美国妇女BRCA1与乳腺癌发病率的研究
作者：柳满然
单位：
关键词：
美国医学会杂志中文版990203 Frequency of Breast Cancer Attributable to BRCA1
in a Population-Based Series of American Women
研究背景——过去有关BRCA1突变率的研究主要针对乳腺癌高危人群，因此其结果不能反映美国普通人群乳腺癌患者的实际情况。
目的——在一个以人群为基础的白人和黑人乳腺癌患者样本中，确定已知与乳腺癌发病相关的BRCA1突变及其他BRCA1变化的发生率，并了解其种族、诊断年龄和家族史状态差异。这些患者未经家族史选择。
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研究设计——病例-对照研究。
材料来源——卡罗来纳州东部和中部的24个县。
对象——患者为1993年5月至1996年6月确诊患I期浸润型乳腺癌的20～74岁的妇女，对照者为年龄、种族匹配的正常人。第一批研究对象不分种族，患者211例，对照者188例；第二批研究对象包括非裔患者99例，对照者108例。
主要观察指标——分析患者BRCA1基因编码序列、拼接区、5'端非翻译区、3'端非翻译区位点的胚系突变。对照者做类似分析。采用多重Single-stand conformation分析进行筛选，所有潜在变异均行基因组测序分析予以证实。
结果——211例乳腺癌患者中，3例检出与乳腺癌相关的BRCA1突变，且都是肽链截短形式的突变。经抽样校正后，3.3%(95%的可信区间，0%～7.2%)的白人患者检出乳腺癌相关突变，黑人患者为0%。在本研究群体，诊断年龄小并不能预示BRCA1突变携带状态。在白人妇女中，具卵巢癌家族史的患者BRCA1遗传性突变率为23%，家族中(有无卵巢癌不限)至少有4例乳腺癌亲属的患者，突变率为13%；有乳腺癌和卵巢癌家族史且至少有4例受累亲属的患者，突变率为33%。由于这些结果来自少数高危家族，因此其可信区间较大。另有5例患者检出罕见的错义突变或单个氨基酸缺失，其生物学意义还不清楚。黑人妇女中，3’端非翻译区变异在患者组较常见，与对照者比较具有统计学差异。
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结论——研究表明，在普通的美国人群进行广泛的BRCA1筛查是不现实的。相反，在有乳腺癌和卵巢癌或至少有4例乳腺癌患者(不论年龄)的家族，由于BRCA1突变率高，应考虑进行基因型分析。BRCA1群体遗传涉及家族史、发病年龄、遗传祖先等方面的复杂作用，在分析筛查结果时应考虑这些情况。
BRCA1和BRCA2遗传检测的商业可行性是一个尚待讨论的难题。在目前的研究背景下，许多专家和咨询小组提议对乳腺癌易感人群进行筛查。但面对医疗和医药市场，临床常因许多实际困难而放弃这种检查。了解普通人群中白人和黑人患者遗传性BRCA1的实际突变率(不考虑诊断年龄和家族史)有助于我们对美国普通妇女人群是否应进行检查作出选择。
有关乳腺癌遗传基因易感性的信息大多来自高危家系的研究结果，如有BRCA1存在的基本证据、基因定位及克隆。在进行基因分析时，家系大小、受累亲属例数、受累者存活状态、受累者与患者的亲缘关系等家系资料对分析均有重大影响。由于上述原因，早期研究在家系选择时要求几代人中应有多例乳腺癌患者，后来，才开始对确诊年龄较小的患者家系进行研究。目前，由于有关普通人群BRCA1突变率的资料有限，对遗传性BRCA1突变肿瘤易感个体的检查还相当困难。人类BRCA1基因已报道了100多种明显的变异类型。这些与乳腺癌相关的变异几乎都是导致形成肽链截短蛋白的移码突变或无义突变。
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本研究的目的是，通过对无乳腺癌家族史且不考虑诊断年龄的白人和黑人的研究，对遗传性BRCA1突变在临床和公共健康方面的潜在意义进行评价。本文涉及的有关问题是：在普通人群，白人和黑人乳腺癌患者携带已知与该病有关的BRCA1突变的比例是多少？携带率在诊断年龄、种族或家族史方面的差异如何？这些资料对遗传检查有何意义？
方法
研究群体
卡罗来纳乳腺癌研究(CBCS)是一个以人群为基础的病例-对照者研究。该研究对卡罗来纳东部和中部24个县市年龄在20～74岁的乳腺癌患者进行了分析。运用一种快速诊断方法，对26个医院确诊的原发性浸润性乳腺癌患者进行了鉴定。对照组妇女年龄及种族与患者组匹配。对照组选自北卡罗来纳机动车管理局列出的年龄小于65岁的妇女以及美国健康保护基金管理局注册的年龄65～74岁的妇女。由护士进行随访并抽取血样。为获得家系特征，要求先证者列出所有一级亲属，报告所有肿瘤病史(不管部位如何)和诊断年龄。与先证者亲缘关系较远的亲属只询问乳腺癌和卵巢癌的发病情况。
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第一阶段的随访于1993年5月至1996年12月进行，收集了890例患者和841例对照者。为提高亚组统计的把握度，用随机抽样校正法增加年轻人和黑人的采样。患者和对照者对采样的总响应率分别为77%和68%，获得血样者占参加本研究个体的95%。本报道主要采用第一阶段不考虑种族的211例患者和188例对照者以及第二阶段具有非洲血统的99例患者和108例对照者的分析结果。由于全基因BRCA1检测技术费用过高，我们仅对部分患者和对照者进行了分析。本研究获得了北卡罗来纳大学医学院和华盛顿大学审查委员会的批准。另外，还得到了美国卫生和人类服务机构的许可。
突变分析
提取外周血淋巴细胞DNA，用下文描述的多重SSCP法(single-strand conformation analysis)筛查211例患者BRCA1编码序列、剪接连接区及邻近内含子区5'端非翻译区(UTR)和3'端非翻译区的胚系突变。另外，每一患者的部分DNA与特异性寡核苷酸探针杂交，以检测欧洲人群中常见的8种突变。为进一步核实检测的灵敏性，用蛋白截短检测法筛查了第11外显子。所有潜在的罕见突变均经基因组直接测序加以核实，测序模板使用SSCP中相应的DNA带和原来提取的DNA样品。为了将在患者见到的不知临床意义的罕见突变和多态频率与对照者加以比较，使用同样方法对188例对照者进行基因型分析。由于DNA量的限制，某些分析对照者的数量有所差别。
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多重SSCP分析
应用PCR方法，使用47对引物扩增基因组DNA的BRCA1。大多数引物是以前设计的。新设计的引物用于扩增少数区域，并按有关注释(Friedman 等)作了规定。外显子5，3’端引物：5’-ATG GTT TTA TAG GAA CGC TAT G-3’；外显子6，3’端引物：5’-GGT CTT ATC ACC ACG TCA TAG-3’；外显子8，3’端引物：5’-TTT GGC AAA ACT ATA AGA TAA GG-3’；外显子9，3’端引物：5’-TGC ACA TAC ATC CCT GAA CC-3’；外显子10，3’端引物：5’-AGG TCC CAA ATG GTC TTC AG-3’；外显子16A，5’端引物：5’-AAC AGA GAC CAG AAC TTT GTA ATT C-3’，3’端引物：5’-TGC ATT ATA CCC AGC AGT ATC AG-3’；外显子16B，5’端引物：5’-CCA TCT TCA ACC TCT GCA TTG-3’，3’端引物：5’-ACT CTT TCC AGA ATG TTG TTA AGT C-3’；外显子20，5’端引物：5’-GCC TTA AAT ATG ACG TGT CTG CTC-3’，3’端引物：5’-TGG AAT ACA GAG TGG TGG GGT G-3’；外显子24，5’端引物：5’-AGT CGA TTG ATT AGA GCC TAG-3’。PCR扩增条件及SSCP分析按文献描述的方法进行。
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多重SSCP分析可在凝胶的同一泳道同时分析多个外显子或外显子11的多个区域。根据PCR产物片段大小和形式，47对引物的PCR产物可在14个泳道中同时电泳。每一泳道中，对应于不同扩增产物的DNA带型很容易辨别。若发现某一带型发生改变，对该片段进行PCR再扩增，在5’端和3’端链方向进行双向DNA直接测序。另外，从凝胶中切下异常带型，悬浮于蒸溜水中再进行测序。多重SSCP分析检出了本报道中的所有变异。
特异性寡核苷酸杂交
合成特异性寡核苷酸引物以检测BRCA1的8种突变。对185del-AG，4184delTCAA，4446C→T和5382insC进行基因型分析使用的引物和条件见文献报道。对另四种突变， 鉴别正常片段和突变片段的引物如下：外显子5：300T→G正常片段，5’-CCT TCA CAG TGT CCT TTA-3’；突变片段：5’-CCT TCA CAG GGT CCT TTA -3’；外显子5：331(+1)G→A，正常片段：5’AAC CAA AAG GTA TAT AAT-3’，突变片段：5’-AAC CAA AAG ATA TAT AAT-3’；外显子6：332(-11)T→G正常片段：5’-CTC AAA CAA TTT AAT TTC-3’，突变片段：5’-CTC AAA CAA GTT AAT TTC-3’；外显子11：2457C→T正常片段：5’-ATG GCA CTC AGG AAA GTA-3’，突变片段：5’-ATG GCA CTT AGG AAA GTA-3’。
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分别在96孔规格的杂交板上对样品及阳性和阴性对照进行点杂交，进行突变检测分析。所有阳性结果均通过对PCR产物和部分原提取的DNA样品进行直接测序加以证实。还专门用特异性寡核苷酸杂交法对观察到的3种蛋白截短突变进行验证。
白截短检测
使用文献描述的方法和引物，对BRCA1第11外显子的三个片段进行扩增和翻译表达，经蛋白截短检测未发现新的突变。
DNA测序
用原来的PCR/SSCP引物作为测序引物，用自动和/或手工测序法对每个突变外显子或片段的PCR再扩增产物进行DNA双链直接测序分析。自动测序应用标记染色双脱氧末端法，在DNA测序仪上进行(ABI Prism 377，Foster City，Calif：Applied Biosystems of Perkin Elmer)。手工测序根据PCR产物测序试剂盒操作指南进行(Cleveland，Ohio：United States Biochemical)
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单倍型分析
据BRCA1基因型侧翼标记设计引物和条件，对与BRCA1突变相关的乳腺癌患者进行单倍型分析，并将这些标记处的患者基因型与具有同样突变的高危家系患者的单倍型进行比较，以了解突变来源是否一致。
统计分析
采用SAS和SUDAAN软件，计算有关比例和95%可信区间(CIs)。根据种族和年龄组成的已知比例，分别对患者和对照者进行抽样分析；合并各统计分析的权值，得到反映研究群体突变率的评估参数。运用PROC GENMOD软件通过逻辑回归分析估算优势比(ORs)和CIs，该软件包含一些弥补项，可对抽样造成的人种和年龄偏差进行校正，以便对结果进行正确判断。
结果
患者组和对照组种族、年龄分布相似。与对照者相比，患者组乳腺癌或卵巢癌一级亲属、血缘较远的亲属及受累亲属人数较多。4例女性(2例患者，2例对照者)报告有男性乳腺癌亲属。
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对211例患者进行了基因型分析，3例携带BRCA1肽链截短突变。3例患者均为白人，乳腺癌发病年龄分别为45、52和53岁。2例患者(NC1和NC2)发现内含子5的一个拼接区突变，332(-11)T→G。NC1家系中有一个姐姐41岁患乳腺癌。NC2家系中有一个侄女患卵巢癌。内含子5的这一突变，破坏了一个拼接接受位点，导致mRNA剪接错误，内含子5有59个核苷酸插入mRNA中。使得翻译终止于突变BRCA1序列的81位密码子。这种剪接突变曾见于较早报道的高危家系成员(家系82)，以及具西欧血统的另4个高危家系。NC1、NC2基因型和家系82中侧翼BRCA1标志显示这些家系具有相同祖先来源的染色体区17q21，突变可能有共同起因。尽管NC1和NC2不存在密切关系，但都来自北卡罗来纳同一个县，家系82亦来自该州。
BRCA1第11外显子单个核苷酸2457 C→T，是一种无义突变，引起翻译停止于780位密码子。这一突变见于NC3家系，该家系中母亲患乳腺癌，一个姐姐年轻时诊断患双侧乳腺癌，另一个姐姐患乳腺癌和卵巢癌，一个哥哥患膀胱癌。这一突变曾见于祖籍是荷兰的一个家系中，该家系三代共7例乳腺癌患者(家系7)。后来又在3个荷兰家系、1个德国家系、4个美国家系中发现。NC13基因型和家系7中BRCA1侧翼标志表明变异的根本原因为微卫星D17S1322处有一新突变。
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5例患者发现了3个错义突变和1个3bp的缺失突变。变异对发病风险的影响还不清楚。1个黑人家系(NC6)发现的11外显子1200位密码子的组氨酸(His)→谷氨酸(Glu)替代，2例白人患者(NC7、NC8)的第20外显子发生的甘氨酸(Gly) → 精氨酸(Arg)，还未见任何报道。CBCS来源的148例对照者中也观察到外显子20变异。这些病例(NC6至NC8)与乳腺癌或卵巢癌都没关系。1例黑人患者(NC5)和1例黑人对照者379位密码子发生蛋氨酸(Met)→异亮氨酸(Ile)替代，该突变各地都有报道。NC5家系患者报告一个姑妈患有乳腺癌，父亲和哥哥患前列腺癌。一白人患者(NC4)外显子11中缺失3个碱基对导致天冬氨酸(Asp)的缺失，她还报告一位姑妈患卵巢癌。这种缺失还见于英裔乳腺癌患者(R.A.Eeles，通讯联系，1997年12月)。
北卡罗来纳研究区内，与遗传性乳腺癌相关的BRCA1突变，白人患者为3.3%，黑人患者0%。全部乳腺癌患者BRCA1的总变异率为2.6%。所有结果均经抽样误差校正。白人女性中, 任意亲属患乳腺癌或卵巢癌的患者，遗传性BRCA1变异的发生率为6.6%, 任意亲属患卵巢癌的患者，遗传性BRCA1变异的发生率为22.8%。高危家系遗传性突变率高，与预想的一致。在白人女性中，来自乳腺癌或卵巢癌高危家系的患者13.4%，来自乳腺癌和卵巢癌高危家系的患者33%有BRCA1突变。50岁前确诊为乳腺癌的患者与50岁后确诊为乳腺癌的患者相比，相关遗传性BRCA1突变率并无明显增加。携带相关变异的妇女受诊时加权平均年龄为51.5岁，有其他罕见错义突变或编码框缺失突变的妇女加权平均年龄为55.8岁，其他乳腺癌患者加权平均年龄为55.7岁。
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在患者组观察到内含子8、16、18、22和编码核苷酸710、1186、2430、2731、3232、3238、3667、4158、4801和4956位发生变异。这些变异都属于多态现象，以PM值来鉴别。有5种变异(包括内含子8、16，外显子11的2430、3232、3667位核苷酸)由于共处于一种连锁不平衡状态，可作为一个单元遗传给下一代。黑人妇女中检出了4种新的变异(见于外显子11、12、16、内含子12)，这些变异是同义突变(无氨基酸的改变)或发生于非翻译区。在一个黑人妇女的外显子3上, 还检测到第5种变异，该变异以前曾有过报道。外显子11，3537位A→G是错义突变，在黑人患者和对照者中发生频率低。
3’端非翻译区36位核苷酸发生C→G替代，黑人患者比黑人对照者更常见：86例患者中有18例，74例对照者中有5例具基因型CG或GG。这些较罕见的G位点亦见于1例白人、1例美国土著患者以及1例白人对照者。本研究的黑人女性，乳腺癌和等位碱基G的年龄校正OR值是3.5(95%CI，1.2～10.0)。为了单独检测两者的关系，我们还对参与CBCS自称为黑人的99例患者和108例对照者进行了基因型分析，乳腺癌和等位碱基G年龄校正OR值为1.7(95%的CI，0.5～6.3)。综合两次结果，年龄校正OR值为2.8(95%CI，1.3～6.2)。黑人妇女中具罕见等位碱基G的个体，加权平均受诊年龄为54.5岁，而具等位碱基C的纯合个体，加权平均受诊年龄为52.5岁。3’端UTR位点与内含子22的一种变异处于部分连锁不平衡状态。内含子22变异与乳腺癌的关系不具统计学显著性。
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评论
在北卡罗来纳的白人妇女，与乳腺癌相关的BRCA1突变的携带率是3.3%。黑人妇女未检出已知与乳腺癌相关的BRCA1突变，但在高危黑人家系中，以往曾检出上述突变。因此，在未经家族史或诊断年龄挑选的新发(即最近诊断出的)患者中，BRCA1突变很少见。临床所遇乳腺癌患者，大多属于这一类型。
在30例白人患者中仅有1例与BRCA1有关，这一结果与其他群体研究所获比例一致。对卵巢癌家系进行统计分析，也获得类似结果，但该统计研究可能包括了BRCA1以外的潜在易感基因患者家系。正如所料，高危患者组BRCA1突变携带率较高。遗传性BRCA1突变所致乳腺癌的比例在有3人或3人以上患乳腺癌或卵巢癌的家系为60%～75%，在3人或3人以上患乳腺癌而无卵巢癌的家系为45%。进行门诊咨询的乳腺癌患者(常因家族史和/或诊断年龄早)，11%～16%携带与该病相关的遗传性变异。与此相反，西华盛顿地区早期发病(<35岁)的现存乳腺癌患者，7.5%是BRCA1突变携带者。澳大利亚曾对不足40岁的妇女进行了调查，结果发现乳腺癌患者肽链截短的BRCA1突变携带率为3.6%(95%CI，0.35%～12.6%)(1997年12月，J.L.Hopper,通讯联系)。
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北卡罗来纳群体检出的1例翻译区缺失、7例错义突变属于不明生物学意义的变异类型。由于在患者和对照者上述变异均很罕见，因此若要阐明这些变异在乳腺癌中的作用，就应该对相当数目的对照组进行筛查。随着对变异功能的深入分析，我们对其生物学作用将会有更深刻的认识，从而阐明其临床意义。
黑人妇女较为常见的变异位于3’端非翻译区，患者组是对照组的3倍，表明这一公认的多态性可能具有增高乳腺癌发病风险的作用。尽管，变异位于非翻译区，但3’端非翻译区的确影响mRNA的稳定性，从而影响表型。将来通过对3’端非翻译区变异细胞和野生型细胞的培养，我们将会对野生型和变异型BRCA1信使的稳定性进行实验检测。
那么，哪些人更有可能携带影响乳腺癌发病风险的BRCA1变异呢？首先，卵巢癌是遗传性风险的重要标志：第一，具卵巢癌家族史的白人乳腺癌患者，23%的个体携带遗传性BRCA1。第二，若不考虑患者的发病年龄，只要家系中有4例以上乳腺癌或卵巢癌便反映了家系的遗传易感性。13%的来自乳腺癌或卵巢癌高危家系的患者和33%的来自乳腺癌和卵巢癌高危家系的患者可检出可遗传的BRCA1变异。由于这些结果以发病率最高的少数家系为基础，因此BRCA1突变家系个数的任何波动，都可造成某方面估计的较大差异。前列腺癌的发病风险也受BRCA1影响。因此，将来在鉴定高危个体，涉及家族史的概念时，应将此病考虑在内。
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本文43例于40岁前确诊乳腺癌的妇女，无一携带与乳腺癌相关的BRCA1变异。最近一篇关于高危家系妇女BRCA1检测的报告，也注意到不足 30岁的先证者无BRCA1突变。同样，在其他群体研究，大多数年轻乳腺癌患者也没有检测到BRCA1突变。因此，不能将低龄患者归为BRCA1遗传易感的乳腺癌组。由于家庭成员(包括先证者)早期诊断史比先证者诊断年龄，提供的信息更多，所以，家系成员平均受诊年龄较小是一个更好的BRCA1遗传易感性的指标。
曾有三篇有关BRCA1的报道指出，乳腺癌发病年龄越早与乳腺癌相关变异的携带率越高。在这些研究，年轻患者BRCA1突变的携带率之所以不同于北卡罗来纳研究，可能为等位基因频率差异所致，或者是由于抽样误差(CIs过分重叠)所致。此外，其他研究由于分组时纳入了既年轻又来自高危家系的患者，故使得BRCA1突变率估计值偏高。由于在对研究群体总突变率进行评价时，排除了老龄妇女或没有考虑变异与年龄的分布关系，所以以往有关群体BRCA1突变率的解释是不明确的。人们熟知的BRCA1与早期乳腺癌的联系，通常忽视了这一事实，即：几乎所有有遗传性BRCA1或BRCA2突变的家系，确诊年龄均涉及各个年龄阶段。
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根据遗传检测结果来解释发病风险有许多临床问题值得探讨。首先，阴性结果(即没检测到BRCA1或BRCA2突变)含有几方面的意义。一是该肿瘤可能没有遗传易感性。另外，绝大多数突变属于较大片段的缺失或基因组的复杂改变，单纯对基因组DNA进行检测可能会得到阴性结果。尽管在美国高危家系，cDNA分析法检测到的突变仅占BRCA1突变的5%～10%，但是在荷兰这些突变则很常见。因此，在其他群体，这些突变可能是主要的致病因素。此外，遗传性乳腺癌不一定都与BRCA1或BRCA2相关，其他乳腺癌易感基因仍待鉴定。除非在家系其他成员中检出一种特异性突变，否则阴性检测结果并不能提供完整的信息。第二，与突变(即外显性)有关的癌变风险并不能明显体现BRCA1和BRCA2突变特征，故阳性结果亦不能获得精确解释。在一般群体，与BRCA1有关的乳腺癌发病风险的解决，需要对有风险的妇女进行分析(不是选自高危家系)，而不是对那些已获得基因资料的家族进行分析，才能作出判断。在这方面，虽然已有几项研究，但均未获得最终结论。
对于携带乳腺癌相关遗传性BRCA1突变的妇女，预防乳腺癌和卵巢癌的手段有限。至少，应经常对乳腺进行临床检查。对不足50岁的妇女，常规乳腺照相是否有益仍存在争议。但是在高危群体其用途又如何呢?由于不同妇女乳腺照相的敏感性各异，何时对个体开始进行乳腺X线筛查应特别慎重。乳腺和卵巢的预防性切除，可能是一种更明智的选择方法。最近，已有人对这种处理的预防效果进行了研究。选择预防性乳腺切除的妇女(主要由于乳腺癌家族史或癌前病变)，连续17年乳腺癌预期发生率下降90%。携带遗传性突变的妇女还可选择介于检测法或手术法之间一些方法，如预防性使用Tamoxifen，其预防效果尚在研究之中。
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预防性遗传检测的策略是什么呢？遗传检测面临的社会和法律问题可能比技术问题更为艰巨。由于遗传检测与临床的结合日益密切，继续对遗传检测争论不休便成为悬而未决的难题。遗传检测的临床优势在某些情况下前景可能极为乐观。除非已知家系中存在与癌变有关的突变，否则在大量妇女检出为数极少的突变，不但费用昂贵，而且还存在尚不确定的阴性结果。因此对普通群体中的妇女进行BRCA1和BRCA2全序列筛查是不现实的。在有关突变相对较多的群体，有选择地筛检乳腺癌和卵巢癌患者也许是合理的。对于某些美国妇女，即有乳腺癌和卵巢癌家族史或家族中有4例或4例以上乳腺癌者(任何年龄)，本研究或许有一些现实意义。无论哪种情况，对基因检测细微差别和不可确定性较为熟悉的专家的参与，对临床决定的作出均有莫大好处，包括对非结论性结果，如何及时通告等。
对BRCA1或BRCA2突变携带者进行随访，对任何完整合理的保健体系均是一个重要的组成部分。目前，对整个社会而言，治疗费用，尤其是与晚期肿瘤患者有关的治疗、护理费用，快速增长。对乳腺癌易感个体，采取一些预防措施很可能会收到良好的效果。将经济负担转嫁给患者个人是目光短浅的行为。最后，由于基因型的影响，且大多数易感基因尚未鉴定，每个人均可能对某些疾病具有易感性。
总之，本研究基本上反映了大部分美国乳腺癌患者BRCA1的突变状况(白人患者3.3%，黑人患者0%)。在北卡罗来纳地区，大多数居民其祖先均来自北欧和西欧(1990年，美国人口统计局数据未公布)。仅不足2%的人属于犹太人后裔。由于在北卡罗来纳人群突变携带者人数少，因此突变携带者数目的波动可对某项估计产生明显的影响。但是，白人患者的CI上限(7.2%)排除了其他临床研究资料(11%～16%)对携带率的过高估计。研究表明对乳腺癌患者(或普通人群)进行BRCA1广泛筛查是不现实的。
柳满然 节译 吕有勇 校
JAMA 1998；279：915～921, 百拇医药
单位：
关键词：
美国医学会杂志中文版990203 Frequency of Breast Cancer Attributable to BRCA1
in a Population-Based Series of American Women
研究背景——过去有关BRCA1突变率的研究主要针对乳腺癌高危人群，因此其结果不能反映美国普通人群乳腺癌患者的实际情况。
目的——在一个以人群为基础的白人和黑人乳腺癌患者样本中，确定已知与乳腺癌发病相关的BRCA1突变及其他BRCA1变化的发生率，并了解其种族、诊断年龄和家族史状态差异。这些患者未经家族史选择。
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研究设计——病例-对照研究。
材料来源——卡罗来纳州东部和中部的24个县。
对象——患者为1993年5月至1996年6月确诊患I期浸润型乳腺癌的20～74岁的妇女，对照者为年龄、种族匹配的正常人。第一批研究对象不分种族，患者211例，对照者188例；第二批研究对象包括非裔患者99例，对照者108例。
主要观察指标——分析患者BRCA1基因编码序列、拼接区、5'端非翻译区、3'端非翻译区位点的胚系突变。对照者做类似分析。采用多重Single-stand conformation分析进行筛选，所有潜在变异均行基因组测序分析予以证实。
结果——211例乳腺癌患者中，3例检出与乳腺癌相关的BRCA1突变，且都是肽链截短形式的突变。经抽样校正后，3.3%(95%的可信区间，0%～7.2%)的白人患者检出乳腺癌相关突变，黑人患者为0%。在本研究群体，诊断年龄小并不能预示BRCA1突变携带状态。在白人妇女中，具卵巢癌家族史的患者BRCA1遗传性突变率为23%，家族中(有无卵巢癌不限)至少有4例乳腺癌亲属的患者，突变率为13%；有乳腺癌和卵巢癌家族史且至少有4例受累亲属的患者，突变率为33%。由于这些结果来自少数高危家族，因此其可信区间较大。另有5例患者检出罕见的错义突变或单个氨基酸缺失，其生物学意义还不清楚。黑人妇女中，3’端非翻译区变异在患者组较常见，与对照者比较具有统计学差异。
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结论——研究表明，在普通的美国人群进行广泛的BRCA1筛查是不现实的。相反，在有乳腺癌和卵巢癌或至少有4例乳腺癌患者(不论年龄)的家族，由于BRCA1突变率高，应考虑进行基因型分析。BRCA1群体遗传涉及家族史、发病年龄、遗传祖先等方面的复杂作用，在分析筛查结果时应考虑这些情况。
BRCA1和BRCA2遗传检测的商业可行性是一个尚待讨论的难题。在目前的研究背景下，许多专家和咨询小组提议对乳腺癌易感人群进行筛查。但面对医疗和医药市场，临床常因许多实际困难而放弃这种检查。了解普通人群中白人和黑人患者遗传性BRCA1的实际突变率(不考虑诊断年龄和家族史)有助于我们对美国普通妇女人群是否应进行检查作出选择。
有关乳腺癌遗传基因易感性的信息大多来自高危家系的研究结果，如有BRCA1存在的基本证据、基因定位及克隆。在进行基因分析时，家系大小、受累亲属例数、受累者存活状态、受累者与患者的亲缘关系等家系资料对分析均有重大影响。由于上述原因，早期研究在家系选择时要求几代人中应有多例乳腺癌患者，后来，才开始对确诊年龄较小的患者家系进行研究。目前，由于有关普通人群BRCA1突变率的资料有限，对遗传性BRCA1突变肿瘤易感个体的检查还相当困难。人类BRCA1基因已报道了100多种明显的变异类型。这些与乳腺癌相关的变异几乎都是导致形成肽链截短蛋白的移码突变或无义突变。
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本研究的目的是，通过对无乳腺癌家族史且不考虑诊断年龄的白人和黑人的研究，对遗传性BRCA1突变在临床和公共健康方面的潜在意义进行评价。本文涉及的有关问题是：在普通人群，白人和黑人乳腺癌患者携带已知与该病有关的BRCA1突变的比例是多少？携带率在诊断年龄、种族或家族史方面的差异如何？这些资料对遗传检查有何意义？
方法
研究群体
卡罗来纳乳腺癌研究(CBCS)是一个以人群为基础的病例-对照者研究。该研究对卡罗来纳东部和中部24个县市年龄在20～74岁的乳腺癌患者进行了分析。运用一种快速诊断方法，对26个医院确诊的原发性浸润性乳腺癌患者进行了鉴定。对照组妇女年龄及种族与患者组匹配。对照组选自北卡罗来纳机动车管理局列出的年龄小于65岁的妇女以及美国健康保护基金管理局注册的年龄65～74岁的妇女。由护士进行随访并抽取血样。为获得家系特征，要求先证者列出所有一级亲属，报告所有肿瘤病史(不管部位如何)和诊断年龄。与先证者亲缘关系较远的亲属只询问乳腺癌和卵巢癌的发病情况。
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第一阶段的随访于1993年5月至1996年12月进行，收集了890例患者和841例对照者。为提高亚组统计的把握度，用随机抽样校正法增加年轻人和黑人的采样。患者和对照者对采样的总响应率分别为77%和68%，获得血样者占参加本研究个体的95%。本报道主要采用第一阶段不考虑种族的211例患者和188例对照者以及第二阶段具有非洲血统的99例患者和108例对照者的分析结果。由于全基因BRCA1检测技术费用过高，我们仅对部分患者和对照者进行了分析。本研究获得了北卡罗来纳大学医学院和华盛顿大学审查委员会的批准。另外，还得到了美国卫生和人类服务机构的许可。
突变分析
提取外周血淋巴细胞DNA，用下文描述的多重SSCP法(single-strand conformation analysis)筛查211例患者BRCA1编码序列、剪接连接区及邻近内含子区5'端非翻译区(UTR)和3'端非翻译区的胚系突变。另外，每一患者的部分DNA与特异性寡核苷酸探针杂交，以检测欧洲人群中常见的8种突变。为进一步核实检测的灵敏性，用蛋白截短检测法筛查了第11外显子。所有潜在的罕见突变均经基因组直接测序加以核实，测序模板使用SSCP中相应的DNA带和原来提取的DNA样品。为了将在患者见到的不知临床意义的罕见突变和多态频率与对照者加以比较，使用同样方法对188例对照者进行基因型分析。由于DNA量的限制，某些分析对照者的数量有所差别。
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多重SSCP分析
应用PCR方法，使用47对引物扩增基因组DNA的BRCA1。大多数引物是以前设计的。新设计的引物用于扩增少数区域，并按有关注释(Friedman 等)作了规定。外显子5，3’端引物：5’-ATG GTT TTA TAG GAA CGC TAT G-3’；外显子6，3’端引物：5’-GGT CTT ATC ACC ACG TCA TAG-3’；外显子8，3’端引物：5’-TTT GGC AAA ACT ATA AGA TAA GG-3’；外显子9，3’端引物：5’-TGC ACA TAC ATC CCT GAA CC-3’；外显子10，3’端引物：5’-AGG TCC CAA ATG GTC TTC AG-3’；外显子16A，5’端引物：5’-AAC AGA GAC CAG AAC TTT GTA ATT C-3’，3’端引物：5’-TGC ATT ATA CCC AGC AGT ATC AG-3’；外显子16B，5’端引物：5’-CCA TCT TCA ACC TCT GCA TTG-3’，3’端引物：5’-ACT CTT TCC AGA ATG TTG TTA AGT C-3’；外显子20，5’端引物：5’-GCC TTA AAT ATG ACG TGT CTG CTC-3’，3’端引物：5’-TGG AAT ACA GAG TGG TGG GGT G-3’；外显子24，5’端引物：5’-AGT CGA TTG ATT AGA GCC TAG-3’。PCR扩增条件及SSCP分析按文献描述的方法进行。
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多重SSCP分析可在凝胶的同一泳道同时分析多个外显子或外显子11的多个区域。根据PCR产物片段大小和形式，47对引物的PCR产物可在14个泳道中同时电泳。每一泳道中，对应于不同扩增产物的DNA带型很容易辨别。若发现某一带型发生改变，对该片段进行PCR再扩增，在5’端和3’端链方向进行双向DNA直接测序。另外，从凝胶中切下异常带型，悬浮于蒸溜水中再进行测序。多重SSCP分析检出了本报道中的所有变异。
特异性寡核苷酸杂交
合成特异性寡核苷酸引物以检测BRCA1的8种突变。对185del-AG，4184delTCAA，4446C→T和5382insC进行基因型分析使用的引物和条件见文献报道。对另四种突变， 鉴别正常片段和突变片段的引物如下：外显子5：300T→G正常片段，5’-CCT TCA CAG TGT CCT TTA-3’；突变片段：5’-CCT TCA CAG GGT CCT TTA -3’；外显子5：331(+1)G→A，正常片段：5’AAC CAA AAG GTA TAT AAT-3’，突变片段：5’-AAC CAA AAG ATA TAT AAT-3’；外显子6：332(-11)T→G正常片段：5’-CTC AAA CAA TTT AAT TTC-3’，突变片段：5’-CTC AAA CAA GTT AAT TTC-3’；外显子11：2457C→T正常片段：5’-ATG GCA CTC AGG AAA GTA-3’，突变片段：5’-ATG GCA CTT AGG AAA GTA-3’。
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分别在96孔规格的杂交板上对样品及阳性和阴性对照进行点杂交，进行突变检测分析。所有阳性结果均通过对PCR产物和部分原提取的DNA样品进行直接测序加以证实。还专门用特异性寡核苷酸杂交法对观察到的3种蛋白截短突变进行验证。
白截短检测
使用文献描述的方法和引物，对BRCA1第11外显子的三个片段进行扩增和翻译表达，经蛋白截短检测未发现新的突变。
DNA测序
用原来的PCR/SSCP引物作为测序引物，用自动和/或手工测序法对每个突变外显子或片段的PCR再扩增产物进行DNA双链直接测序分析。自动测序应用标记染色双脱氧末端法，在DNA测序仪上进行(ABI Prism 377，Foster City，Calif：Applied Biosystems of Perkin Elmer)。手工测序根据PCR产物测序试剂盒操作指南进行(Cleveland，Ohio：United States Biochemical)
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单倍型分析
据BRCA1基因型侧翼标记设计引物和条件，对与BRCA1突变相关的乳腺癌患者进行单倍型分析，并将这些标记处的患者基因型与具有同样突变的高危家系患者的单倍型进行比较，以了解突变来源是否一致。
统计分析
采用SAS和SUDAAN软件，计算有关比例和95%可信区间(CIs)。根据种族和年龄组成的已知比例，分别对患者和对照者进行抽样分析；合并各统计分析的权值，得到反映研究群体突变率的评估参数。运用PROC GENMOD软件通过逻辑回归分析估算优势比(ORs)和CIs，该软件包含一些弥补项，可对抽样造成的人种和年龄偏差进行校正，以便对结果进行正确判断。
结果
患者组和对照组种族、年龄分布相似。与对照者相比，患者组乳腺癌或卵巢癌一级亲属、血缘较远的亲属及受累亲属人数较多。4例女性(2例患者，2例对照者)报告有男性乳腺癌亲属。
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对211例患者进行了基因型分析，3例携带BRCA1肽链截短突变。3例患者均为白人，乳腺癌发病年龄分别为45、52和53岁。2例患者(NC1和NC2)发现内含子5的一个拼接区突变，332(-11)T→G。NC1家系中有一个姐姐41岁患乳腺癌。NC2家系中有一个侄女患卵巢癌。内含子5的这一突变，破坏了一个拼接接受位点，导致mRNA剪接错误，内含子5有59个核苷酸插入mRNA中。使得翻译终止于突变BRCA1序列的81位密码子。这种剪接突变曾见于较早报道的高危家系成员(家系82)，以及具西欧血统的另4个高危家系。NC1、NC2基因型和家系82中侧翼BRCA1标志显示这些家系具有相同祖先来源的染色体区17q21，突变可能有共同起因。尽管NC1和NC2不存在密切关系，但都来自北卡罗来纳同一个县，家系82亦来自该州。
BRCA1第11外显子单个核苷酸2457 C→T，是一种无义突变，引起翻译停止于780位密码子。这一突变见于NC3家系，该家系中母亲患乳腺癌，一个姐姐年轻时诊断患双侧乳腺癌，另一个姐姐患乳腺癌和卵巢癌，一个哥哥患膀胱癌。这一突变曾见于祖籍是荷兰的一个家系中，该家系三代共7例乳腺癌患者(家系7)。后来又在3个荷兰家系、1个德国家系、4个美国家系中发现。NC13基因型和家系7中BRCA1侧翼标志表明变异的根本原因为微卫星D17S1322处有一新突变。
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5例患者发现了3个错义突变和1个3bp的缺失突变。变异对发病风险的影响还不清楚。1个黑人家系(NC6)发现的11外显子1200位密码子的组氨酸(His)→谷氨酸(Glu)替代，2例白人患者(NC7、NC8)的第20外显子发生的甘氨酸(Gly) → 精氨酸(Arg)，还未见任何报道。CBCS来源的148例对照者中也观察到外显子20变异。这些病例(NC6至NC8)与乳腺癌或卵巢癌都没关系。1例黑人患者(NC5)和1例黑人对照者379位密码子发生蛋氨酸(Met)→异亮氨酸(Ile)替代，该突变各地都有报道。NC5家系患者报告一个姑妈患有乳腺癌，父亲和哥哥患前列腺癌。一白人患者(NC4)外显子11中缺失3个碱基对导致天冬氨酸(Asp)的缺失，她还报告一位姑妈患卵巢癌。这种缺失还见于英裔乳腺癌患者(R.A.Eeles，通讯联系，1997年12月)。
北卡罗来纳研究区内，与遗传性乳腺癌相关的BRCA1突变，白人患者为3.3%，黑人患者0%。全部乳腺癌患者BRCA1的总变异率为2.6%。所有结果均经抽样误差校正。白人女性中, 任意亲属患乳腺癌或卵巢癌的患者，遗传性BRCA1变异的发生率为6.6%, 任意亲属患卵巢癌的患者，遗传性BRCA1变异的发生率为22.8%。高危家系遗传性突变率高，与预想的一致。在白人女性中，来自乳腺癌或卵巢癌高危家系的患者13.4%，来自乳腺癌和卵巢癌高危家系的患者33%有BRCA1突变。50岁前确诊为乳腺癌的患者与50岁后确诊为乳腺癌的患者相比，相关遗传性BRCA1突变率并无明显增加。携带相关变异的妇女受诊时加权平均年龄为51.5岁，有其他罕见错义突变或编码框缺失突变的妇女加权平均年龄为55.8岁，其他乳腺癌患者加权平均年龄为55.7岁。
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在患者组观察到内含子8、16、18、22和编码核苷酸710、1186、2430、2731、3232、3238、3667、4158、4801和4956位发生变异。这些变异都属于多态现象，以PM值来鉴别。有5种变异(包括内含子8、16，外显子11的2430、3232、3667位核苷酸)由于共处于一种连锁不平衡状态，可作为一个单元遗传给下一代。黑人妇女中检出了4种新的变异(见于外显子11、12、16、内含子12)，这些变异是同义突变(无氨基酸的改变)或发生于非翻译区。在一个黑人妇女的外显子3上, 还检测到第5种变异，该变异以前曾有过报道。外显子11，3537位A→G是错义突变，在黑人患者和对照者中发生频率低。
3’端非翻译区36位核苷酸发生C→G替代，黑人患者比黑人对照者更常见：86例患者中有18例，74例对照者中有5例具基因型CG或GG。这些较罕见的G位点亦见于1例白人、1例美国土著患者以及1例白人对照者。本研究的黑人女性，乳腺癌和等位碱基G的年龄校正OR值是3.5(95%CI，1.2～10.0)。为了单独检测两者的关系，我们还对参与CBCS自称为黑人的99例患者和108例对照者进行了基因型分析，乳腺癌和等位碱基G年龄校正OR值为1.7(95%的CI，0.5～6.3)。综合两次结果，年龄校正OR值为2.8(95%CI，1.3～6.2)。黑人妇女中具罕见等位碱基G的个体，加权平均受诊年龄为54.5岁，而具等位碱基C的纯合个体，加权平均受诊年龄为52.5岁。3’端UTR位点与内含子22的一种变异处于部分连锁不平衡状态。内含子22变异与乳腺癌的关系不具统计学显著性。
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评论
在北卡罗来纳的白人妇女，与乳腺癌相关的BRCA1突变的携带率是3.3%。黑人妇女未检出已知与乳腺癌相关的BRCA1突变，但在高危黑人家系中，以往曾检出上述突变。因此，在未经家族史或诊断年龄挑选的新发(即最近诊断出的)患者中，BRCA1突变很少见。临床所遇乳腺癌患者，大多属于这一类型。
在30例白人患者中仅有1例与BRCA1有关，这一结果与其他群体研究所获比例一致。对卵巢癌家系进行统计分析，也获得类似结果，但该统计研究可能包括了BRCA1以外的潜在易感基因患者家系。正如所料，高危患者组BRCA1突变携带率较高。遗传性BRCA1突变所致乳腺癌的比例在有3人或3人以上患乳腺癌或卵巢癌的家系为60%～75%，在3人或3人以上患乳腺癌而无卵巢癌的家系为45%。进行门诊咨询的乳腺癌患者(常因家族史和/或诊断年龄早)，11%～16%携带与该病相关的遗传性变异。与此相反，西华盛顿地区早期发病(<35岁)的现存乳腺癌患者，7.5%是BRCA1突变携带者。澳大利亚曾对不足40岁的妇女进行了调查，结果发现乳腺癌患者肽链截短的BRCA1突变携带率为3.6%(95%CI，0.35%～12.6%)(1997年12月，J.L.Hopper,通讯联系)。
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北卡罗来纳群体检出的1例翻译区缺失、7例错义突变属于不明生物学意义的变异类型。由于在患者和对照者上述变异均很罕见，因此若要阐明这些变异在乳腺癌中的作用，就应该对相当数目的对照组进行筛查。随着对变异功能的深入分析，我们对其生物学作用将会有更深刻的认识，从而阐明其临床意义。
黑人妇女较为常见的变异位于3’端非翻译区，患者组是对照组的3倍，表明这一公认的多态性可能具有增高乳腺癌发病风险的作用。尽管，变异位于非翻译区，但3’端非翻译区的确影响mRNA的稳定性，从而影响表型。将来通过对3’端非翻译区变异细胞和野生型细胞的培养，我们将会对野生型和变异型BRCA1信使的稳定性进行实验检测。
那么，哪些人更有可能携带影响乳腺癌发病风险的BRCA1变异呢？首先，卵巢癌是遗传性风险的重要标志：第一，具卵巢癌家族史的白人乳腺癌患者，23%的个体携带遗传性BRCA1。第二，若不考虑患者的发病年龄，只要家系中有4例以上乳腺癌或卵巢癌便反映了家系的遗传易感性。13%的来自乳腺癌或卵巢癌高危家系的患者和33%的来自乳腺癌和卵巢癌高危家系的患者可检出可遗传的BRCA1变异。由于这些结果以发病率最高的少数家系为基础，因此BRCA1突变家系个数的任何波动，都可造成某方面估计的较大差异。前列腺癌的发病风险也受BRCA1影响。因此，将来在鉴定高危个体，涉及家族史的概念时，应将此病考虑在内。
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本文43例于40岁前确诊乳腺癌的妇女，无一携带与乳腺癌相关的BRCA1变异。最近一篇关于高危家系妇女BRCA1检测的报告，也注意到不足 30岁的先证者无BRCA1突变。同样，在其他群体研究，大多数年轻乳腺癌患者也没有检测到BRCA1突变。因此，不能将低龄患者归为BRCA1遗传易感的乳腺癌组。由于家庭成员(包括先证者)早期诊断史比先证者诊断年龄，提供的信息更多，所以，家系成员平均受诊年龄较小是一个更好的BRCA1遗传易感性的指标。
曾有三篇有关BRCA1的报道指出，乳腺癌发病年龄越早与乳腺癌相关变异的携带率越高。在这些研究，年轻患者BRCA1突变的携带率之所以不同于北卡罗来纳研究，可能为等位基因频率差异所致，或者是由于抽样误差(CIs过分重叠)所致。此外，其他研究由于分组时纳入了既年轻又来自高危家系的患者，故使得BRCA1突变率估计值偏高。由于在对研究群体总突变率进行评价时，排除了老龄妇女或没有考虑变异与年龄的分布关系，所以以往有关群体BRCA1突变率的解释是不明确的。人们熟知的BRCA1与早期乳腺癌的联系，通常忽视了这一事实，即：几乎所有有遗传性BRCA1或BRCA2突变的家系，确诊年龄均涉及各个年龄阶段。
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根据遗传检测结果来解释发病风险有许多临床问题值得探讨。首先，阴性结果(即没检测到BRCA1或BRCA2突变)含有几方面的意义。一是该肿瘤可能没有遗传易感性。另外，绝大多数突变属于较大片段的缺失或基因组的复杂改变，单纯对基因组DNA进行检测可能会得到阴性结果。尽管在美国高危家系，cDNA分析法检测到的突变仅占BRCA1突变的5%～10%，但是在荷兰这些突变则很常见。因此，在其他群体，这些突变可能是主要的致病因素。此外，遗传性乳腺癌不一定都与BRCA1或BRCA2相关，其他乳腺癌易感基因仍待鉴定。除非在家系其他成员中检出一种特异性突变，否则阴性检测结果并不能提供完整的信息。第二，与突变(即外显性)有关的癌变风险并不能明显体现BRCA1和BRCA2突变特征，故阳性结果亦不能获得精确解释。在一般群体，与BRCA1有关的乳腺癌发病风险的解决，需要对有风险的妇女进行分析(不是选自高危家系)，而不是对那些已获得基因资料的家族进行分析，才能作出判断。在这方面，虽然已有几项研究，但均未获得最终结论。
对于携带乳腺癌相关遗传性BRCA1突变的妇女，预防乳腺癌和卵巢癌的手段有限。至少，应经常对乳腺进行临床检查。对不足50岁的妇女，常规乳腺照相是否有益仍存在争议。但是在高危群体其用途又如何呢?由于不同妇女乳腺照相的敏感性各异，何时对个体开始进行乳腺X线筛查应特别慎重。乳腺和卵巢的预防性切除，可能是一种更明智的选择方法。最近，已有人对这种处理的预防效果进行了研究。选择预防性乳腺切除的妇女(主要由于乳腺癌家族史或癌前病变)，连续17年乳腺癌预期发生率下降90%。携带遗传性突变的妇女还可选择介于检测法或手术法之间一些方法，如预防性使用Tamoxifen，其预防效果尚在研究之中。
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预防性遗传检测的策略是什么呢？遗传检测面临的社会和法律问题可能比技术问题更为艰巨。由于遗传检测与临床的结合日益密切，继续对遗传检测争论不休便成为悬而未决的难题。遗传检测的临床优势在某些情况下前景可能极为乐观。除非已知家系中存在与癌变有关的突变，否则在大量妇女检出为数极少的突变，不但费用昂贵，而且还存在尚不确定的阴性结果。因此对普通群体中的妇女进行BRCA1和BRCA2全序列筛查是不现实的。在有关突变相对较多的群体，有选择地筛检乳腺癌和卵巢癌患者也许是合理的。对于某些美国妇女，即有乳腺癌和卵巢癌家族史或家族中有4例或4例以上乳腺癌者(任何年龄)，本研究或许有一些现实意义。无论哪种情况，对基因检测细微差别和不可确定性较为熟悉的专家的参与，对临床决定的作出均有莫大好处，包括对非结论性结果，如何及时通告等。
对BRCA1或BRCA2突变携带者进行随访，对任何完整合理的保健体系均是一个重要的组成部分。目前，对整个社会而言，治疗费用，尤其是与晚期肿瘤患者有关的治疗、护理费用，快速增长。对乳腺癌易感个体，采取一些预防措施很可能会收到良好的效果。将经济负担转嫁给患者个人是目光短浅的行为。最后，由于基因型的影响，且大多数易感基因尚未鉴定，每个人均可能对某些疾病具有易感性。
总之，本研究基本上反映了大部分美国乳腺癌患者BRCA1的突变状况(白人患者3.3%，黑人患者0%)。在北卡罗来纳地区，大多数居民其祖先均来自北欧和西欧(1990年，美国人口统计局数据未公布)。仅不足2%的人属于犹太人后裔。由于在北卡罗来纳人群突变携带者人数少，因此突变携带者数目的波动可对某项估计产生明显的影响。但是，白人患者的CI上限(7.2%)排除了其他临床研究资料(11%～16%)对携带率的过高估计。研究表明对乳腺癌患者(或普通人群)进行BRCA1广泛筛查是不现实的。
柳满然 节译 吕有勇 校
JAMA 1998；279：915～921, 百拇医药