大鼠弥漫性脑损伤不同脑部位不同时相的脂质过氧化反应
作者：王君宇 项乃强 叶鲜明 吴浩强 潘伟生
单位：王君宇 附属湘雅医院神经病学研究所 长沙 410008；项乃强 叶鲜明 吴浩强 潘伟生 香港中文大学威尔斯亲王医院神经外科病理科
关键词：脑损伤；自由基；脂质过氧化物*；大鼠
湖南医科大学学报990232 提 要 利用Marmarou氏脑损伤动物模型，测定大鼠脑损伤后不同时间和部位的丙 二醛(MDA)含量。结果示：损伤后1h，额叶、顶叶、脑干等处的MDA水平分别比对照组高出 36.7%，41.8%和35.1%(P<0.01)，并持续增高，伤后4h达高峰后缓慢下降，伤后24h仍明显高于对照组。纹状体、颞叶等处伤后1h的MDA水平升高较上述部位稍低，而分别较对照组升高16.9%和13.3%(P<0.01)，伤后4h虽仍持续升高，但不超过35%。提示在大鼠弥漫性脑损伤后短期内即有自由基生成，几乎波及脑内各个部位，但程度不一。
, http://www.100md.com
The phasic and regional variations of lipid peroxidation afterdiffuse brain injury in rats
Wang Junyu
(Department of Neurosurgery, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
Objective: Using a diffuse brain injury animal model, we studied the time course of lipid peroxidation in different regions of injured rat brains. Methods: 53 male SD rats were randomly divided into sham, post-traumatic 1,2,4,7,24h groups (n=8) to measure the MDA(malondialdehyde) at the bilateral frontal, temporal, parietal, striatum and brain stem, another 5 rats were researched for histological study. Results: At the frontal, parietal and brain stem, the MDA levels were 36.7%, 41.8% and 35.1%, respectively, higher than sham at one hour after injury (P<0.01). The MDA levels in these regions continued to increase and peaked at 4 hours after the injury. The levels decreased slowly, and by 24 hours, they were still significantly higher than the sham control's. The elevation of MDA levels was less in the striatum and the temporal compared with above regions at one hour. Their rising rates were 16.9% and 13.3%, respectively(P<0.01). The MDA levels in there two regions continued to increase even after 4 hours of injury, but the degree of elevation never exceeded 35%. Conclusion: There is an immediate, post-traumatic burst of MDA production, suggesting the formation of free radicals after diffuse head injury. Even though all the regions sampled show the same effect, certain regions are less affected in this diffuse brain injury animal model.
, 百拇医药
Key words rat; brain injury; diffuse injury; free radicals; lipid peroxidation*
中枢神经系统创伤后生物膜的损伤可能系因自由基引起的脂质过氧化所致[1，2]。细胞膜的脂质过氧化使得膜的通透性改变，最终导致细胞死亡。已有证据表明在局灶性脑损伤时，伤后短时间内自由基大量形成[3]，而同样的现象在弥漫性脑损伤中却未见报道。在闭合性脑损伤中，弥漫性脑损伤是一种最重要的原发性脑损伤[4，5]。虽然它缺乏局部性的损伤灶，但在脑干腹侧、胼胝体、小脑上臂等处却可能出现出血坏死灶[4]。实验性脑损伤中大多集中于局限性脑损伤的研究，如液压损伤模型、皮层撞击模型或低温冷冻致伤模型。本文利用Marmarou氏弥漫性脑损伤的动物模型[6]测定大鼠弥漫性脑损伤后的脂质过氧化反应，旨在研究鼠脑不同部位在不同时相的脂质过氧化程度。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 弥漫性脑损伤动物模型的制作 取SD雄性大鼠53只，体重350～380g。所有实验动物由香港中文大学提供，其中5只用于组织学研究，其余鼠被分为假手术组，伤后1，2，4，8，24h组，共6组，每组8只。操作按Marmarou氏介绍的方法[6]。腹腔注射5%戊巴比妥钠(50mg.kg-1)，麻醉后行气管切开，插入一硅胶管，以利于清除气管骨分泌物，防止呼吸道梗阻，并以呼吸机辅助呼吸。股动脉插管行血压监测，抽股动脉血作血气分析，插入肛温计保持体温于36.5～37.5℃。接呼吸监测仪、心电示波器。正中切开头皮，分开骨膜，显露冠状缝和人字缝，用AA(aron alpha)胶将不锈钢垫片粘于颅骨正中位。大鼠俯卧固定于一已知弹性系数的海绵床上，置450g钢砝码于一有机玻璃管内，砝码由2m高处垂直自由坠落在不锈钢垫片上，使动物遭受一次打击后，立即将大鼠移至手术台上以呼吸机辅助呼吸，接血压、心电等监测仪。对照组除不施打击外余操作同前。大鼠被处死后于60s内取出全脑，并迅速挖取双侧额叶、顶叶、颞叶、纹状体及脑干处之等大脑组织块。
, 百拇医药
1.2 脂质过氧化物的测定 丙二醛(MDA)是脂质过氧化过程中一种比较稳定的中间产物。测定其含量可反映脂质过氧化的程度。本文MDA的测定按Ohkawa H介绍的方法[7]进行。
1.3 组织学准备 伤后24h大鼠5只，经左心室灌注10%福尔马林液(critikon 2102A, Florida)后，取出全脑置于同样浓度的液体中固定4h以上。将固定后的脑标本进行连续冠状切片，每片厚度为2mm。常规HE染色，同时用ABC(avidin-biotin peroxidase complex)方法行β-APP(β-amyloid precursor protein boehringer germany)[8，9]免疫染色。
2 结果
2.1 血气和MAP的改变 结果见表1。所有动物在伤前均未出现持续性低氧和低血压状态(MAP<8kPa)。所有创伤组动物在伤后均出现短暂的平均动脉压下降，但在数分钟内恢复正常。
, 百拇医药
表1 动脉血气和平均动脉压(MAP)(
±s) 组别
n
pH
PCO2(kPa)
PO2(kPa)
MAP(损伤前)
对照
8
7.42±0.04
4.91±0.40
, 百拇医药 16.46±1.16
94.22±5.33
1h
8
7.40±0.05
5.26±0.40
16.33±2.01
90.25±3.45
2h
8
7.45±0.04
4.58±0.22
, http://www.100md.com
15.00±2.04
91.00±4.66
4h
8
7.44±0.04
4.82±0.33
16.84±1.76
91.25±7.09
8h
8
7.40±0.03
4.72±0.32
, http://www.100md.com
14.08±1.36
87.25±4.40
24h
8
7.40±0.04
5.13±0.56
15.99±2.01
89.75±4.74
2.2 组织学改变 伤后24h用于组织病理学研究的5只鼠脑组织，在HE染色切片上未发现局灶性脑挫伤及轴索空泡，使用β-APP免疫法染色后，在胼胝体处可见典型的轴索空泡出现(附图)。
, 百拇医药
附图 伤后24h免疫染色(β-APP)切片示胼胝体处大量轴索回缩球出现
Fig. Photomicrograph of corpus callosum of rat with axonal retraction balls stained with anti-amyloid precursor protein after 24h of injury
2.3 MDA水平的改变 伤后脑不同部位不同时相的MDA水平见表2。由表2可见伤后1h额叶、顶叶、脑干等处的MDA分别较对照组高出36.7%，41.8%，35.1%(P<0.01)，伤后4h内MDA持续升高，然后缓慢下降，24h后仍明显高于对照组(P<0.01)。颞叶和纹状体区，损伤1h MDA水平分别较对照组高出16.9%和13.3%(P<0.05)，伤后4h仍持续升高，但最高值尚未超过35%。
表2 鼠脑弥漫性损伤后不同时相不同部位的MDA水平(nmol.L-1，±s)
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对照组
1h
2h
4h
8h
24h
额 叶
338±12
464±27
406±26
475±18
460±26
451±11
, 百拇医药
顶 叶
342±13
503±09
478±12
490±11
467±15
430±14
脑 干
378±11
503±22
479±18
607±10
547±24
, 百拇医药
513±29
纹状体
411±21
476±23
518±18
517±26
490±27
552±25
颞 叶
308±27
350±13
374±12
381±13
, 百拇医药
387±16
383±11
3 讨论
自Marmarou介绍其弥漫性脑外伤的动物模型以来，已有许多作者借此模型开展了诸如脑水肿、血脑屏障等方面的研究。本实验首次利用该模型测定损伤脑组织的MDA含量，研究弥漫性脑外伤后的脂质过氧化反应。许多研究表明氧自由基介导的病理作用在创伤性脑外伤中起着重要作用[1，2，6]。其机制可能是脑外伤后迅速产生的自由基诱发了脑组织的脂质过氧化反应，从而引起了一系列的病理变化。MDA是脂质过氧化过程中的一种较稳定的产物，通常被用于反映生物体的脂质过氧化程度，也间接地反映生物组织中自由基形成的多少。本文采用了国际上较为通用的TBA方法，在弥漫性脑外伤后不同时相内测定了脑不同部位的MDA水平。此法虽不直接测定生物体中所形成的自由基，但却能间接地反映生物组织变化。
本文结果显示，弥漫性脑外伤后1h已有MDA明显增高，表明在急性脑外伤的病理过程中氧自由基起着重要作用。Smith等在局灶性脑外伤的模型中，发现伤后5min自由基水平已升至峰值，损伤局部脑组织的卵磷脂过氧化物含量在伤后60min达峰值。本实验MDA水平于伤后4h达到峰值，伤后24h仍明显高于对照组。资料还显示，弥漫性脑外伤时不同脑区的脂质过氧化程度并不一致，脑干的MDA水平最高，其次为额叶、顶叶。这与组织病理学上脑干处常出现点状出血灶这一现象相吻合；临床上也常见弥漫性脑外伤时脑干最易受损[4，5]。颞叶和纹状体区的MDA水平伤后虽也明显升高，但较上述部位相对较低，表明所谓“弥漫性脑外伤”并非均一的脑的损伤。
, 百拇医药
中国图书分类号 R741.02
参考文献
[1]Demopoulos HB, Flamm ES, Seligman ML. Further studies on free radical pathology in the major central nervous system disorders: Effect of very high dose of methyprednisolone on the functional outcome, morphology and chemistry of experimental spinal cord impact injury. Can J Physiol Pharmacol, 1982,60:1414-1424
[2]Hall ED, Braughler JM. Effecs of intravenous methylprednisolone on spinal cord lipid peroxidation and (Na+-K+)-ATPase: Dose response analysis during 1st hour after contusion injury in the cat. J Neurosurg, 1982,57:247-253
, 百拇医药
[3]Smith SL, Andrus PK, Zhang JR, et al. Direct measurement of hydroxyl radicals, lipid peroxidation, and blood-brain barrier disruption following unilateral cortical impact head injury in the rat. J Neurotrauma, 1994,11:393-404
[4]Adams JH. Head Injury. In: Adams JH, Kuchen LW, eds. Greenfield's Neuropathology. 4th ed, London: Edward Arnol, 1992:100-109
[5]Blumberg PC, Jones NR, North JB. Diffuse axonal injury in head trauma. J Neurol Neurosurg Pyschiatry, 1989,52:838-841
, 百拇医药
[6]Marmarou A, Foda MAA, Brink W, et al. A new model of diffuse brain injury in rawts. Part Ⅰ,Ⅱ: Pathophysiology and biomechanics. J Neurosurg, 1994,80:291-313
[7]Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissue by thiobaritux acid reaction. Anal Biochem, 1979,95:351-358
[8]Gentleman SM, Nash AJ, Sweeting CJ, et al. β-amyloid precursor protein(β-APP) as a marker of axonal injury after head injury. Neurosci Lett, 1993,160:139-144
[9]Sheriff FE, Bridges LR, Sivaloganatham S. Early detection of axonal injury after human head trauma using immunocytochemistry for β-amyloid prcursor protein. Acta Neuropathol, 1994,87:55-62
收稿日期：1998-10-12, 百拇医药
单位：王君宇 附属湘雅医院神经病学研究所 长沙 410008；项乃强 叶鲜明 吴浩强 潘伟生 香港中文大学威尔斯亲王医院神经外科病理科
关键词：脑损伤；自由基；脂质过氧化物*；大鼠
湖南医科大学学报990232 提 要 利用Marmarou氏脑损伤动物模型，测定大鼠脑损伤后不同时间和部位的丙 二醛(MDA)含量。结果示：损伤后1h，额叶、顶叶、脑干等处的MDA水平分别比对照组高出 36.7%，41.8%和35.1%(P<0.01)，并持续增高，伤后4h达高峰后缓慢下降，伤后24h仍明显高于对照组。纹状体、颞叶等处伤后1h的MDA水平升高较上述部位稍低，而分别较对照组升高16.9%和13.3%(P<0.01)，伤后4h虽仍持续升高，但不超过35%。提示在大鼠弥漫性脑损伤后短期内即有自由基生成，几乎波及脑内各个部位，但程度不一。
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The phasic and regional variations of lipid peroxidation afterdiffuse brain injury in rats
Wang Junyu
(Department of Neurosurgery, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
Objective: Using a diffuse brain injury animal model, we studied the time course of lipid peroxidation in different regions of injured rat brains. Methods: 53 male SD rats were randomly divided into sham, post-traumatic 1,2,4,7,24h groups (n=8) to measure the MDA(malondialdehyde) at the bilateral frontal, temporal, parietal, striatum and brain stem, another 5 rats were researched for histological study. Results: At the frontal, parietal and brain stem, the MDA levels were 36.7%, 41.8% and 35.1%, respectively, higher than sham at one hour after injury (P<0.01). The MDA levels in these regions continued to increase and peaked at 4 hours after the injury. The levels decreased slowly, and by 24 hours, they were still significantly higher than the sham control's. The elevation of MDA levels was less in the striatum and the temporal compared with above regions at one hour. Their rising rates were 16.9% and 13.3%, respectively(P<0.01). The MDA levels in there two regions continued to increase even after 4 hours of injury, but the degree of elevation never exceeded 35%. Conclusion: There is an immediate, post-traumatic burst of MDA production, suggesting the formation of free radicals after diffuse head injury. Even though all the regions sampled show the same effect, certain regions are less affected in this diffuse brain injury animal model.
, 百拇医药
Key words rat; brain injury; diffuse injury; free radicals; lipid peroxidation*
中枢神经系统创伤后生物膜的损伤可能系因自由基引起的脂质过氧化所致[1，2]。细胞膜的脂质过氧化使得膜的通透性改变，最终导致细胞死亡。已有证据表明在局灶性脑损伤时，伤后短时间内自由基大量形成[3]，而同样的现象在弥漫性脑损伤中却未见报道。在闭合性脑损伤中，弥漫性脑损伤是一种最重要的原发性脑损伤[4，5]。虽然它缺乏局部性的损伤灶，但在脑干腹侧、胼胝体、小脑上臂等处却可能出现出血坏死灶[4]。实验性脑损伤中大多集中于局限性脑损伤的研究，如液压损伤模型、皮层撞击模型或低温冷冻致伤模型。本文利用Marmarou氏弥漫性脑损伤的动物模型[6]测定大鼠弥漫性脑损伤后的脂质过氧化反应，旨在研究鼠脑不同部位在不同时相的脂质过氧化程度。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 弥漫性脑损伤动物模型的制作 取SD雄性大鼠53只，体重350～380g。所有实验动物由香港中文大学提供，其中5只用于组织学研究，其余鼠被分为假手术组，伤后1，2，4，8，24h组，共6组，每组8只。操作按Marmarou氏介绍的方法[6]。腹腔注射5%戊巴比妥钠(50mg.kg-1)，麻醉后行气管切开，插入一硅胶管，以利于清除气管骨分泌物，防止呼吸道梗阻，并以呼吸机辅助呼吸。股动脉插管行血压监测，抽股动脉血作血气分析，插入肛温计保持体温于36.5～37.5℃。接呼吸监测仪、心电示波器。正中切开头皮，分开骨膜，显露冠状缝和人字缝，用AA(aron alpha)胶将不锈钢垫片粘于颅骨正中位。大鼠俯卧固定于一已知弹性系数的海绵床上，置450g钢砝码于一有机玻璃管内，砝码由2m高处垂直自由坠落在不锈钢垫片上，使动物遭受一次打击后，立即将大鼠移至手术台上以呼吸机辅助呼吸，接血压、心电等监测仪。对照组除不施打击外余操作同前。大鼠被处死后于60s内取出全脑，并迅速挖取双侧额叶、顶叶、颞叶、纹状体及脑干处之等大脑组织块。
, 百拇医药
1.2 脂质过氧化物的测定 丙二醛(MDA)是脂质过氧化过程中一种比较稳定的中间产物。测定其含量可反映脂质过氧化的程度。本文MDA的测定按Ohkawa H介绍的方法[7]进行。
1.3 组织学准备 伤后24h大鼠5只，经左心室灌注10%福尔马林液(critikon 2102A, Florida)后，取出全脑置于同样浓度的液体中固定4h以上。将固定后的脑标本进行连续冠状切片，每片厚度为2mm。常规HE染色，同时用ABC(avidin-biotin peroxidase complex)方法行β-APP(β-amyloid precursor protein boehringer germany)[8，9]免疫染色。
2 结果
2.1 血气和MAP的改变 结果见表1。所有动物在伤前均未出现持续性低氧和低血压状态(MAP<8kPa)。所有创伤组动物在伤后均出现短暂的平均动脉压下降，但在数分钟内恢复正常。
, 百拇医药
表1 动脉血气和平均动脉压(MAP)(
±s) 组别n
pH
PCO2(kPa)
PO2(kPa)
MAP(损伤前)
对照
8
7.42±0.04
4.91±0.40
, 百拇医药 16.46±1.16
94.22±5.33
1h
8
7.40±0.05
5.26±0.40
16.33±2.01
90.25±3.45
2h
8
7.45±0.04
4.58±0.22
, http://www.100md.com
15.00±2.04
91.00±4.66
4h
8
7.44±0.04
4.82±0.33
16.84±1.76
91.25±7.09
8h
8
7.40±0.03
4.72±0.32
, http://www.100md.com
14.08±1.36
87.25±4.40
24h
8
7.40±0.04
5.13±0.56
15.99±2.01
89.75±4.74
2.2 组织学改变 伤后24h用于组织病理学研究的5只鼠脑组织，在HE染色切片上未发现局灶性脑挫伤及轴索空泡，使用β-APP免疫法染色后，在胼胝体处可见典型的轴索空泡出现(附图)。
, 百拇医药
附图 伤后24h免疫染色(β-APP)切片示胼胝体处大量轴索回缩球出现
Fig. Photomicrograph of corpus callosum of rat with axonal retraction balls stained with anti-amyloid precursor protein after 24h of injury
2.3 MDA水平的改变 伤后脑不同部位不同时相的MDA水平见表2。由表2可见伤后1h额叶、顶叶、脑干等处的MDA分别较对照组高出36.7%，41.8%，35.1%(P<0.01)，伤后4h内MDA持续升高，然后缓慢下降，24h后仍明显高于对照组(P<0.01)。颞叶和纹状体区，损伤1h MDA水平分别较对照组高出16.9%和13.3%(P<0.05)，伤后4h仍持续升高，但最高值尚未超过35%。
表2 鼠脑弥漫性损伤后不同时相不同部位的MDA水平(nmol.L-1，
±s), http://www.100md.com
对照组
1h
2h
4h
8h
24h
额 叶
338±12
464±27
406±26
475±18
460±26
451±11
, 百拇医药
顶 叶
342±13
503±09
478±12
490±11
467±15
430±14
脑 干
378±11
503±22
479±18
607±10
547±24
, 百拇医药
513±29
纹状体
411±21
476±23
518±18
517±26
490±27
552±25
颞 叶
308±27
350±13
374±12
381±13
, 百拇医药
387±16
383±11
3 讨论
自Marmarou介绍其弥漫性脑外伤的动物模型以来，已有许多作者借此模型开展了诸如脑水肿、血脑屏障等方面的研究。本实验首次利用该模型测定损伤脑组织的MDA含量，研究弥漫性脑外伤后的脂质过氧化反应。许多研究表明氧自由基介导的病理作用在创伤性脑外伤中起着重要作用[1，2，6]。其机制可能是脑外伤后迅速产生的自由基诱发了脑组织的脂质过氧化反应，从而引起了一系列的病理变化。MDA是脂质过氧化过程中的一种较稳定的产物，通常被用于反映生物体的脂质过氧化程度，也间接地反映生物组织中自由基形成的多少。本文采用了国际上较为通用的TBA方法，在弥漫性脑外伤后不同时相内测定了脑不同部位的MDA水平。此法虽不直接测定生物体中所形成的自由基，但却能间接地反映生物组织变化。
本文结果显示，弥漫性脑外伤后1h已有MDA明显增高，表明在急性脑外伤的病理过程中氧自由基起着重要作用。Smith等在局灶性脑外伤的模型中，发现伤后5min自由基水平已升至峰值，损伤局部脑组织的卵磷脂过氧化物含量在伤后60min达峰值。本实验MDA水平于伤后4h达到峰值，伤后24h仍明显高于对照组。资料还显示，弥漫性脑外伤时不同脑区的脂质过氧化程度并不一致，脑干的MDA水平最高，其次为额叶、顶叶。这与组织病理学上脑干处常出现点状出血灶这一现象相吻合；临床上也常见弥漫性脑外伤时脑干最易受损[4，5]。颞叶和纹状体区的MDA水平伤后虽也明显升高，但较上述部位相对较低，表明所谓“弥漫性脑外伤”并非均一的脑的损伤。
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中国图书分类号 R741.02
参考文献
[1]Demopoulos HB, Flamm ES, Seligman ML. Further studies on free radical pathology in the major central nervous system disorders: Effect of very high dose of methyprednisolone on the functional outcome, morphology and chemistry of experimental spinal cord impact injury. Can J Physiol Pharmacol, 1982,60:1414-1424
[2]Hall ED, Braughler JM. Effecs of intravenous methylprednisolone on spinal cord lipid peroxidation and (Na+-K+)-ATPase: Dose response analysis during 1st hour after contusion injury in the cat. J Neurosurg, 1982,57:247-253
, 百拇医药
[3]Smith SL, Andrus PK, Zhang JR, et al. Direct measurement of hydroxyl radicals, lipid peroxidation, and blood-brain barrier disruption following unilateral cortical impact head injury in the rat. J Neurotrauma, 1994,11:393-404
[4]Adams JH. Head Injury. In: Adams JH, Kuchen LW, eds. Greenfield's Neuropathology. 4th ed, London: Edward Arnol, 1992:100-109
[5]Blumberg PC, Jones NR, North JB. Diffuse axonal injury in head trauma. J Neurol Neurosurg Pyschiatry, 1989,52:838-841
, 百拇医药
[6]Marmarou A, Foda MAA, Brink W, et al. A new model of diffuse brain injury in rawts. Part Ⅰ,Ⅱ: Pathophysiology and biomechanics. J Neurosurg, 1994,80:291-313
[7]Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissue by thiobaritux acid reaction. Anal Biochem, 1979,95:351-358
[8]Gentleman SM, Nash AJ, Sweeting CJ, et al. β-amyloid precursor protein(β-APP) as a marker of axonal injury after head injury. Neurosci Lett, 1993,160:139-144
[9]Sheriff FE, Bridges LR, Sivaloganatham S. Early detection of axonal injury after human head trauma using immunocytochemistry for β-amyloid prcursor protein. Acta Neuropathol, 1994,87:55-62
收稿日期：1998-10-12, 百拇医药