变的加速度正相关于污水中的化学耗氧量(Chemical Oxygen Demand , COD)，此值在水样加入后1min内即可测得；继续测量直至溶氧电极的输出至稳态(约30min)电流Ii，ΔI = Ii - I0
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则又可由ΔI换算出污水中的BOD值。可见，使用本生物传感器系统可以在30min内一次加样测出污水中的COD及BOD值，这对水体污染的监测具有极其重要的意义。
为使BOD生物传感器进入实用化，Li YR等人设计了流通型BOD生物传感器[6]，使BOD的测量实现了自动进样，并使传感头的贮藏寿命达到一年。Yang Z等人研制了一种微型BOD固态电极[7]，将酵母菌用光交联树脂固化在尺寸仅为15mm×2mm×0.4mm的微型溶氧电极上，由于采用微加工技术制备配对的双电极来实现差分测量以消除背景干扰，该BOD测量系统实现了前所未有的高检测灵敏度(检测下限达0.2mg/L)。
使用BOD生物传感器的BOD自动测定仪在国外已有商品面市，如日本日新电机株式会社于80年代末推出的BOD自动测定仪，日本还率先制订了BOD生物传感器及其测定仪的国家标准。我国哈尔滨医科大学许春向教授领导的生物传感器研究室与沈阳分析仪器厂合作研制了SXI-I型BOD自动测定仪[8]，仪器采用微机全过程控制，自动控温、自动进样、自动测量和微机数据处理，并可打印出动态变化曲线及测量结果，是检测水质质量令人满意的仪器。
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3 检测诱变剂的生物传感器
饮用水、药品、食品及化妆品中是否含有诱变剂，是公众普遍关注的问题，也是公共卫生学家对饮水、药品、食品及化妆品等进行安全性评价的重要指标。Ames设计的“哺乳动物肝微粒体/鼠伤寒沙门氏菌回复突变实验”，即著名的“Ames试验”， 作为检测化学物致突变性的初筛试验，既可以检出“半诱变剂”，也可检出“完全诱变剂”，还能区分导致碱基置换和碱基移码两种突变的诱变剂[9]，实验所需的时间也还不算长，因而已经为世界上越来越多的遗传毒理实验室、政府机构和国际组织所采纳[10]。基于Ames试验的原理，出现了用于诱变剂检测的生物传感器。
图3是karube等人[11]报道的一种用于诱变剂检测的生物传感器系统示意图。它是以两支电化学微生物传感器为核心构成的差分测量装置，基础电极均为溶氧电极，Rec+电极的敏感膜上固定的是枯草芽孢杆菌修复功能健全型菌株，Rec-电极的敏感膜上固定的是枯草芽孢杆菌修复功能缺陷型菌株。开始检测时，传感头置于不含诱变剂的缓冲液中一定时间并通过差分放大器的电子调节使差分输出电流为零，然后加入待测样，若其中不含诱变剂，两支电极始终输出一致的电流，差分输出电流仍为零；若待测样中含有诱变剂，其作用于枯草芽孢杆菌的DNA使之变异，在Rec-电极上，由于修复功能缺陷，DNA损伤使细菌逐渐死亡，相应地，其输出电流逐渐上升。在Rec+电极上，由于修复功能健全，DNA的损伤得到修复，细菌仍有正常的呼吸代谢故其输出电流基本不变，经差分输出一个电流值Ii，此Ii值的大小正相关于待测样中所含诱变剂的浓度及其诱变强度；若待测样中含有呼吸抑制剂、抗菌素和杀菌剂时，两支电极敏感膜上的枯草芽孢杆菌均被抑制或杀灭，两支电极的输出电流均增加，差分输出的电流近乎于零。完成一次测定的时间仅需1h左右。操作简便无须培养，可区分诱变剂与呼吸抑制剂、抗菌素和杀菌剂，是这一诱变剂检测生物传感器系统的主要优点。
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图3 诱变剂检测生物传感器系统
Vollmer 等人[12]将大肠杆菌的DNA损伤重组启动子recA、uvcA和alkA与弧菌的发光基因(LuxCDABF)操纵子相融合构建的质粒引入大肠杆菌中，将此菌与光敏探头组成测光型生物传感器，可以实时地定量检测化学诱变剂，并测得融合了recA启动子的菌株有最大响应。Ptitsyn 等人[13]使用融合了recA 启动子的大肠杆菌组装的测光型生物传感器检测了6种已知的化学诱变剂和两种物理诱变因子，同时与其它诱变剂检测方法(包括Ames实验)作对比，获得了极好的一致。
上面介绍的诱变剂检测生物传感器系统由于使用的敏感菌株不同于Ames试验所使用的鼠伤寒沙门氏菌，其结果不为大多数的遗传毒理学家所接受。为此，许春向等人[14]设计了与传统Ames试验结果有高度一致性的诱变剂检测生物传感器系统：直接用Ames试验所使用的鼠伤寒沙门氏菌TA98菌株(检测碱基移码突变)及TA100菌株(检测碱基置换突变)来制备电化学微生物传感器，因而其试验结果能为多数的遗传毒理学家所接受。该系统在检测诱变剂时仍需要培养，但培养时间已缩短为10h。
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4 快速测定细菌总数的生物传感器
在环境监测、卫生检验及污水处理工程中，常常需要对样品中细菌总数进行现场、实时的检测。为此，Nishikawa等人报道了能快速检测污水中细菌总数的菌数传感器[15]，其结构如图4所示。这是一支燃料电池型电极，定量的污水样经微孔滤膜过滤，细菌被阻留在膜上制成细菌阻留膜，将此细菌阻留膜紧密附着在菌数传感器的铂阳极上，插入待测溶液中即构成原电池。细菌呼吸代谢同化底物而在原电池的阳极释放电子，从而输出一个电流值Ii，此Ii值在一定范围内正比于细菌阻留膜上的细菌数。由于细菌在阳极直接释放电子的能力很弱，检测灵敏度很差，检测下限高达5×107cells/mL。为提高菌数传感器的检测灵敏度，引入了电子媒介放大体系(见图5)，获得了满意的检测灵敏度。Nishikawa使用该系统对工业废水及生活污水中的细菌总数进行了检测，检测下限达5×104cells/mL，测得结果与平板接种培养48h后的菌落计数值保持高度吻合，而传感器法测试一个样品仅需5～20min，基本达到了现场实时的检测。许春向、蔡豪斌等人研制了能快速检测污水及其他待测样中细菌总数的检测仪，仪器自带高精度的恒温水槽(±0.01℃)，使用单片机采集和处理数据，可打印细菌的呼吸代谢曲线及定量测定结果，样品无须滤在膜上而是直接加样测定，每一个样品的测定时间为2～10min。
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图4 菌数传感器结构示意图
图5 菌数传感器电子媒介放大系统
5 检测其它毒物的生物传感器
5.1 检测有机农药的生物传感器
有机农药在环境尤其是在饮水、食物中的残留已成为严重的公害，对其实施廉价、快速、有效的检测是环境监测学家一直致力要解决的问题。早在70年代，即有利用离子选择性电极间接检测有机农药的报道[16]，这些方法还不能称之为“生物传感技术”，因为它仅仅是检测有机农药中离解出来的氯离子(有机氯农药)、氟离子(有机氟农药)和磷酸根离子(有机磷农药)，结构上只有电化学电极而无生物敏感元件，待测样品也需要较为复杂的预处理步骤以使无机离子离解出来。Tran-Mihn 利用有机磷农药能抑制乙酰胆碱酯酶水解乙酰胆碱反应这一特性，设计了对有机磷农药敏感的酶(生物传感器)电极[17]，其原理如下：
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传感器的制备是将乙酰胆碱酯酶固定在pH电极上构成酶电极，将此酶电极插入含一定量乙酰胆碱的溶液中，乙酰胆碱酯酶催化分解乙酰胆碱生成乙酸，溶液pH值下降，达稳态时的pH值记录为pH0，此时加入待侧样，若其中含有有机磷农药，将抑制乙酰胆碱酯酶的活性，乙酸生成量减少，原有平衡被打破，溶液pH值上升达到一个新的平衡，记录此时的pH值为pHi，则：
pHi - pH0 = ΔpH
此ΔpH与待测样中有机磷农药含量在10-10M～10-5M间呈线性相关关系。
上面介绍的酶电极响应时间和电极恢复时间都嫌慢，Bernabei 等人设计了一支电流型有机磷农药生物传感器[18]，其原理如下所示：
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这是一支双酶电极，在透气膜上固定了乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶两种酶，酶膜与溶氧电极结合构成酶生物传感器。测量时，先将传感器浸入含一定量乙酰胆碱的缓冲液中测得一个稳态的基础电流值I0，然后加入待测样，若其中不含有机磷农药，两个反应原有的平衡不变，测得电流值仍维持在I0左右；若其中含一定量的有机磷农药，则对乙酰胆碱酯酶的活性产生抑制，胆碱生成量降低，氧消耗量下降，测得电流值上升达新稳态时的电流Ii：
ΔI=Ii-I0
此ΔI值在一定范围内与样品中有机磷农药含量成正比关系。作者用此传感器系统对水体中有机磷农药污染进行实测并与气相色谱等传统方法对照，获得极好的一致。
5.2 检测水中酚的生物传感器
酚是水系“五毒”之一，对其实施实时有效的监测对环境卫生学家和环境保护部门均具重要意义。测定酚的生物传感器有酶电极、微生物电极和植物组织电极，它们实际上都基于以下的反应：
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这两步反应均需耗大量的氧，据此可将酪氨酸酶或富含酪氨酸酶的新鲜蘑菇、土豆、香蕉等植物组织切片与溶氧电极结合制成测酚的生物传感器。Wang等人报道了一种测酚的固态酶电极[19]，系将酪氨酸氧化酶与石墨粉和环氧树脂一道制成工作电极，该电极对酚敏感，可通过简单的搽洗而使电极活性更新，响应时间仅为25s。用此酶敏电极组装的流动注射分析系统，每小时可测50个样品，检测下限为10-6M，测量的变异系数仅为1.4%(n=40)。
为提高传感器对酚检测的灵敏度，Eremennko使用一支经葡萄糖脱氢酶修饰的玻碳电极[20]，将多酚氧化酶催化酚为邻二醌的反应与葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖为葡萄糖醛的反应耦合起来以起到电流放大作用，使检测灵敏度大大提高，检测下限达2×10-10M。
下面介绍的系统是目前报道最灵敏的测酚型生物传感器[21]，系将酪氨酸酶催化苯酚生成邻苯二醌的反应与固定在聚四乙烯基吡啶上的氧化还原电对Fe(CN)3-6/Fe(CN)4-6相耦合以起到电流放大作用，其原理如下：
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传感器制备是将酪氨酸酶、固定了Fe(CN)3-6/Fe(CN)4-6的聚四乙烯基吡啶与石墨粉混合制成碳糊电极为工作电极，以微型银/氯化银电极为参比电极，共同组装在以聚四氟乙烯材料制成的薄层电池中(见图6)。测量采用连续流动注射分析的方式，用伏安仪记录工作电极氧化电流的变化。本系统实际测量地面水中酚浓度的检测下限达1.4×10-13M，线性0～2.5×10-6M，相关系数r=0.991，测量重现性CV≤1%，测量性能相当优异。
图6 测定水体酚的酶-碳糊薄层电极流动注射分析系统
参考文献
1 铃木周一主编.霍纪文译.生物传感器.北京：科学出版社, 1988.2
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2 EPA.Biosensors & Bioelectronics,1992,(4):1
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5 Riedel K, Renneberg R, Kuhn M. et al..A fast estimation of biochemical oxygen demand using microbial sensors. Appl.Microbial.Biotechnol., 1988,(28):316～318
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7 Yang Z, Suzuki H, Sasaki S, et al..Disposable sensor for bioche-
mical demand. Appl Microbiol Biotechnol 1996,46(1):10～14
8 杜晓燕，王德才，陈文华，等.BOD微生物传感器和BOD快速测定仪的研制.传感器技术，1998，17(4)：27～32
9 徐厚恩，张铣主编.卫生毒理学基础.北京：中医古籍出版社，1989.75～76
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10 宋广舜主编.环境医学.天津：天津科技出版社，1987.280
11 Karube I, Sode K, Susuki M, et al.Microbial sensor for preliminary screening of mutagens utilizing a phage induction test. Appl.Chem., 1989 Nov 1,61(21):2388～2391
12 Vollmer AC, Belkin S, Smuski DR, et al.Detection of DNA damage by use of Escherichia coli carrying recA::lux,uvrA::lux, or alkA::lux reporter plasmids. Appl.Environ.Microbiol., 1997 Jul,63(7):2566～2571
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13 Ptisyn LR, Horneck G, Komova O, et al. A biosensor for environmental genotoxin screening based on an SOS lux assay in recombinant Escherichia coli cells. Appl.Environ.Microbiol, 1997 Nov,63(11):4377～4384
14 许春向，王正平.Ames生物传感器的研制.中国公共卫生学报，1988,7(4):244
15 Nishikawa S, Sakai S, Karube I, et al. Dye-coupled electrode system for the rapid determination of cell populations in polluted water. Appl.Environ.Microbial., 1982 Apr,43(4):814～818
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16 Baum G, Ward FB. Ion-selective electrode procedure for organophosphate pesticide analysis, Anal.Chem., 1971 Jul,43(7):947～948
17 Tran-Mihn C, Pandey PC, Kumaran S. Studies on acetylcholine sensor and its analytical application based on the inhibition of cholinesterase. Biosens Bioelectron 1990,5(6):461～471
18 Bernabei M, Chiavarini S, Cremisini C, et al.. Anticholi-
nesterase activity measurement by a choline biosensor: application in water analysis. Biosens Bioelectron. 1993,8(5):265～271
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19 Wang J, Fang L, Lopez D. Amperometric biosensor for phenols based on a tyrosinase-graphite-epoxy biocomposite, Analyst, 1994,119(3):455～458
20 Eremenko A, Makower A, Jin W, et al.. Biosensor based on an enzyme Modified electrode for highly-sensitive measureement of polyphenols, Biosens Bioelectron, 1995 Fall,10(8):717～722
21 张克荣，鲁长豪，许春向.痕量分析在卫生检验中的应用.北京：人民卫生出版社，1992.102～103
收稿 1998-10-10, 百拇医药
单位：广西桂林医学院生物工程研究所 广西桂林市 541004
关键词：
华夏医学990287
传感器是能感受规定的待测量并按一定规律转换成可测信号(如电、光、声等)的器件或装置。传统的传感器有物理传感器和化学传感器，分别能感知力、热、光、磁等物理量及离子、分子等化学量的变化。生物传感器最初由化学传感器衍生而来，现已发展成为传感器的一个重要类别，引起了全世界范围的关注[1]。在欧洲，生物传感器的研究及商品化计划列入了著名的“尤里卡”计划中；在我国，国家科委公布的本世纪末下世纪初要重点跟踪的高新技术项目中，生物传感器技术榜上有名；1992年4月美国国家环境保护署(EPA)发出公告[2]，向全世界征集用于人体内外环境中有害物质监测的生物传感技术。EPA认为只有生物传感器技术才能对人体内外环境中有害物质实施现场、实时而又价廉的监测。
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1 生物传感器的基本工作原理
图1是生物传感器的基本结构示意图。生物识别元件对待测样品中特定底物的响应与信号转换元件的物理的或化学的变化相耦联，最终转换出随样品中待测底物浓度不同而变化的电信号供电子仪器检测，这就是生物传感器的基本工作原理[3]。在这里，生物识别元件是生物传感器的关键，其可以是酶、微生物和组织活细胞、细胞器、抗原或抗体以及某些化学受体等等。信号转换元件选择能与生物识别元件的响应相耦联的化学或物理传感器，如电化学电极(包括氧电极、过氧化氢电极、二氧化碳电极、氨电极、pH电极及各种离子敏感电极、氧化还原电极和原电池电极等等)、离子敏场效应晶体管(ENFET)，光敏晶体管，光寻址电位传感器(LAPs)，石英晶体(SAW)，表面等离子体(SPR)等等。
图1 生物传感器基本结构示意图
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2 监测生物化学需氧量(BOD)的生物传感器
实现对污水中生物化学需氧量(Biochemical Oxygen Demand, BOD)的快速、自动化测试，是生物传感器技术应用于环境监测的一个成功范例。传统的BOD测定法，需要在20℃条件下恒温培养5d，操作繁琐，费时、耗电，无法及时获得污水中BOD的动态。配备BOD生物传感器的BOD测定仪，可在30min内测出水中的BOD值，测得值与BOD205法保持高度的一致，且测量重现性CV≤8%，大大优于美国公共卫生协会规定的CV≤18%的标准。
图2是Karube等人发表的第一支BOD生物传感器结构示意图[4]，这是一支使用微生物活细胞为敏感元件的电化学生物传感器，信号转换元件为一支极谱型溶氧电极，固定在醋酸纤维滤膜上的好气菌系从活性污泥中分离培养而获得，仍然具有同化污水中有机物的能力。当溶液中不含有机物时，溶液中的溶解氧穿过醋酸纤维滤膜向溶氧电极扩散，达平衡时，
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图2 BOD生物传感器结构示意图
溶氧电极输出一个稳定的电流I0，此时加入污水样，其中含有的有机物为固定在滤膜上的好气菌同化，因而伴随有溶解氧的消耗，使原有的平衡状态被打破，溶氧电极的输出电流下降，一定时间(一般在30min)内，溶氧的消耗与扩散将达到一个新的平衡，溶氧电极输出一个新的电流Ii：
Ii - I0 = ΔI
ΔI与污水中有机物的含量在一定范围内呈正比例关系，使用已知BOD值的标准溶液(1:1谷氨酸/葡萄糖混合液)作一标准曲线，即可从测得的ΔI值换算出BOD值。
Riedel等人报道了一种新颖的BOD生物传感器[5]，其仍然是一支以溶氧电极为信号转换元件的电化学生物传感器，所不同的是采用了动力学的测量技术：在记录了传感器输出电流的I0值后，对加入污水样后生物传感器输出电流随时间的变化量(输出电流对时间的微分值Ip)予以记录。结果表明：电流改变的加速度正相关于污水中的化学耗氧量(Chemical Oxygen Demand , COD)，此值在水样加入后1min内即可测得；继续测量直至溶氧电极的输出至稳态(约30min)电流Ii，ΔI = Ii - I0
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则又可由ΔI换算出污水中的BOD值。可见，使用本生物传感器系统可以在30min内一次加样测出污水中的COD及BOD值，这对水体污染的监测具有极其重要的意义。
为使BOD生物传感器进入实用化，Li YR等人设计了流通型BOD生物传感器[6]，使BOD的测量实现了自动进样，并使传感头的贮藏寿命达到一年。Yang Z等人研制了一种微型BOD固态电极[7]，将酵母菌用光交联树脂固化在尺寸仅为15mm×2mm×0.4mm的微型溶氧电极上，由于采用微加工技术制备配对的双电极来实现差分测量以消除背景干扰，该BOD测量系统实现了前所未有的高检测灵敏度(检测下限达0.2mg/L)。
使用BOD生物传感器的BOD自动测定仪在国外已有商品面市，如日本日新电机株式会社于80年代末推出的BOD自动测定仪，日本还率先制订了BOD生物传感器及其测定仪的国家标准。我国哈尔滨医科大学许春向教授领导的生物传感器研究室与沈阳分析仪器厂合作研制了SXI-I型BOD自动测定仪[8]，仪器采用微机全过程控制，自动控温、自动进样、自动测量和微机数据处理，并可打印出动态变化曲线及测量结果，是检测水质质量令人满意的仪器。
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3 检测诱变剂的生物传感器
饮用水、药品、食品及化妆品中是否含有诱变剂，是公众普遍关注的问题，也是公共卫生学家对饮水、药品、食品及化妆品等进行安全性评价的重要指标。Ames设计的“哺乳动物肝微粒体/鼠伤寒沙门氏菌回复突变实验”，即著名的“Ames试验”， 作为检测化学物致突变性的初筛试验，既可以检出“半诱变剂”，也可检出“完全诱变剂”，还能区分导致碱基置换和碱基移码两种突变的诱变剂[9]，实验所需的时间也还不算长，因而已经为世界上越来越多的遗传毒理实验室、政府机构和国际组织所采纳[10]。基于Ames试验的原理，出现了用于诱变剂检测的生物传感器。
图3是karube等人[11]报道的一种用于诱变剂检测的生物传感器系统示意图。它是以两支电化学微生物传感器为核心构成的差分测量装置，基础电极均为溶氧电极，Rec+电极的敏感膜上固定的是枯草芽孢杆菌修复功能健全型菌株，Rec-电极的敏感膜上固定的是枯草芽孢杆菌修复功能缺陷型菌株。开始检测时，传感头置于不含诱变剂的缓冲液中一定时间并通过差分放大器的电子调节使差分输出电流为零，然后加入待测样，若其中不含诱变剂，两支电极始终输出一致的电流，差分输出电流仍为零；若待测样中含有诱变剂，其作用于枯草芽孢杆菌的DNA使之变异，在Rec-电极上，由于修复功能缺陷，DNA损伤使细菌逐渐死亡，相应地，其输出电流逐渐上升。在Rec+电极上，由于修复功能健全，DNA的损伤得到修复，细菌仍有正常的呼吸代谢故其输出电流基本不变，经差分输出一个电流值Ii，此Ii值的大小正相关于待测样中所含诱变剂的浓度及其诱变强度；若待测样中含有呼吸抑制剂、抗菌素和杀菌剂时，两支电极敏感膜上的枯草芽孢杆菌均被抑制或杀灭，两支电极的输出电流均增加，差分输出的电流近乎于零。完成一次测定的时间仅需1h左右。操作简便无须培养，可区分诱变剂与呼吸抑制剂、抗菌素和杀菌剂，是这一诱变剂检测生物传感器系统的主要优点。
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图3 诱变剂检测生物传感器系统
Vollmer 等人[12]将大肠杆菌的DNA损伤重组启动子recA、uvcA和alkA与弧菌的发光基因(LuxCDABF)操纵子相融合构建的质粒引入大肠杆菌中，将此菌与光敏探头组成测光型生物传感器，可以实时地定量检测化学诱变剂，并测得融合了recA启动子的菌株有最大响应。Ptitsyn 等人[13]使用融合了recA 启动子的大肠杆菌组装的测光型生物传感器检测了6种已知的化学诱变剂和两种物理诱变因子，同时与其它诱变剂检测方法(包括Ames实验)作对比，获得了极好的一致。
上面介绍的诱变剂检测生物传感器系统由于使用的敏感菌株不同于Ames试验所使用的鼠伤寒沙门氏菌，其结果不为大多数的遗传毒理学家所接受。为此，许春向等人[14]设计了与传统Ames试验结果有高度一致性的诱变剂检测生物传感器系统：直接用Ames试验所使用的鼠伤寒沙门氏菌TA98菌株(检测碱基移码突变)及TA100菌株(检测碱基置换突变)来制备电化学微生物传感器，因而其试验结果能为多数的遗传毒理学家所接受。该系统在检测诱变剂时仍需要培养，但培养时间已缩短为10h。
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4 快速测定细菌总数的生物传感器
在环境监测、卫生检验及污水处理工程中，常常需要对样品中细菌总数进行现场、实时的检测。为此，Nishikawa等人报道了能快速检测污水中细菌总数的菌数传感器[15]，其结构如图4所示。这是一支燃料电池型电极，定量的污水样经微孔滤膜过滤，细菌被阻留在膜上制成细菌阻留膜，将此细菌阻留膜紧密附着在菌数传感器的铂阳极上，插入待测溶液中即构成原电池。细菌呼吸代谢同化底物而在原电池的阳极释放电子，从而输出一个电流值Ii，此Ii值在一定范围内正比于细菌阻留膜上的细菌数。由于细菌在阳极直接释放电子的能力很弱，检测灵敏度很差，检测下限高达5×107cells/mL。为提高菌数传感器的检测灵敏度，引入了电子媒介放大体系(见图5)，获得了满意的检测灵敏度。Nishikawa使用该系统对工业废水及生活污水中的细菌总数进行了检测，检测下限达5×104cells/mL，测得结果与平板接种培养48h后的菌落计数值保持高度吻合，而传感器法测试一个样品仅需5～20min，基本达到了现场实时的检测。许春向、蔡豪斌等人研制了能快速检测污水及其他待测样中细菌总数的检测仪，仪器自带高精度的恒温水槽(±0.01℃)，使用单片机采集和处理数据，可打印细菌的呼吸代谢曲线及定量测定结果，样品无须滤在膜上而是直接加样测定，每一个样品的测定时间为2～10min。
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图4 菌数传感器结构示意图
图5 菌数传感器电子媒介放大系统
5 检测其它毒物的生物传感器
5.1 检测有机农药的生物传感器
有机农药在环境尤其是在饮水、食物中的残留已成为严重的公害，对其实施廉价、快速、有效的检测是环境监测学家一直致力要解决的问题。早在70年代，即有利用离子选择性电极间接检测有机农药的报道[16]，这些方法还不能称之为“生物传感技术”，因为它仅仅是检测有机农药中离解出来的氯离子(有机氯农药)、氟离子(有机氟农药)和磷酸根离子(有机磷农药)，结构上只有电化学电极而无生物敏感元件，待测样品也需要较为复杂的预处理步骤以使无机离子离解出来。Tran-Mihn 利用有机磷农药能抑制乙酰胆碱酯酶水解乙酰胆碱反应这一特性，设计了对有机磷农药敏感的酶(生物传感器)电极[17]，其原理如下：
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传感器的制备是将乙酰胆碱酯酶固定在pH电极上构成酶电极，将此酶电极插入含一定量乙酰胆碱的溶液中，乙酰胆碱酯酶催化分解乙酰胆碱生成乙酸，溶液pH值下降，达稳态时的pH值记录为pH0，此时加入待侧样，若其中含有有机磷农药，将抑制乙酰胆碱酯酶的活性，乙酸生成量减少，原有平衡被打破，溶液pH值上升达到一个新的平衡，记录此时的pH值为pHi，则：
pHi - pH0 = ΔpH
此ΔpH与待测样中有机磷农药含量在10-10M～10-5M间呈线性相关关系。
上面介绍的酶电极响应时间和电极恢复时间都嫌慢，Bernabei 等人设计了一支电流型有机磷农药生物传感器[18]，其原理如下所示：
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这是一支双酶电极，在透气膜上固定了乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶两种酶，酶膜与溶氧电极结合构成酶生物传感器。测量时，先将传感器浸入含一定量乙酰胆碱的缓冲液中测得一个稳态的基础电流值I0，然后加入待测样，若其中不含有机磷农药，两个反应原有的平衡不变，测得电流值仍维持在I0左右；若其中含一定量的有机磷农药，则对乙酰胆碱酯酶的活性产生抑制，胆碱生成量降低，氧消耗量下降，测得电流值上升达新稳态时的电流Ii：
ΔI=Ii-I0
此ΔI值在一定范围内与样品中有机磷农药含量成正比关系。作者用此传感器系统对水体中有机磷农药污染进行实测并与气相色谱等传统方法对照，获得极好的一致。
5.2 检测水中酚的生物传感器
酚是水系“五毒”之一，对其实施实时有效的监测对环境卫生学家和环境保护部门均具重要意义。测定酚的生物传感器有酶电极、微生物电极和植物组织电极，它们实际上都基于以下的反应：
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这两步反应均需耗大量的氧，据此可将酪氨酸酶或富含酪氨酸酶的新鲜蘑菇、土豆、香蕉等植物组织切片与溶氧电极结合制成测酚的生物传感器。Wang等人报道了一种测酚的固态酶电极[19]，系将酪氨酸氧化酶与石墨粉和环氧树脂一道制成工作电极，该电极对酚敏感，可通过简单的搽洗而使电极活性更新，响应时间仅为25s。用此酶敏电极组装的流动注射分析系统，每小时可测50个样品，检测下限为10-6M，测量的变异系数仅为1.4%(n=40)。
为提高传感器对酚检测的灵敏度，Eremennko使用一支经葡萄糖脱氢酶修饰的玻碳电极[20]，将多酚氧化酶催化酚为邻二醌的反应与葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖为葡萄糖醛的反应耦合起来以起到电流放大作用，使检测灵敏度大大提高，检测下限达2×10-10M。
下面介绍的系统是目前报道最灵敏的测酚型生物传感器[21]，系将酪氨酸酶催化苯酚生成邻苯二醌的反应与固定在聚四乙烯基吡啶上的氧化还原电对Fe(CN)3-6/Fe(CN)4-6相耦合以起到电流放大作用，其原理如下：
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传感器制备是将酪氨酸酶、固定了Fe(CN)3-6/Fe(CN)4-6的聚四乙烯基吡啶与石墨粉混合制成碳糊电极为工作电极，以微型银/氯化银电极为参比电极，共同组装在以聚四氟乙烯材料制成的薄层电池中(见图6)。测量采用连续流动注射分析的方式，用伏安仪记录工作电极氧化电流的变化。本系统实际测量地面水中酚浓度的检测下限达1.4×10-13M，线性0～2.5×10-6M，相关系数r=0.991，测量重现性CV≤1%，测量性能相当优异。
图6 测定水体酚的酶-碳糊薄层电极流动注射分析系统
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收稿 1998-10-10, 百拇医药