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编号:10213934
慢性肾衰患者尿毒素对肠道细菌的作用
http://www.100md.com 《湖南医科大学学报》 1999年第2期
     作者:陈立平 蒋云生 罗季安

    单位:陈立平 附属湘雅医院肾内科 长沙 410008;蒋云生 罗季安 第二附属医院肾内科 长沙 410011

    关键词:肾功能衰竭;慢性;尿毒素;大肠杆菌;细菌变异*

    湖南医科大学学报990230 提 要 取慢性肾衰病人和健康人粪便行需氧培养,并分别将其肠道大肠杆菌接种于肾衰病人血清培养基中培养,测定培养前后培养基中尿素氮、肌酐、尿酸量以观察细菌对以上尿毒素的降解作用。结果显示,慢性肾衰患者肠道大肠杆菌能明显降解尿素氮、肌酐、尿酸。提示尿毒素能诱导大肠杆菌发生变异。

    Urotoxic effect to intestinal bacteria in patients with

    chronic renal failure
, 百拇医药
    Chen Liping

    (Department of Nephrology, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)

    Jiang Yunsheng Luo Jian

    (Department of Nephrology, The Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011)

    To analyse the differences of intestinal bacterial quality and quantity, the feces taken from chronic renal failure(CRF) and healthy subject were cultured aerobicly. Then the isolated E.coli from CRF patients and healthy subjects was inoculated respectively into cultural medium with CRF serum and incubated whose concentration of UN, Cr and UA in medium before and after incubation was measured to observe the bacteria degrade of the above-mentioned urotoxin. Result: the intesinal E. coli can apparently degrade UN, Cr and UA in CRF patients which suggests that urotoxin may induce E. coli variation.
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    Key words kidney failure,chronic; urotoxic; escherichia coli; variation

    1 对象与方法

    1.1 对象 38例慢性肾功能不全患者,为本院肾内科新入院已确诊的慢性肾功能不全病人,男26例,女12例,年龄17~67(平均40.91±15.67)岁。慢性肾功能不全的诊断及分期标准按第4版内科学及诊断学教材判定。30例健康人均为本院教职工,男16例,女14例,年龄7~63(平均31.27±10.72)岁。

    1.2 方法

    1.2.1 尿毒素的测定 取慢性肾衰患者静脉血,分别测定尿素氮(UN)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)浓度,同时嘱病人留24h尿,测定尿量及其肌酐浓度,计算肌酐清除率(Ccr)以确定所选病人肾衰程度。
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    1.2.2 两组肠道菌的培养 培养方法按文献[1]进行。具体操作:(1)分别无菌取受试者早晨大便,在电子天平上称取3份标本,每份50g,分装3支无菌试管,各用无菌生理盐水稀释成1∶5,1∶10,1∶20不同稀释度并混匀,作为细菌定量培养用。(2)用微量加样器分别取上述混匀液2μl涂布于血平皿培养基,置37℃培养箱中孵育24h观察结果。(3)数出每个平皿菌落数,取其平均值,计算出1g粪便中细菌含量。细菌鉴定按文献[1]进行。每克大便细菌数=平板上菌落数×稀释倍数×5×105

    1.2.3 肾衰病人肠道菌对自身毒物的分解测定 用无菌接种针分别取病人及健康人大肠杆菌菌落1个放入含慢性肾衰患者血清的培养基中(0.3ml血清+3ml肉汤培养基[1]),置37℃培养24h,测定培养前后培养基中的UN,Cr,UA浓度。

    1.3 统计学处理 实验数据用均数±标准差(±s)表示。两样本均数采用配对t检验;两分类变量用χ2检验;两变量间的依存关系采用相关分析;显著性检验水准取双侧P<0.05。
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    2 结果

    2.1 慢性肾衰病人及正常人肠道细菌的种类、数量 结果见表1。

    表1 病人组与健康组细菌数及种类比较(±s) 组别

    n

    细菌总数

    ×109.g-1

    大肠杆菌数

    ×109.g-1

, 百拇医药     链球菌数

    ×109.g-1

    细菌种类

    病人组

    35

    1.56±0.79

    1.36±0.66

    0.38±0.29

    5

    健康组

    30
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    0.28±0.26

    0.26±0.24

    0.21±0.15

    2

    与健康组比较:①P<0.05;②P<0.01

    2.2 氮质血症期与尿毒症期患者肠道细菌数的比较 结果见表2。

    表2 病人组不同时期肾功能的细菌数比较(±s) 分期

    n

    细菌总数

    ×109.g-1
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    大肠杆菌数

    ×109.g-1

    氮质血症期

    13

    1.03±0.58

    0.92±0.63

    尿毒症期

    22

    1.84±0.77

    1.59±0.54

    ①与尿毒症期比较P<0.01
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    2.3 肠道细菌数与血UN,G,UA及Ccr的关系 血UN和Cr与细菌总数呈正相关(r值分别为0.568和0.693,均P<0.01)。

    血UN和Cr与大肠杆菌数呈正相关(r值分别为0.574和0.790,均P<0.01)。

    Ccr与细菌总数 及链球菌数无相关性,与大肠杆菌数呈负相关 (r值为-0.446,P<0.05);链球菌数与血UN,Cr,USA不相关。

    2.4 两组肠道细菌对肾衰患者尿毒素的影响 结果见表3。

    表3 两组培养前后培养液中尿毒素浓度变化(±s) 组别

    n

    培养前
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    培养后

    UN(mmol.L-1)

    Cr(μmol.L-1)

    UA(μmol.L-1)

    UN(mmol.L-1)

    Cr(μmol.L-1)

    UA(μmol.L-1)
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    病人组

    35

    11.23±6.55

    610.78±378.39

    346.31±179.35

    9.37±5.22

    548.01±298.54

    268.59±170.82

    健康组

    30

    11.58±2.34
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    622.06±274.13

    267.91±79.39

    12.49±4.07

    595.81±276.13

    173.49±78.09

    培养后与培养前比较:①P<0.05;②P<0.01;③P<0.01;④P<0.05

    3 讨论

    以往研究表明慢性肾衰状态下肠道细菌呈过度生长[3],但过度生长的细菌种类及程度国内未见详细报道。本文观察到慢性肾衰病人肠道细菌除大肠杆菌和粪链球菌外,尚有变形杆菌、酵母菌、枯草杆菌;与国内健康人比较种类增多(P<0.01)[2]。其细菌总数及大肠杆菌数亦有显著差异。病人细菌总数及大肠杆菌数与血尿素氮、肌酐浓度成正相关,说明随着血尿素氮、肌酐浓度升高,肠道细菌数增多;同时慢性肾衰不同阶段的肠道细菌数目及种类均有差异,尿毒症期与氮质血症期比较,前者细菌总数及大肠杆菌数均增高,且检出的粪链球菌91.7%为尿毒症期病人,进一步提示随着肾功能损害程度加重,肠道细菌数量及种类逐渐增多。
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    慢性肾衰时,肠道细菌增多的原因不清楚。可能的原因:①肾功能不全时,肠腔尿素氮、肌酐浓度随着血尿素氮、肌酐浓度的升高而增多,高浓度的尿素氮、肌酐导致菌群失调。②肾衰时肠道替代肾脏成为最大的蛋白质代谢器官[4],经肠道排出的其它非蛋白氮化合物如氨、胺、胍类衍生物,尿酸等增多为细菌的生长繁殖提供了足够的营养和生成条件从而诱导细菌生长。③慢性肾衰时,人体免疫功能降低或受损,细菌过度繁殖。研究证明,经同位素照射过的小鼠,其肠道内分泌性免疫球蛋白IgA的分泌量下降,细菌大量繁殖[5]。④饮食,有报道素食期间粪便大肠杆菌数量增加[5],所以尿毒症饮食可能使肠道大肠杆菌增多。

    已有发现多种土壤细菌如梭状芽胞杆菌、克雷伯杆菌及铜绿假单孢菌能分解尿素氮、肌酐[6,9],并用被导入了克雷伯杆菌尿素酶基因的大肠杆菌遗传工程细胞治疗氮质血症鼠获得满意疗效[8],但人体肠道正常菌群对尿毒素的作用未见报道。本文观察正常人肠道大肠杆菌加入慢性肾衰病人血清培养基中结果显示培养后尿素氮、肌酐浓度无明显降低;病人肠道大肠杆菌加入其血清培养基中培养后尿素氮、肌酐浓度明显降低。提示慢性肾衰病人肠道大肠杆菌能降解尿素氮、肌酐;而正常人大肠杆菌则无此降解能力。推测慢性肾功能不全时,肠道大肠杆菌出现变异能产生酶分解尿素氮、肌酐。
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    现代细菌学认为细菌变异包括形态、结构、抗原性、酶的分泌变异。其中以酶的变异为主。如大肠杆菌能分泌β-半乳糖苷酶,是因其生长环境所致。在培养基中加入乳糖,大肠杆菌就产生β-半乳糖苷酶;当培养基中无乳糖存在时其培养基中不存在β-半乳糖苷酶;这种变异并非细菌基因变异,是由于特定环境下表型的改变,称非遗传变异[1]。这些大肠杆菌酶变异的理论与本文结果显示有相似之处。大肠杆菌与代谢有关的酶种类很多,这些酶的产生与否与外环境有关,即当环境中某些有机物或无机物成为它的营养物质时就分泌相应的酶。慢性肾衰状态下,大肠杆菌为了适应肠道环境改变,将肠道尿素氮、肌酐作为生长繁殖的营养物质。同时这种环境也诱导大肠杆菌产生一系列变异,最终产生酶降解尿素氮和肌酐。

    尿酸是尿毒素的重要成份之一,以往文献报道用废物材料中某些细菌降解尿酸治疗尿酸增高性疾病[7]。而大肠杆菌对尿酸的作用未见报道。本文实验结果同时显示健康人和病人肠道大肠杆菌培养后尿酸浓度明显降低,提示健康人和肾衰病人肠道大肠杆菌均具有分解尿酸的酶。大肠杆菌的这种特性可能为遗传所致。
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    综上所述,尿毒素环境诱导下的细菌酶变异,在肾衰治疗中有重要价值。Kieulstrand等用尿素酶加氨的吸附剂磷酸锆置入微胶囊治疗慢性肾衰取得一定疗效,是因为其中尿素酶能降解尿素,所以称之为“可吞咽的人工肾”[8]。国内也有相应的报道,体外诱导谷氨酸棒状杆菌产尿素酶制成微胶囊治疗慢性肾衰后血尿素氮、肌酐有不同程度的下降[9]。但作为肠道正常菌丛的大肠杆菌产尿毒素酶尚属首次报道。如将其作体外培养,诱导产生尿毒素分解酶后,制成微胶囊或人工细胞口服,将从肠道清除更多的毒素。本研究为从胃肠道清除尿毒素及“人工细胞”的制备,探索新的肾功能替代治疗提供了有力的实验依据。

    中国图书分类号 R692.5

    参考文献

    [1]李影林主编.临床微生物及检验.第一版,吉林:科学技术出版社出版,1991:540-547
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    [2]郁庆福主编.现代卫生微生物学.第一版,北京:人民卫生出版社出版,1995:67-68

    [3]Mitch WE. Effects of intestinal flora on nitrogen metabo lism in patients with chronic renal failure. The Am J Clin Nutr, 1978,31:1594-1600

    [4]Setala K. Bacterial enzymes in uremia management. Kidney Int, 1978,13:S194-202

    [5]陈玉龙,王耀芝主编.消化系统疾病诊断治疗新进展.第1版,北京:科学技术文献出版社,1995:39-50

    [6]Setala K. The promise of enzymes in therapy of uremia. Nephron, 1984,37:7-11

    [7]Rouf MA. Degradation of uric acid by certain aerobic bacteria. J Bact, 1968:617:622

    [8]Friedman EA. Bewel as a kidney substitute in renal failure. Am J Kidney Dis, 1996,28(6):943-950

    [9]张庆怡等.多种细菌酶治疗尿毒症的临床观察.中华肾脏病杂志,1995,11(3):130-132

    收稿日期:1998-12-29, 百拇医药