抗生素耐药性的起源和分子基础
作者：
单位：
关键词：
英国医学杂志中文版990224The origins and molecular basis of antibiotic resistance
Peter M Hawkey
我们常说细菌对抗生素耐药，但是我们很少考虑这意味着什么。即使最耐药的细菌也能被浓度足够高的抗生素所抑制或杀死，但是一些患者不能耐受所需要的高浓度。对于某一种抗生素的耐受性，不同菌种之间的差别很大。例如，在英国，肺炎链球菌的大部分菌株能被0.01mg/L的苄基青霉素(最低抑制浓度)抑制，但是需要32～64mg/L才能抑制大肠杆菌的生长，这是一个不能在人体内达到的水平。这种情况引出了临床耐药性(clinical resistance)的概念，它取决于治疗结果，但常常被忽视。临床耐药性是一个复杂的概念，其中包括感染细菌的类型及其在人体中的位置、人体中抗生素的分布和在感染病灶中的浓度，以及与之相互作用的患者免疫状态。
, 百拇医药
细菌耐药的机制
细菌能够使自己免于抗生素的损害，其机制有多种，被分为4个基本类型(图1)。最为人们所知的是抗生素修饰：耐药细菌保持自己对于抗生素的敏感性，但是阻止抗生素发生作用。例如，可以通过β内酰胺酶实现这一作用——β内酰胺酶切断4个β内酰胺环成分使抗生素失活。已经被报道过的β内酰胺酶超过200种(附表)。大多数β内酰胺酶对青霉素和头孢菌素都有不同程度的拮抗作用；其余的则更具有特异性—— 分别命名为头孢菌素酶(例如在肠杆菌属中发现的AmpC 酶) 或青霉素酶(例如金黄色葡萄球菌中的青霉素酶)。β内酰胺酶在许多种细菌(包括革兰阳性和革兰阴性)中广泛存在，并且能被β内酰胺酶抑制剂不同程度地抑制，例如棒酸1。
一些耐药细菌阻止抗生素进入细胞或者将抗生素快速泵出，其泵出速度比流入速度更快(如同船里的抽水泵)，以保护抗生素作用的靶部位。对革兰阴性细菌中的β内酰胺抗生素类是通过一种膜蛋白而进入细胞的,这种蛋白质是由水填充的、中空的，称之为膜孔蛋白(图2)。抗亚胺培南的绿脓杆菌，因缺乏特异性D2膜孔蛋白而具有耐药性，致使亚胺培南不能穿透细胞。这个机制同样适用于氟喹诺酮类抗生素和氨基糖甙类抗生素，只是拮抗水平较低。通过耗能的转移泵增加外流量被认为是抗四环素的机制，很多相关基因能编码这种转移泵，比如分布在肠杆菌科中的tet(A)2。 本文要点
, 百拇医药
应该用临床结果定义对抗生素耐药，而不是用实验室方法
耐药性通过4种主要机制而产生——在一个单个细胞中可
以存在不仅一种机制
耐药机制的进化可能来自于产生抗生素的微生物基因
耐药基因不仅存在于致病菌，也存在于共生细菌，而且在
食物、环境和动物中都可以发现它们，我们始终在它们的
包围之中
抗生素耐药基因的演化和重新组合涉及多种遗传机制，它
可使有用基因迅速传播
必须采取措施减慢抗生素耐药基因的演化和传播的速度，其中最主要的单一因素是在人类医疗实践和农业生产中使
, 百拇医药
用抗生素的量
抗生素作用的首要部位发生改变可能表明抗生素穿透了细胞并到达作用部位，但是因为作用部位的分子结构改变而不能抑制其活性。肠球菌被认为对头孢菌素具有先天的耐药性，是因为负责细胞壁合成的酶(肽聚糖多聚体的产物)——已知它是青霉素结合蛋白——与β内酰胺的亲和性低所以不被抑制。肺炎链球菌的大部分菌株对于青霉素和头孢菌素都有很高的易感性，但是它们能从其它细菌中获得DNA，这些DNA改变了酶，从而使它们与青霉素的亲和力降低，由此抵抗了青霉素的抑制作用3。虽然被改变的酶仍然合成肽聚糖，但是它的结构不同4。我们能从实验室中挑选出抗青霉素的化脓链球菌突变株，它们表达已经改变了的青霉素结合蛋白，但在病人身上还未见到，这可能是因为细胞壁不再结合抗吞噬细胞的(anti-phagocytic)M蛋白。
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图1 抗生素耐药的4种主要生化机制
革兰阳性细菌
革兰阴性细菌
图2 β内酰胺酶抗生素类与革兰阳性和革兰阴性细菌的相互作用
细菌可以保护自己免受抗生素作用的最后一种机制是产生能抵抗抗生素抑制作用的替代性靶蛋白(通常是一种酶)，同时继续产生原来的易感性靶蛋白。这种机制使得细菌通过选择得以幸存：替代性酶使抗生素的作用绕道而过。 说明这种机制的最好例子可能是替代青霉素结合蛋白(alternative penicillin binding protein, PBP2a)，它是由对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)额外产生，除此之外还产生正常的青霉素结合蛋白。MRSA由mecA基因编码，并且因为PBP2a不被抗生素抑制，比如氟氯西林，细胞可继续合成肽聚糖，因而拥有结构完好的细胞壁5。1987年，抗万古霉素肠球菌的出现引起人们极大关注，因其相关的基因能被转入金黄色葡萄球菌。这样，从理论上讲能导致抗万古霉素的MRSA。这种机制也能代表另一些替代性靶蛋白的耐药机制6。在对万古霉素易感的肠球菌中，万古霉素的常规作用部位是一种细胞壁前体，它包含了一种具有一个D-丙胺酸-D-丙胺酸末端的五肽，万古霉素结合在这个部位，可阻止细胞壁的进一步合成。但是假如一个肠球菌获得了vanA基因簇，它能造出一个含D-丙胺酸-D-乳酸的替代性细胞壁前体，使万古霉素不能与其结合。
, 百拇医药
耐药基因的分子流行病学
细菌的耐药性可以是本身固有的，也可以是获得性的。固有的耐药性是一个自然发生的生物学特性，例如，大肠杆菌对万古霉素耐药。当一个对抗生素敏感的细菌逐渐产生了耐药性，我们称之为获得性耐药，这可以通过突变而产生，也可以通过获得新的DNA而产生。
突变是一个自发性事件，无论抗生素是否存在。由于敏感细菌很快被抗生素杀死，因而一个携带突变的细菌具有巨大的优势，留下了耐药的亚群。1959年人们认识到耐药性是可以转移的，当时，在志贺菌中发现的耐药性基因通过质粒转移给了大肠杆菌。质粒是自我复制的环状DNA片段，小于细菌的基因组，能通过复制编码进入菌株或另一种细菌。它们能携带并转移多种耐药基因，这些基因可以位于一个DNA片段，此片段能从一个质粒转移至另一个质粒或转移至基因组——称为转座子(transposon)或称为“跳跃基因”。因为质粒能传播的细菌范围常常有限，所以转座子在细菌之间传播耐药性基因方面是重要的。在MRSA中发现的mec A基因可以通过转座作用而被获得7。质粒的演变很复杂，但是现代分子技术能够解开这个谜(例如包含tet M基因的质粒，在全世界的淋球菌中均能被找到)8。
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噬菌体(感染细菌的病毒)也能转移耐药性，这在葡萄球菌中常见。当细菌死亡时释放DNA，这些DNA能被感受态细菌摄取——这一过程被称为转化(transformation)。这个过程在环境当中越来越重要, 并且可能是青霉素耐药性在肺炎链球菌中传播的主要途径，此过程产生了“镶嵌青霉素结合蛋白基因”(mosaic penicillin binding protein genes)3。
耐药基因的起源
抗生素耐药基因的起源尚不清楚，因为当开始使用抗生素时，耐药的生化和分子基础还没被人们认识。后来发现，在1914年～1950期间收集的细菌(the Murray collection)对抗生素完全敏感。但是它们的确包含了一系列能共同传递的质粒9。尽管Murray菌株从本世纪30年代中期就被引入，但是它们当中没有一种对磺胺耐药；而有人在40年代早期报道了链球菌和淋球菌中的耐药性10。靶基因突变使耐药性附表 β内酰胺酶主要族的简单功能分类(由Bush等人建议)迅速发展，使链霉素治疗结核失败。现在认为突变是造成结核杆菌耐药的最常见机制，它使细菌对大多数抗结核药产生耐药，并且现在已经弄清楚了这种突变的分子本质11。细菌产生的突变能传递，其途径是通过插入序列、转座子进入质粒并由此转移至不同的菌种中。
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族
分子类型
作用底物
代表性酶(细菌)
1
C
头孢菌素
AmpC(肠杆菌属等)
2a
A
青霉素
青霉素酶(金黄色葡萄球菌)
2b
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A
青霉素，头孢菌素
TEM-1(大肠杆菌)，SHV-1(Klebsiella spp)
2be/r
A
青霉素，头孢菌素*
TEM364，SHV212(肠杆菌科)
2c
A
青霉素
PSE-Ⅰ(假单孢菌属)
, 百拇医药 2d
D
青霉素
OXA-Ⅲ(假单孢菌属/肠杆菌科)
2e+
A
头孢菌素
变形杆菌属中可诱导的染色体酶
2f
A
青霉素，头孢菌素和carbapenems
SME-1(锯杆菌属)
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3
B++
青霉素，头孢菌素和carbapenems
IMP-1(假单孢菌属)
4
-
青霉素
青霉素酶(Pseudomonas cepacia)
*包括第三代头孢菌素，比如ceftazidime；有些不被棒酸抑制 +被棒酸抑制 ++金属-β内酰胺酶，需要锌维持活性
当我们考虑抗生素耐药基因的演化和传播时，有一点是重要的，即理解细菌增殖非常迅速以及细菌在世界范围的动物、人体以及农业宿主之间不停的交换。有资料支持抗生素耐药的决定因素不是来源于近来观察到的具有耐药质粒的细菌宿主。β内酰胺酶和氨基甙失活酶的DNA测序研究显示出，尽管在蛋白质研究中这两种酶的性质相似，但它们在本质上有序列差异12，13。因为演变时间仅在50年之内，所以不可能形成一个由共同祖先基因突变而演变的模型，这些演变肯定来自于环境细菌已经产生的一大群各种各样的基因。很多产生抗生素的细菌和真菌具有耐药决定因子，与那些在临床细菌中发现的耐药决定因子相似10。基因交换也许发生在土壤中，或者更为可能的是发生在人类或动物的肠道。人们发现，商业用抗生素制剂中含有DNA，它们来自于产生这些抗生素的微生物，并且聚合酶链反应可以确定抗生素耐药基因的序列14。
耐药基因可以是早已存在于自然界中，也可以是通过突变而很快地形成。人们已经发现两种形式的快速突变，其中之一是通过TEM β内酰胺酶,它扩展了作用底物的范围，包括第三代头孢菌素(于1963年发现氨苄青霉素1年后，在Athens被首次报道)。另一种形式是通过IMI-1β内酰胺酶(在美国允许使用亚胺培南之前由加利福尼亚一家医院报道15)。尽管农用和兽用抗生素的使用促进了人类病原的耐药性，但是，应负主要责任的是临床医疗中广泛存在的抗生素滥用。或是为了促进动物生长，或是为了动物群体的治疗和预防，而在饲养动物的食物和水中加入抗生素，这对于耐药也具有不可估量的作用16。细菌显然具有令人叹服的生化和遗传手段来确保其抗生素耐药性的演化和传递。, http://www.100md.com
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关键词：
英国医学杂志中文版990224The origins and molecular basis of antibiotic resistance
Peter M Hawkey
我们常说细菌对抗生素耐药，但是我们很少考虑这意味着什么。即使最耐药的细菌也能被浓度足够高的抗生素所抑制或杀死，但是一些患者不能耐受所需要的高浓度。对于某一种抗生素的耐受性，不同菌种之间的差别很大。例如，在英国，肺炎链球菌的大部分菌株能被0.01mg/L的苄基青霉素(最低抑制浓度)抑制，但是需要32～64mg/L才能抑制大肠杆菌的生长，这是一个不能在人体内达到的水平。这种情况引出了临床耐药性(clinical resistance)的概念，它取决于治疗结果，但常常被忽视。临床耐药性是一个复杂的概念，其中包括感染细菌的类型及其在人体中的位置、人体中抗生素的分布和在感染病灶中的浓度，以及与之相互作用的患者免疫状态。
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细菌耐药的机制
细菌能够使自己免于抗生素的损害，其机制有多种，被分为4个基本类型(图1)。最为人们所知的是抗生素修饰：耐药细菌保持自己对于抗生素的敏感性，但是阻止抗生素发生作用。例如，可以通过β内酰胺酶实现这一作用——β内酰胺酶切断4个β内酰胺环成分使抗生素失活。已经被报道过的β内酰胺酶超过200种(附表)。大多数β内酰胺酶对青霉素和头孢菌素都有不同程度的拮抗作用；其余的则更具有特异性—— 分别命名为头孢菌素酶(例如在肠杆菌属中发现的AmpC 酶) 或青霉素酶(例如金黄色葡萄球菌中的青霉素酶)。β内酰胺酶在许多种细菌(包括革兰阳性和革兰阴性)中广泛存在，并且能被β内酰胺酶抑制剂不同程度地抑制，例如棒酸1。
一些耐药细菌阻止抗生素进入细胞或者将抗生素快速泵出，其泵出速度比流入速度更快(如同船里的抽水泵)，以保护抗生素作用的靶部位。对革兰阴性细菌中的β内酰胺抗生素类是通过一种膜蛋白而进入细胞的,这种蛋白质是由水填充的、中空的，称之为膜孔蛋白(图2)。抗亚胺培南的绿脓杆菌，因缺乏特异性D2膜孔蛋白而具有耐药性，致使亚胺培南不能穿透细胞。这个机制同样适用于氟喹诺酮类抗生素和氨基糖甙类抗生素，只是拮抗水平较低。通过耗能的转移泵增加外流量被认为是抗四环素的机制，很多相关基因能编码这种转移泵，比如分布在肠杆菌科中的tet(A)2。 本文要点
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应该用临床结果定义对抗生素耐药，而不是用实验室方法
耐药性通过4种主要机制而产生——在一个单个细胞中可
以存在不仅一种机制
耐药机制的进化可能来自于产生抗生素的微生物基因
耐药基因不仅存在于致病菌，也存在于共生细菌，而且在
食物、环境和动物中都可以发现它们，我们始终在它们的
包围之中
抗生素耐药基因的演化和重新组合涉及多种遗传机制，它
可使有用基因迅速传播
必须采取措施减慢抗生素耐药基因的演化和传播的速度，其中最主要的单一因素是在人类医疗实践和农业生产中使
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用抗生素的量
抗生素作用的首要部位发生改变可能表明抗生素穿透了细胞并到达作用部位，但是因为作用部位的分子结构改变而不能抑制其活性。肠球菌被认为对头孢菌素具有先天的耐药性，是因为负责细胞壁合成的酶(肽聚糖多聚体的产物)——已知它是青霉素结合蛋白——与β内酰胺的亲和性低所以不被抑制。肺炎链球菌的大部分菌株对于青霉素和头孢菌素都有很高的易感性，但是它们能从其它细菌中获得DNA，这些DNA改变了酶，从而使它们与青霉素的亲和力降低，由此抵抗了青霉素的抑制作用3。虽然被改变的酶仍然合成肽聚糖，但是它的结构不同4。我们能从实验室中挑选出抗青霉素的化脓链球菌突变株，它们表达已经改变了的青霉素结合蛋白，但在病人身上还未见到，这可能是因为细胞壁不再结合抗吞噬细胞的(anti-phagocytic)M蛋白。
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图1 抗生素耐药的4种主要生化机制
革兰阳性细菌
革兰阴性细菌
图2 β内酰胺酶抗生素类与革兰阳性和革兰阴性细菌的相互作用
细菌可以保护自己免受抗生素作用的最后一种机制是产生能抵抗抗生素抑制作用的替代性靶蛋白(通常是一种酶)，同时继续产生原来的易感性靶蛋白。这种机制使得细菌通过选择得以幸存：替代性酶使抗生素的作用绕道而过。 说明这种机制的最好例子可能是替代青霉素结合蛋白(alternative penicillin binding protein, PBP2a)，它是由对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)额外产生，除此之外还产生正常的青霉素结合蛋白。MRSA由mecA基因编码，并且因为PBP2a不被抗生素抑制，比如氟氯西林，细胞可继续合成肽聚糖，因而拥有结构完好的细胞壁5。1987年，抗万古霉素肠球菌的出现引起人们极大关注，因其相关的基因能被转入金黄色葡萄球菌。这样，从理论上讲能导致抗万古霉素的MRSA。这种机制也能代表另一些替代性靶蛋白的耐药机制6。在对万古霉素易感的肠球菌中，万古霉素的常规作用部位是一种细胞壁前体，它包含了一种具有一个D-丙胺酸-D-丙胺酸末端的五肽，万古霉素结合在这个部位，可阻止细胞壁的进一步合成。但是假如一个肠球菌获得了vanA基因簇，它能造出一个含D-丙胺酸-D-乳酸的替代性细胞壁前体，使万古霉素不能与其结合。
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耐药基因的分子流行病学
细菌的耐药性可以是本身固有的，也可以是获得性的。固有的耐药性是一个自然发生的生物学特性，例如，大肠杆菌对万古霉素耐药。当一个对抗生素敏感的细菌逐渐产生了耐药性，我们称之为获得性耐药，这可以通过突变而产生，也可以通过获得新的DNA而产生。
突变是一个自发性事件，无论抗生素是否存在。由于敏感细菌很快被抗生素杀死，因而一个携带突变的细菌具有巨大的优势，留下了耐药的亚群。1959年人们认识到耐药性是可以转移的，当时，在志贺菌中发现的耐药性基因通过质粒转移给了大肠杆菌。质粒是自我复制的环状DNA片段，小于细菌的基因组，能通过复制编码进入菌株或另一种细菌。它们能携带并转移多种耐药基因，这些基因可以位于一个DNA片段，此片段能从一个质粒转移至另一个质粒或转移至基因组——称为转座子(transposon)或称为“跳跃基因”。因为质粒能传播的细菌范围常常有限，所以转座子在细菌之间传播耐药性基因方面是重要的。在MRSA中发现的mec A基因可以通过转座作用而被获得7。质粒的演变很复杂，但是现代分子技术能够解开这个谜(例如包含tet M基因的质粒，在全世界的淋球菌中均能被找到)8。
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噬菌体(感染细菌的病毒)也能转移耐药性，这在葡萄球菌中常见。当细菌死亡时释放DNA，这些DNA能被感受态细菌摄取——这一过程被称为转化(transformation)。这个过程在环境当中越来越重要, 并且可能是青霉素耐药性在肺炎链球菌中传播的主要途径，此过程产生了“镶嵌青霉素结合蛋白基因”(mosaic penicillin binding protein genes)3。
耐药基因的起源
抗生素耐药基因的起源尚不清楚，因为当开始使用抗生素时，耐药的生化和分子基础还没被人们认识。后来发现，在1914年～1950期间收集的细菌(the Murray collection)对抗生素完全敏感。但是它们的确包含了一系列能共同传递的质粒9。尽管Murray菌株从本世纪30年代中期就被引入，但是它们当中没有一种对磺胺耐药；而有人在40年代早期报道了链球菌和淋球菌中的耐药性10。靶基因突变使耐药性附表 β内酰胺酶主要族的简单功能分类(由Bush等人建议)迅速发展，使链霉素治疗结核失败。现在认为突变是造成结核杆菌耐药的最常见机制，它使细菌对大多数抗结核药产生耐药，并且现在已经弄清楚了这种突变的分子本质11。细菌产生的突变能传递，其途径是通过插入序列、转座子进入质粒并由此转移至不同的菌种中。
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族
分子类型
作用底物
代表性酶(细菌)
1
C
头孢菌素
AmpC(肠杆菌属等)
2a
A
青霉素
青霉素酶(金黄色葡萄球菌)
2b
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A
青霉素，头孢菌素
TEM-1(大肠杆菌)，SHV-1(Klebsiella spp)
2be/r
A
青霉素，头孢菌素*
TEM364，SHV212(肠杆菌科)
2c
A
青霉素
PSE-Ⅰ(假单孢菌属)
, 百拇医药 2d
D
青霉素
OXA-Ⅲ(假单孢菌属/肠杆菌科)
2e+
A
头孢菌素
变形杆菌属中可诱导的染色体酶
2f
A
青霉素，头孢菌素和carbapenems
SME-1(锯杆菌属)
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3
B++
青霉素，头孢菌素和carbapenems
IMP-1(假单孢菌属)
4
-
青霉素
青霉素酶(Pseudomonas cepacia)
*包括第三代头孢菌素，比如ceftazidime；有些不被棒酸抑制 +被棒酸抑制 ++金属-β内酰胺酶，需要锌维持活性
当我们考虑抗生素耐药基因的演化和传播时，有一点是重要的，即理解细菌增殖非常迅速以及细菌在世界范围的动物、人体以及农业宿主之间不停的交换。有资料支持抗生素耐药的决定因素不是来源于近来观察到的具有耐药质粒的细菌宿主。β内酰胺酶和氨基甙失活酶的DNA测序研究显示出，尽管在蛋白质研究中这两种酶的性质相似，但它们在本质上有序列差异12，13。因为演变时间仅在50年之内，所以不可能形成一个由共同祖先基因突变而演变的模型，这些演变肯定来自于环境细菌已经产生的一大群各种各样的基因。很多产生抗生素的细菌和真菌具有耐药决定因子，与那些在临床细菌中发现的耐药决定因子相似10。基因交换也许发生在土壤中，或者更为可能的是发生在人类或动物的肠道。人们发现，商业用抗生素制剂中含有DNA，它们来自于产生这些抗生素的微生物，并且聚合酶链反应可以确定抗生素耐药基因的序列14。
耐药基因可以是早已存在于自然界中，也可以是通过突变而很快地形成。人们已经发现两种形式的快速突变，其中之一是通过TEM β内酰胺酶,它扩展了作用底物的范围，包括第三代头孢菌素(于1963年发现氨苄青霉素1年后，在Athens被首次报道)。另一种形式是通过IMI-1β内酰胺酶(在美国允许使用亚胺培南之前由加利福尼亚一家医院报道15)。尽管农用和兽用抗生素的使用促进了人类病原的耐药性，但是，应负主要责任的是临床医疗中广泛存在的抗生素滥用。或是为了促进动物生长，或是为了动物群体的治疗和预防，而在饲养动物的食物和水中加入抗生素，这对于耐药也具有不可估量的作用16。细菌显然具有令人叹服的生化和遗传手段来确保其抗生素耐药性的演化和传递。, http://www.100md.com