聚合酶链反应检测细菌16S rRNA基因
作者：李聪智 谭德明 鲁猛厚 吴 英 周文红 刘国珍 刘安国
单位：附属湘雅医院传染科 长沙 410008
关键词：聚合酶链反应；细菌；核糖核酸；核糖体；16S；基因
湖南医科大学学报990214 提 要 根据细菌16S rRNA基因的高度保守性，设计合成所有细菌、革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌的共同引物，采用聚合酶链反应检测已知细菌13株，三对引物分别扩增的阳性率为100%，倍比稀释法能检出细菌的最低浓度为4?!CFU.ml-1，同时检测临床样本40份，阳性率为67.5%(27/40)，同期细菌培养阳性率为45%(18/40)，二者比较差异有显著性(P<0.05)。结果提示聚合酶链反应检测细菌16S rRNA基因具有高度的特异性和敏感性。
, 百拇医药 PCR for the detection of 16S rRNA gene bacteria
Li Congzhi Tan Deming Lu Menghou Wu Ying Zhou Wenhong Liu Guozhen Liu Anguo
(Department of Infection, Xianya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
According to the high conservative region of 16S rRNA gene in bacteria, PCR primers of the broad-range bacteria, gram-positive bacteria and gram-negative bacteria were synthesized to detect 13 bacterium species and (40) clinical specimens. All the tested bacterium species were positive. The lowest concentration of Escheria Coli detected by serial dilution was 4?!CFU*ml-1. The positive rate of PCR(27/40) was higher than that of bacterium culture(18/40). The results indicate that these PCR primers possess high specificity and sensitivity in identifying 16S rRNA gene of bacteria.
, 百拇医药
Key words PCR; RNA,ribosomal,16S; genes; bacteria
目前对细菌感染病原诊断的主要方法为细菌培养，虽然特异性高，但存在费时及阳性率低的缺点[1]，影响早期诊断及抗菌素的及时有效使用，细菌16S rRNA基因具有高度保守性，不同科、种、属间的细菌16S rRNA基因同源性达97%以上[2]，根据这一特性，设计合成所有细菌、革兰氏阴性细菌及革兰氏阳性细菌三对引物用于聚合酶链反应，检测已知细菌13株及临床样本40份，旨在探索细菌感染病原诊断更为敏感和有效的方法，其结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 引物 分别选择所有细菌、革兰氏阴性细菌及革兰氏阳性细菌的16S设计合成三对共同引物。引物由上海细胞生物学研究所癌基因室合成，其序列见表1。
, 百拇医药
1.1.2 菌株及临床样本 检测细菌13株，其中革兰氏阴性细菌9株，包括大肠杆菌2株，不动杆菌、变形杆菌、克雷伯氏杆菌、福氏痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒甲杆菌、绿脓杆菌各1株；革兰氏阳性菌4株，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌。收集临床样本40份，其中尿液32份，腹水7份，心包液1份。细菌由我院交叉感染科及湖南医科大学微生物教研室提供。
表1 三对引物核苷酸序列 引物
序列
位置
所有细菌
顺义
5′-AACTGGAGGAAG
GTGGGGA-3′
, 百拇医药
1170～1189
反义
5′-AGGAGGTGATC
CAACCGCA-3′
1522～1540
革兰氏阴性细菌
顺义
5′-GCATCAGGT
CAAGTCATC-3′
1167～1181
反义
5′-CCCGGCTTCGTAT
, 百拇医药
TCACC-3′
1351～1369
革兰氏阳性细菌
顺义
5′-GCATCAGGT
CAAGTCATC-3′
1167～1181
反义
5′-GGCTTCTGCTGTTA
CAAA-3′
1401～1419
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 细菌DNA提取 挑取菌落于100μl无菌亚沸水中混匀，反复冻融3次，加200μl裂解液(0.1% SDS，20mm EDTA,150mm NaCl,50mm Tris.HCl pH8.0及溶菌酶100μg)，37℃ 30min，加蛋白酶K 40μg，37℃ 30min，95℃ 5min，加等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，15000r.min-1离心10min，取上清加入2倍体积无水乙醇，1/10体积3mol醋酸钠，15μl tRNA(2mg.ml-1)，RNA酶100μg，混匀后置-20℃ 2?!h，置4℃ 15?!000?!r.min-1离心20min，沉淀用70%，冷乙醇洗一次，去掉上清，沉淀物干燥后用20μl无菌亚沸水溶解备用。
, 百拇医药
1.2.2 DNA扩增及产物分析 取上述DNA液10μl加PCR混合液(10×PCR缓冲液5μl,10mm dNTP 1μl，Taq DNA聚合酶5U，sense引物和antisense引物各25pmol)，加无菌亚沸水至总体积为50μl，混匀后加无菌石蜡油2滴，置PCR扩增仪按94℃ 30s，55℃ 60s,72℃ 60s,循环30次，最后置72℃ 7min完成扩增。取PCR产物9μl于2.5%琼脂糖电泳，紫外灯下观察结果。革兰氏阳性细菌扩增产物片段为202碱基，革兰氏阴性细菌扩增产物片段为252碱基，细菌共同引物扩增产物370碱基。
1.2.3 临床样本的检测 取样本2000?!r.min-1离心10min，用100μl无菌亚沸水溶解沉淀物，反复冻融3次，DNA的提取及扩增同1.2.1和1.2.2的步骤。
1.2.4 敏感性检测 按倍比稀释法将大肠杆菌悬液依次稀释成102，103，104，105，106，107，108及109，取上述细菌悬液500μl倒入营养琼脂培养皿中培养过夜。计算各稀释度菌落数，分别对上述各种稀释度的细菌悬液进行PCR扩增(附图)。
, 百拇医药
附图 倍比稀释法检测大肠杆菌 M. PGE-3ZF(+)
HaeⅢMarker；1～3，5～9. 稀释倍数为102～9；4. 阴性对照
Fig. Escheria Coli detected by serial dilution M. PGE-3ZF(+) HaeⅢMarker; Lane 1～3, 5～9. 102～9 of dilute multiple; Lane 4. Negative control
1.2.5 细菌培养 所收集的临床样本同时送我院细菌室培养，结果与PCR结果进行比较。
1.3 统计学处理 数据采用χ2检验。
2 结果
, 百拇医药
2.1 三对引物扩增结果 使用共同引物扩增已知细菌13株，结果均获阳性；使用革兰氏阴性细菌引物扩增该类细菌9株，结果阳性，而扩增阳性细菌则结果为阴性；革兰氏阳性细菌引物扩增该类细菌4株，亦获阳性结果，反之扩增阴性细菌则结果为阴性(表2)。
表2 细菌16S rRNA基因PCR检测结果 细菌
PCR结果
共同引物
阳性细菌引物
阴性细菌引物
大肠杆菌
+
-
+
, http://www.100md.com
不动杆菌
+
-
+
变形杆菌
+
-
+
克雷伯杆菌
+
-
+
福氏痢疾杆菌
+
, 百拇医药
-
+
伤寒杆菌
+
-
+
副伤寒杆菌
+
-
+
绿脓杆菌
+
-
+
, http://www.100md.com
金黄色葡萄球菌
+
+
-
表皮葡萄球菌
+
+
-
炭疽杆菌
+
+
-
白喉杆菌
+
, 百拇医药
+
-
2.2 临床样本PCR检测结果 32份尿液中使用共同引物检测的阳性率为68.7%(22/32)，阳性细菌引物检测的阳性率为15.6%(5/32)，阴性细菌引物检测阳性率为53.1%(17/32)。7份腹水中使用共同引物检测的阳性率为57.1%(4/7)，阳性细菌引物检测的阳性率为0，阴性细菌检测的阳性率为42.8%(3/7)。1例心包液检测结果为革兰氏阳性细菌(表3)。表3 临床样本PCR检测与细菌培养的结果 样本
份 数
共同引物
PCR阳性数①
阳性菌引物
PCR阳性数
, 百拇医药
阴性菌引物
PCR阳性数
细菌培养
阳性数
尿 液
32
22
5
17
15
腹 水
7
4
, 百拇医药 0
3
3
心包液
1
1
1
0
0
合 计
40
27
6
20
, 百拇医药
18
①与细菌培养阳性数比较：P<0.05
2.3 细菌培养 40份临床样本同时进行培养，检出大肠杆菌10株，不动杆菌1株、变形杆菌1株、表皮葡萄球菌2株、肠球菌3株及脆弱类杆菌1株。细菌培养与PCR检测的结果比较差异有显著性(表3)。
2.4 PCR检测细菌的敏感性 对各稀释度大肠杆菌悬液扩增，在107时结果仍为阳性，此稀释度计算细菌数为4CFU.ml-1。
3 讨论
细菌感染目前主要的诊断方法为细菌培养，但由于费时及阳性率低，使其在临床诊断应用上受到一定限制[3]。近来基因诊断技术在临床上应用日趋广泛，其中以敏感性高且快速的聚合酶链反应最为常用[4]。据报道该法检测细菌最低浓度为0.3CFU.ml-1[5]，而细菌培养最低细菌数为105.ml-1[3]，但PCR一般仅对单种细菌进行有目的的扩增，而在病原菌未明的情况下，难以做到逐一检测。细菌16S rRNA基因核苷酸序列具有高度保守性，其核苷酸片段长度适宜[2]，但它的保守性又是相对的，在保守区之间存在9～10个变异区[2]，不同科、种、属间都具有一定的变异，基于这一特性，笔者选择细菌16S rRNA基因保存区设计合成其共同引物，用于对所有细菌进行检测，选择细菌16S rRNA基因变异区合成其特异性引物，分别对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌进行检测。本文结果显示，使用共同引物扩增所有细菌可获得大小约370碱基的特异性片段，革兰氏阴性细菌引物扩增该类细菌可获得大小约202碱基的特异性片段，革兰氏阳性细菌引物扩增该类细菌可获得大小约252碱基的特异性片段。PCR对已知细菌扩增其阳性率为100%，而阳性细菌和阴性细菌引物分别对阴性细菌和阳性细菌扩增为阴性，PCR检测临床样本阳性率为67.5%(27/40)。在腹水检测中，共同引物扩增4例为阳性，其中1例分别用阳性细菌和阴性细菌引物扩增结果为阴性，由于厌氧菌之间基因变异较大，难以合成其共同引物，故临床上共同引物PCR结果阳性而阳性菌和阴性菌PCR结果阴性时，临床上应考虑有厌氧菌感染的可能。通过倍比稀释法PCR检出细菌最低浓度为4?!CFU*ml-1，较报道的细菌培养敏感性为高[3]，PCR检测细菌阳性率亦明显高于细菌培养，说明三对引物具有特异性及敏感性高的优点，能初步达到鉴定细菌种属的目的，可为临床诊断及选用合适的抗生素提供一些帮助。
, 百拇医药
中国图书分类号 R446.5
参考文献
[1]Bingen EN, Lambert-Zechovske P, Mariani-kurkdjiav C, et al. Bacterial counts in cerebrospinal fluid of with meningitis. J Clin Microbiol Infect Dis, 1990,9(1):278-281
[2]Jonas D, Rosenbaum A, Weyrich S, et al. Enzyme-linked immunoassay for detection of PCR-amplified DNA of legionellae in bronchoaveolar fluid. J Clin Microbiol, 1995,33(5):1247-1257
, http://www.100md.com
[3]Leonard J, Lascolea JR, Dryia D. Quatitation of bacteria in cerebrospinal fluid and blood of children with meningitis and its diagnostic significance. J Clin Microbiol, 1984,19(2):187-190
[4]Teng K, LI M, Yu W, et al. Comparison of PCR with culture for detection of ureaplasma urealyticum in clinical samples from patients with urogenited infections. J Clin Microbiol, 1994,32(9):2232-2234
[5]Yamamaoto H, Hashimoto Y, Ezaki I. Comparison of detection methods for legionella species in environmental water by colony isolation fluorescent antibody staining and polymerase chain reaction. Microbiol Immunol, 1993,37(2):617-622
收稿日期：1998-07-15, 百拇医药
单位：附属湘雅医院传染科 长沙 410008
关键词：聚合酶链反应；细菌；核糖核酸；核糖体；16S；基因
湖南医科大学学报990214 提 要 根据细菌16S rRNA基因的高度保守性，设计合成所有细菌、革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌的共同引物，采用聚合酶链反应检测已知细菌13株，三对引物分别扩增的阳性率为100%，倍比稀释法能检出细菌的最低浓度为4?!CFU.ml-1，同时检测临床样本40份，阳性率为67.5%(27/40)，同期细菌培养阳性率为45%(18/40)，二者比较差异有显著性(P<0.05)。结果提示聚合酶链反应检测细菌16S rRNA基因具有高度的特异性和敏感性。
, 百拇医药 PCR for the detection of 16S rRNA gene bacteria
Li Congzhi Tan Deming Lu Menghou Wu Ying Zhou Wenhong Liu Guozhen Liu Anguo
(Department of Infection, Xianya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
According to the high conservative region of 16S rRNA gene in bacteria, PCR primers of the broad-range bacteria, gram-positive bacteria and gram-negative bacteria were synthesized to detect 13 bacterium species and (40) clinical specimens. All the tested bacterium species were positive. The lowest concentration of Escheria Coli detected by serial dilution was 4?!CFU*ml-1. The positive rate of PCR(27/40) was higher than that of bacterium culture(18/40). The results indicate that these PCR primers possess high specificity and sensitivity in identifying 16S rRNA gene of bacteria.
, 百拇医药
Key words PCR; RNA,ribosomal,16S; genes; bacteria
目前对细菌感染病原诊断的主要方法为细菌培养，虽然特异性高，但存在费时及阳性率低的缺点[1]，影响早期诊断及抗菌素的及时有效使用，细菌16S rRNA基因具有高度保守性，不同科、种、属间的细菌16S rRNA基因同源性达97%以上[2]，根据这一特性，设计合成所有细菌、革兰氏阴性细菌及革兰氏阳性细菌三对引物用于聚合酶链反应，检测已知细菌13株及临床样本40份，旨在探索细菌感染病原诊断更为敏感和有效的方法，其结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 引物 分别选择所有细菌、革兰氏阴性细菌及革兰氏阳性细菌的16S设计合成三对共同引物。引物由上海细胞生物学研究所癌基因室合成，其序列见表1。
, 百拇医药
1.1.2 菌株及临床样本 检测细菌13株，其中革兰氏阴性细菌9株，包括大肠杆菌2株，不动杆菌、变形杆菌、克雷伯氏杆菌、福氏痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒甲杆菌、绿脓杆菌各1株；革兰氏阳性菌4株，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌。收集临床样本40份，其中尿液32份，腹水7份，心包液1份。细菌由我院交叉感染科及湖南医科大学微生物教研室提供。
表1 三对引物核苷酸序列 引物
序列
位置
所有细菌
顺义
5′-AACTGGAGGAAG
GTGGGGA-3′
, 百拇医药
1170～1189
反义
5′-AGGAGGTGATC
CAACCGCA-3′
1522～1540
革兰氏阴性细菌
顺义
5′-GCATCAGGT
CAAGTCATC-3′
1167～1181
反义
5′-CCCGGCTTCGTAT
, 百拇医药
TCACC-3′
1351～1369
革兰氏阳性细菌
顺义
5′-GCATCAGGT
CAAGTCATC-3′
1167～1181
反义
5′-GGCTTCTGCTGTTA
CAAA-3′
1401～1419
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 细菌DNA提取 挑取菌落于100μl无菌亚沸水中混匀，反复冻融3次，加200μl裂解液(0.1% SDS，20mm EDTA,150mm NaCl,50mm Tris.HCl pH8.0及溶菌酶100μg)，37℃ 30min，加蛋白酶K 40μg，37℃ 30min，95℃ 5min，加等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，15000r.min-1离心10min，取上清加入2倍体积无水乙醇，1/10体积3mol醋酸钠，15μl tRNA(2mg.ml-1)，RNA酶100μg，混匀后置-20℃ 2?!h，置4℃ 15?!000?!r.min-1离心20min，沉淀用70%，冷乙醇洗一次，去掉上清，沉淀物干燥后用20μl无菌亚沸水溶解备用。
, 百拇医药
1.2.2 DNA扩增及产物分析 取上述DNA液10μl加PCR混合液(10×PCR缓冲液5μl,10mm dNTP 1μl，Taq DNA聚合酶5U，sense引物和antisense引物各25pmol)，加无菌亚沸水至总体积为50μl，混匀后加无菌石蜡油2滴，置PCR扩增仪按94℃ 30s，55℃ 60s,72℃ 60s,循环30次，最后置72℃ 7min完成扩增。取PCR产物9μl于2.5%琼脂糖电泳，紫外灯下观察结果。革兰氏阳性细菌扩增产物片段为202碱基，革兰氏阴性细菌扩增产物片段为252碱基，细菌共同引物扩增产物370碱基。
1.2.3 临床样本的检测 取样本2000?!r.min-1离心10min，用100μl无菌亚沸水溶解沉淀物，反复冻融3次，DNA的提取及扩增同1.2.1和1.2.2的步骤。
1.2.4 敏感性检测 按倍比稀释法将大肠杆菌悬液依次稀释成102，103，104，105，106，107，108及109，取上述细菌悬液500μl倒入营养琼脂培养皿中培养过夜。计算各稀释度菌落数，分别对上述各种稀释度的细菌悬液进行PCR扩增(附图)。
, 百拇医药
附图 倍比稀释法检测大肠杆菌 M. PGE-3ZF(+)
HaeⅢMarker；1～3，5～9. 稀释倍数为102～9；4. 阴性对照
Fig. Escheria Coli detected by serial dilution M. PGE-3ZF(+) HaeⅢMarker; Lane 1～3, 5～9. 102～9 of dilute multiple; Lane 4. Negative control
1.2.5 细菌培养 所收集的临床样本同时送我院细菌室培养，结果与PCR结果进行比较。
1.3 统计学处理 数据采用χ2检验。
2 结果
, 百拇医药
2.1 三对引物扩增结果 使用共同引物扩增已知细菌13株，结果均获阳性；使用革兰氏阴性细菌引物扩增该类细菌9株，结果阳性，而扩增阳性细菌则结果为阴性；革兰氏阳性细菌引物扩增该类细菌4株，亦获阳性结果，反之扩增阴性细菌则结果为阴性(表2)。
表2 细菌16S rRNA基因PCR检测结果 细菌
PCR结果
共同引物
阳性细菌引物
阴性细菌引物
大肠杆菌
+
-
+
, http://www.100md.com
不动杆菌
+
-
+
变形杆菌
+
-
+
克雷伯杆菌
+
-
+
福氏痢疾杆菌
+
, 百拇医药
-
+
伤寒杆菌
+
-
+
副伤寒杆菌
+
-
+
绿脓杆菌
+
-
+
, http://www.100md.com
金黄色葡萄球菌
+
+
-
表皮葡萄球菌
+
+
-
炭疽杆菌
+
+
-
白喉杆菌
+
, 百拇医药
+
-
2.2 临床样本PCR检测结果 32份尿液中使用共同引物检测的阳性率为68.7%(22/32)，阳性细菌引物检测的阳性率为15.6%(5/32)，阴性细菌引物检测阳性率为53.1%(17/32)。7份腹水中使用共同引物检测的阳性率为57.1%(4/7)，阳性细菌引物检测的阳性率为0，阴性细菌检测的阳性率为42.8%(3/7)。1例心包液检测结果为革兰氏阳性细菌(表3)。表3 临床样本PCR检测与细菌培养的结果 样本
份 数
共同引物
PCR阳性数①
阳性菌引物
PCR阳性数
, 百拇医药
阴性菌引物
PCR阳性数
细菌培养
阳性数
尿 液
32
22
5
17
15
腹 水
7
4
, 百拇医药 0
3
3
心包液
1
1
1
0
0
合 计
40
27
6
20
, 百拇医药
18
①与细菌培养阳性数比较：P<0.05
2.3 细菌培养 40份临床样本同时进行培养，检出大肠杆菌10株，不动杆菌1株、变形杆菌1株、表皮葡萄球菌2株、肠球菌3株及脆弱类杆菌1株。细菌培养与PCR检测的结果比较差异有显著性(表3)。
2.4 PCR检测细菌的敏感性 对各稀释度大肠杆菌悬液扩增，在107时结果仍为阳性，此稀释度计算细菌数为4CFU.ml-1。
3 讨论
细菌感染目前主要的诊断方法为细菌培养，但由于费时及阳性率低，使其在临床诊断应用上受到一定限制[3]。近来基因诊断技术在临床上应用日趋广泛，其中以敏感性高且快速的聚合酶链反应最为常用[4]。据报道该法检测细菌最低浓度为0.3CFU.ml-1[5]，而细菌培养最低细菌数为105.ml-1[3]，但PCR一般仅对单种细菌进行有目的的扩增，而在病原菌未明的情况下，难以做到逐一检测。细菌16S rRNA基因核苷酸序列具有高度保守性，其核苷酸片段长度适宜[2]，但它的保守性又是相对的，在保守区之间存在9～10个变异区[2]，不同科、种、属间都具有一定的变异，基于这一特性，笔者选择细菌16S rRNA基因保存区设计合成其共同引物，用于对所有细菌进行检测，选择细菌16S rRNA基因变异区合成其特异性引物，分别对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌进行检测。本文结果显示，使用共同引物扩增所有细菌可获得大小约370碱基的特异性片段，革兰氏阴性细菌引物扩增该类细菌可获得大小约202碱基的特异性片段，革兰氏阳性细菌引物扩增该类细菌可获得大小约252碱基的特异性片段。PCR对已知细菌扩增其阳性率为100%，而阳性细菌和阴性细菌引物分别对阴性细菌和阳性细菌扩增为阴性，PCR检测临床样本阳性率为67.5%(27/40)。在腹水检测中，共同引物扩增4例为阳性，其中1例分别用阳性细菌和阴性细菌引物扩增结果为阴性，由于厌氧菌之间基因变异较大，难以合成其共同引物，故临床上共同引物PCR结果阳性而阳性菌和阴性菌PCR结果阴性时，临床上应考虑有厌氧菌感染的可能。通过倍比稀释法PCR检出细菌最低浓度为4?!CFU*ml-1，较报道的细菌培养敏感性为高[3]，PCR检测细菌阳性率亦明显高于细菌培养，说明三对引物具有特异性及敏感性高的优点，能初步达到鉴定细菌种属的目的，可为临床诊断及选用合适的抗生素提供一些帮助。
, 百拇医药
中国图书分类号 R446.5
参考文献
[1]Bingen EN, Lambert-Zechovske P, Mariani-kurkdjiav C, et al. Bacterial counts in cerebrospinal fluid of with meningitis. J Clin Microbiol Infect Dis, 1990,9(1):278-281
[2]Jonas D, Rosenbaum A, Weyrich S, et al. Enzyme-linked immunoassay for detection of PCR-amplified DNA of legionellae in bronchoaveolar fluid. J Clin Microbiol, 1995,33(5):1247-1257
, http://www.100md.com
[3]Leonard J, Lascolea JR, Dryia D. Quatitation of bacteria in cerebrospinal fluid and blood of children with meningitis and its diagnostic significance. J Clin Microbiol, 1984,19(2):187-190
[4]Teng K, LI M, Yu W, et al. Comparison of PCR with culture for detection of ureaplasma urealyticum in clinical samples from patients with urogenited infections. J Clin Microbiol, 1994,32(9):2232-2234
[5]Yamamaoto H, Hashimoto Y, Ezaki I. Comparison of detection methods for legionella species in environmental water by colony isolation fluorescent antibody staining and polymerase chain reaction. Microbiol Immunol, 1993,37(2):617-622
收稿日期：1998-07-15, 百拇医药