抗中性粒细胞胞浆抗体在风湿性疾病中的作用
作者：张文 曾小峰
单位：张文(北京协和医院风湿免疫科 邮政编码100730)；曾小峰(北京协和医院风湿免疫科 邮政编码100730)
关键词：
北京医学990213 一、抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)的历史
抗中性粒细胞胞浆抗体是针对中性粒细胞和单核细胞胞浆靶抗原的一组异质性自身抗体。1982年Davies等最早报道，在8例节段坏死性肾小球肾炎的患者血清中存在一种抗中性粒细胞胞浆的IgG抗体。当时这一发现并未引起重视，直至1985年，Vander Wonde等发现此抗体与韦格内肉芽肿(WG)的活动性密切相关，并将其命名为“抗细胞胞浆抗体(ACPA)”。以后，该抗体引起了广泛关注，有关的研究工作大量展开，如：克隆靶抗原，该抗体引起血管炎的机制以及与临床疾病的关系等。由于通常是用中性粒细胞作为检测该抗体的抗原，所以也称之为“抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)”，但这些抗原除中性粒细胞外，也存在于单核细胞中。1988年1月，在哥本哈根首届国际ANCA/ACPA会议上统一了用间接免疫荧光及ELISA方法检测ANCA。现已知道，ANCA与系统性血管炎(如WG)、嗜酸性肉芽肿(CSS)、显微镜下多血管炎(MPA)、原发性缺乏免疫复合物的坏死性肾小球肾炎等密切相关，也可出现于其它疾病中，如：胶原血管病、炎性肠病及感染性疾病[1，2]。
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二、ANCA的检测方法及分类
目前主要用三种方法检测ANCA：间接免疫荧光、ELISA及放免法。间接免疫荧光法是国际公认的测ANCA的金标准方法，其步骤如下：首先将酒精固定的正常人中性粒细胞与待测血清混合孵化，然后用缓冲液冲洗，再加入荧光标记的抗人球蛋白抗体，再冲洗，最后在荧光显微镜下观察结果。通常有两种主要的ANCA类型：C-ANCA(胞浆型)，呈现胞浆染色；P-ANCA(核周型)，呈核周或弥漫的核染色。C-ANCA和P-ANCA可与中性粒细胞和单核细胞反应，但与成熟的巨噬细胞、淋巴细胞及嗜酸细胞不反应，因此，在出现因细胞胞浆抗原重新分布的假象而导致与酒精固定的中性粒细胞抗核抗体难以鉴别时，可以用淋巴细胞或嗜酸细胞作底物，ANCA不出现于这两种细胞中，而抗核抗体则可出现。
C-ANCA的靶抗原主要是髓样细胞嗜苯胺兰颗粒第三丝氨酸蛋白酶(PR3)，少数为CAP57[2]，PR3是分子量为29000的糖蛋白，等电点为7.8。P-ANCA的主要靶抗原为髓过氧化物酶(MPO)，MPO存在于中性粒细胞嗜天青颗粒内，分子量146000，等电点11.0，为细胞毒过程中产生毒性氧自由基的主要酶。另外，P-ANCA的靶抗原还包括许多蛋白，如弹性蛋白酶、运乳蛋白酶、组织蛋白酶G、溶菌酶等。最近发现BPI(bactericidal/permeability-increasing protein)也是一种重要的靶抗原[3]，BPI为存在于嗜天青颗粒内高度阳离子化的膜相关蛋白，分子量55000，与G-菌表面的脂多糖有强大的亲和力，有很强的杀G-菌作用。不同靶抗原的特异性与不同临床疾病相关，所以用特异性较强的抗原来检测临床意义更大[4]。
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三、ANCA致病机理的探讨
在ANCA相关疾病的病理损害中，无论任何器官(如肾、肺、肠、肌肉等)或血管，其血管损伤在急性期有几个共同特征：①沿血管呈节段性分布；②纤维素样坏死；③中性粒细胞浸润；④无免疫复合物沉积。随病变进展，纤维素样坏死被纤维化替代，浸润以单核细胞为主，因此，ANCA在致病机制上有相似之处，下面分述其致病机制：
1.ANCA对中性粒细胞的激活：在慢性炎症反应的体外试验中，ANCA能激活已接触抗原的中性粒细胞，使之释放溶酶体酶。当中性粒细胞接触小剂量的肿瘤坏死因子α(TNF-α)时，其表面可表达ANCA的靶抗原，如PR3、MPO及弹性蛋白酶等。ANCA与相应的特异性抗原结合后可激活中性粒细胞。上述过程可能由于自身抗体的Fc段和中性粒细胞表面的Fc受体(FcrRⅢa)参与，FcrRⅢa对IgG2(可能也包括IgG3)有很强的亲和力。WG病情活动时，ANCA IgG3亚群数目也相对增多，其激活中性粒细胞的能力也增强，因此，ANCA能导致炎症过程[5，6]。
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2.ANCA与内皮细胞：ANCA与内皮细胞的相互作用可导致血管炎的产生[7]。Mayet等发现，人内皮细胞上可表达PR3，细胞因子如TNF-α、IL-1等可刺激PR3表达增加。许多实验证实，ANCA与内皮细胞上的靶抗原相互作用能引起补体介导的细胞毒作用，也可产生由中性粒细胞介导的细胞毒作用而损伤内皮细胞，产生血管炎症，还可使内皮细胞表达的E-选择素、VCAM-1等粘附分子水平上调，从而中性粒细胞、淋巴/单核细胞粘附于内皮并转移至组织中。在WG患者，VCAM-1水平上调与其病情活动有关。
3.ANCA相关疾病的动物模型：Brouwer等[8]用人的MPO免疫小鼠，后者产生的抗人MPO与其MPO可产生交叉反应，当用MPO灌注这些小鼠的肾动脉时，出现了缺乏免疫复合物的新月体性肾小球肾炎，其病理与抗MPO阳性患者的肾损伤相似。还有实验证实抗MPO可导致炎症反应：将两组小鼠都注射兔抗鼠基底膜抗体，另一组同时注射兔抗鼠MPO抗体，结果后者产生了严重的抗肾小球基底膜疾病，而前者病变则很轻。Tomer等建立了一个动物模型，给小鼠注射人抗PR3 IgG，通过独特型-抗独特型反应，3个月后小鼠产生了抗PR3抗体，并表现出以血管炎和单核细胞浸润为特征的肺部病变。
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四、ANCA在风湿性疾病中的诊断价值
系统性血管炎发病率较低，早期诊断困难，预后相对较差，其临床表现又与其它风湿性疾病有诸多交叉，在ANCA未被认识时，缺乏该类疾病特异性实验室检查，而ANCA的发现为血管炎的鉴别诊断和发病机制的研究提供了新的手段。Goeken报道C-ANCA或P-ANCA阳性提示患系统性血管炎的可能性为96%。
1.C-ANCA、PR3-ANCA与疾病的关系：C-ANCA(PR3-ANCA)对WG高度敏感和特异。Wolfgang等[1]认为其特异性为95%～98%，敏感性则取决于病情活动性及病变程度，在早期无全身血管炎病变，仅限于上、下呼吸道肉芽肿的患者，约50% C-ANCA阳性，而有广泛血管炎的活动期患者阳性率近100%。病情完全缓解者C-ANCA均阴性，部分缓解者滴度低。有人认为，缓解期的WG患者如C-ANCA持续或间断阳性提示复发可能性很大。但也有人认为C-ANCA对WG的敏感性和特异性并不高。Jaya等报道了346例可疑系统性血管炎患者，其中符合1990年美国风湿病学会WG诊断标准者，C-ANCA的敏感性、特异性仅28%和96%；而通过活检和临床证实为WG的患者，敏感性为83%[9]。此结论对依据C-ANCA诊断WG提出了疑问。
, 百拇医药
C-ANCA偶尔也见于其它血管炎疾病中，如MPA、CSS、结节性多动脉炎(PAN)，也极少出现在以下血管炎：巨细胞动脉炎、大动脉炎、过敏性紫癜及冷球蛋白血症。还有一种异质型C-ANCA荧光类型在有症状的HIV阳性患者及阿米巴脓肿患者中可发现。通常C-ANCA极少出现在感染性疾病。
2.P-ANCA、MPO-ANCA与疾病的相关性：P-ANCA较C-ANCA特异性差，可在多种疾病中检出[10，11]，如原发或继发性血管炎，炎性肠病，一些感染性疾病和恶性肿瘤(如：恶性淋巴瘤、骨髓瘤等)。MPO-ANCA主要出现在MPA中。MPA是一种缺乏免疫沉积的坏死性血管炎(无抗基底膜抗体及免疫复合物)，主要病变在小血管，它与经典型PAN的主要区别是后者为中等动脉坏死性炎症而无肾小球肾炎，PAN与ANCA的相关性很弱。
MPO-ANCA偶也见于WG、PAN和CSS，在大动脉炎、巨细胞动脉炎、川畸病和过敏性紫癜则无阳性发现，但这些病患者却有IgA型ANCA。30%～40%肺肾综合征及少数肼苯哒嗪所致的药物性狼疮中也有MPO-ANCA发现。
, 百拇医药
非MPO抗原特异的P-ANCA，如抗组织蛋白IgG、抗弹性蛋白酶等，除MPA外还与胶原血管炎，类风湿性关节炎及炎性肠病等相关。Wolfgang等研究发现，在红斑狼疮、干燥综合征、多发性肌炎及类风湿性关节炎中，16%～32%的患者P-ANCA阳性，这些P-ANCA大多不是MPO-ANCA，类风湿性关节炎中多为抗运乳蛋白酶抗体，在合并血管炎时阳性率更高，故P-ANCA或许可作为判断该病恶性进程及关节外表现的一个标志。■
参考文献：
[1]Wolfgang L, Wilhem HS, Elena CD. Antineutrophil cytoplasmic autoantibody associated diseases: a rheumatologist's perspective. Am J Kid Dis, 1991,18：175.
[2]Jennette JC, Falk RJ. Antineutrophil cytoplasmic autoantibodies and associated diseases. Am J Kid Dis, 1990, 15:517.
, 百拇医药
[3]Zhao MH, Jones SJ, Lockwood CM, et al. Bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) is an important antigen for antineutrophil cytoplasmic autoantibodies in vasculitis. Clin Exp Lmmunol, 1995, 99:49.
[4]Kallenberg CGM. ANCA-pathophysiology revisited. Clin Exp Lmmunol, 1995,100:1.
[5]Reumaux D, Paula JM, Dirk R, et al. Effect of tumor necrosis factor-induced integrin activation on Fc gamma receptor Ⅱ-mediated signal transduction: relevance for activation of neutrophils by anti-proteinase 3 on anti-myeloperoxidase antibodies. Blood, 1995, 86:3189.
, 百拇医药
[6]Kallenbeng CGM. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and pathophysiology of inflammatory disorders. Rheum in Europe, 1995 (Supplement),2:234.
[7]Mayet WJ, Csernok E, Szymkowiak C. Human endothelial cells express proteinase 3, the target antigen of anti-cytoplasmic antibodies in Wegener's granulomatosis. Blood, 1993,82:1221.
[8]Brouwer E. Anti-myeloperoxidase associated proliferative glomerulonephritis: an animal model. J Exp Med, 1993,177:905.
, 百拇医药
[9]Rao JK, Allen NB, Feussner JR, et al. A Prospective study of antineutrophil cytoplasmic antibody (C-ANCA) and clincal criteria in diagnosing Wegener's granulomatosis. Lancet, 1995, 346:926.
[10]Wolfgang L. Lmmunodiagnostic value of ANCA in rheumatic disease. Rheu in Europe, 1995(Supplement), 2:236.
[11]Schnabel A. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies in generalized autoimmune diseases. Lnt Arch Allergy Lmmunol, 1996,109:201.
收稿日期：1996-12-29
修回日期：1997-04-25, 百拇医药
单位：张文(北京协和医院风湿免疫科 邮政编码100730)；曾小峰(北京协和医院风湿免疫科 邮政编码100730)
关键词：
北京医学990213 一、抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)的历史
抗中性粒细胞胞浆抗体是针对中性粒细胞和单核细胞胞浆靶抗原的一组异质性自身抗体。1982年Davies等最早报道，在8例节段坏死性肾小球肾炎的患者血清中存在一种抗中性粒细胞胞浆的IgG抗体。当时这一发现并未引起重视，直至1985年，Vander Wonde等发现此抗体与韦格内肉芽肿(WG)的活动性密切相关，并将其命名为“抗细胞胞浆抗体(ACPA)”。以后，该抗体引起了广泛关注，有关的研究工作大量展开，如：克隆靶抗原，该抗体引起血管炎的机制以及与临床疾病的关系等。由于通常是用中性粒细胞作为检测该抗体的抗原，所以也称之为“抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)”，但这些抗原除中性粒细胞外，也存在于单核细胞中。1988年1月，在哥本哈根首届国际ANCA/ACPA会议上统一了用间接免疫荧光及ELISA方法检测ANCA。现已知道，ANCA与系统性血管炎(如WG)、嗜酸性肉芽肿(CSS)、显微镜下多血管炎(MPA)、原发性缺乏免疫复合物的坏死性肾小球肾炎等密切相关，也可出现于其它疾病中，如：胶原血管病、炎性肠病及感染性疾病[1，2]。
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二、ANCA的检测方法及分类
目前主要用三种方法检测ANCA：间接免疫荧光、ELISA及放免法。间接免疫荧光法是国际公认的测ANCA的金标准方法，其步骤如下：首先将酒精固定的正常人中性粒细胞与待测血清混合孵化，然后用缓冲液冲洗，再加入荧光标记的抗人球蛋白抗体，再冲洗，最后在荧光显微镜下观察结果。通常有两种主要的ANCA类型：C-ANCA(胞浆型)，呈现胞浆染色；P-ANCA(核周型)，呈核周或弥漫的核染色。C-ANCA和P-ANCA可与中性粒细胞和单核细胞反应，但与成熟的巨噬细胞、淋巴细胞及嗜酸细胞不反应，因此，在出现因细胞胞浆抗原重新分布的假象而导致与酒精固定的中性粒细胞抗核抗体难以鉴别时，可以用淋巴细胞或嗜酸细胞作底物，ANCA不出现于这两种细胞中，而抗核抗体则可出现。
C-ANCA的靶抗原主要是髓样细胞嗜苯胺兰颗粒第三丝氨酸蛋白酶(PR3)，少数为CAP57[2]，PR3是分子量为29000的糖蛋白，等电点为7.8。P-ANCA的主要靶抗原为髓过氧化物酶(MPO)，MPO存在于中性粒细胞嗜天青颗粒内，分子量146000，等电点11.0，为细胞毒过程中产生毒性氧自由基的主要酶。另外，P-ANCA的靶抗原还包括许多蛋白，如弹性蛋白酶、运乳蛋白酶、组织蛋白酶G、溶菌酶等。最近发现BPI(bactericidal/permeability-increasing protein)也是一种重要的靶抗原[3]，BPI为存在于嗜天青颗粒内高度阳离子化的膜相关蛋白，分子量55000，与G-菌表面的脂多糖有强大的亲和力，有很强的杀G-菌作用。不同靶抗原的特异性与不同临床疾病相关，所以用特异性较强的抗原来检测临床意义更大[4]。
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三、ANCA致病机理的探讨
在ANCA相关疾病的病理损害中，无论任何器官(如肾、肺、肠、肌肉等)或血管，其血管损伤在急性期有几个共同特征：①沿血管呈节段性分布；②纤维素样坏死；③中性粒细胞浸润；④无免疫复合物沉积。随病变进展，纤维素样坏死被纤维化替代，浸润以单核细胞为主，因此，ANCA在致病机制上有相似之处，下面分述其致病机制：
1.ANCA对中性粒细胞的激活：在慢性炎症反应的体外试验中，ANCA能激活已接触抗原的中性粒细胞，使之释放溶酶体酶。当中性粒细胞接触小剂量的肿瘤坏死因子α(TNF-α)时，其表面可表达ANCA的靶抗原，如PR3、MPO及弹性蛋白酶等。ANCA与相应的特异性抗原结合后可激活中性粒细胞。上述过程可能由于自身抗体的Fc段和中性粒细胞表面的Fc受体(FcrRⅢa)参与，FcrRⅢa对IgG2(可能也包括IgG3)有很强的亲和力。WG病情活动时，ANCA IgG3亚群数目也相对增多，其激活中性粒细胞的能力也增强，因此，ANCA能导致炎症过程[5，6]。
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2.ANCA与内皮细胞：ANCA与内皮细胞的相互作用可导致血管炎的产生[7]。Mayet等发现，人内皮细胞上可表达PR3，细胞因子如TNF-α、IL-1等可刺激PR3表达增加。许多实验证实，ANCA与内皮细胞上的靶抗原相互作用能引起补体介导的细胞毒作用，也可产生由中性粒细胞介导的细胞毒作用而损伤内皮细胞，产生血管炎症，还可使内皮细胞表达的E-选择素、VCAM-1等粘附分子水平上调，从而中性粒细胞、淋巴/单核细胞粘附于内皮并转移至组织中。在WG患者，VCAM-1水平上调与其病情活动有关。
3.ANCA相关疾病的动物模型：Brouwer等[8]用人的MPO免疫小鼠，后者产生的抗人MPO与其MPO可产生交叉反应，当用MPO灌注这些小鼠的肾动脉时，出现了缺乏免疫复合物的新月体性肾小球肾炎，其病理与抗MPO阳性患者的肾损伤相似。还有实验证实抗MPO可导致炎症反应：将两组小鼠都注射兔抗鼠基底膜抗体，另一组同时注射兔抗鼠MPO抗体，结果后者产生了严重的抗肾小球基底膜疾病，而前者病变则很轻。Tomer等建立了一个动物模型，给小鼠注射人抗PR3 IgG，通过独特型-抗独特型反应，3个月后小鼠产生了抗PR3抗体，并表现出以血管炎和单核细胞浸润为特征的肺部病变。
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四、ANCA在风湿性疾病中的诊断价值
系统性血管炎发病率较低，早期诊断困难，预后相对较差，其临床表现又与其它风湿性疾病有诸多交叉，在ANCA未被认识时，缺乏该类疾病特异性实验室检查，而ANCA的发现为血管炎的鉴别诊断和发病机制的研究提供了新的手段。Goeken报道C-ANCA或P-ANCA阳性提示患系统性血管炎的可能性为96%。
1.C-ANCA、PR3-ANCA与疾病的关系：C-ANCA(PR3-ANCA)对WG高度敏感和特异。Wolfgang等[1]认为其特异性为95%～98%，敏感性则取决于病情活动性及病变程度，在早期无全身血管炎病变，仅限于上、下呼吸道肉芽肿的患者，约50% C-ANCA阳性，而有广泛血管炎的活动期患者阳性率近100%。病情完全缓解者C-ANCA均阴性，部分缓解者滴度低。有人认为，缓解期的WG患者如C-ANCA持续或间断阳性提示复发可能性很大。但也有人认为C-ANCA对WG的敏感性和特异性并不高。Jaya等报道了346例可疑系统性血管炎患者，其中符合1990年美国风湿病学会WG诊断标准者，C-ANCA的敏感性、特异性仅28%和96%；而通过活检和临床证实为WG的患者，敏感性为83%[9]。此结论对依据C-ANCA诊断WG提出了疑问。
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C-ANCA偶尔也见于其它血管炎疾病中，如MPA、CSS、结节性多动脉炎(PAN)，也极少出现在以下血管炎：巨细胞动脉炎、大动脉炎、过敏性紫癜及冷球蛋白血症。还有一种异质型C-ANCA荧光类型在有症状的HIV阳性患者及阿米巴脓肿患者中可发现。通常C-ANCA极少出现在感染性疾病。
2.P-ANCA、MPO-ANCA与疾病的相关性：P-ANCA较C-ANCA特异性差，可在多种疾病中检出[10，11]，如原发或继发性血管炎，炎性肠病，一些感染性疾病和恶性肿瘤(如：恶性淋巴瘤、骨髓瘤等)。MPO-ANCA主要出现在MPA中。MPA是一种缺乏免疫沉积的坏死性血管炎(无抗基底膜抗体及免疫复合物)，主要病变在小血管，它与经典型PAN的主要区别是后者为中等动脉坏死性炎症而无肾小球肾炎，PAN与ANCA的相关性很弱。
MPO-ANCA偶也见于WG、PAN和CSS，在大动脉炎、巨细胞动脉炎、川畸病和过敏性紫癜则无阳性发现，但这些病患者却有IgA型ANCA。30%～40%肺肾综合征及少数肼苯哒嗪所致的药物性狼疮中也有MPO-ANCA发现。
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非MPO抗原特异的P-ANCA，如抗组织蛋白IgG、抗弹性蛋白酶等，除MPA外还与胶原血管炎，类风湿性关节炎及炎性肠病等相关。Wolfgang等研究发现，在红斑狼疮、干燥综合征、多发性肌炎及类风湿性关节炎中，16%～32%的患者P-ANCA阳性，这些P-ANCA大多不是MPO-ANCA，类风湿性关节炎中多为抗运乳蛋白酶抗体，在合并血管炎时阳性率更高，故P-ANCA或许可作为判断该病恶性进程及关节外表现的一个标志。■
参考文献：
[1]Wolfgang L, Wilhem HS, Elena CD. Antineutrophil cytoplasmic autoantibody associated diseases: a rheumatologist's perspective. Am J Kid Dis, 1991,18：175.
[2]Jennette JC, Falk RJ. Antineutrophil cytoplasmic autoantibodies and associated diseases. Am J Kid Dis, 1990, 15:517.
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[3]Zhao MH, Jones SJ, Lockwood CM, et al. Bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) is an important antigen for antineutrophil cytoplasmic autoantibodies in vasculitis. Clin Exp Lmmunol, 1995, 99:49.
[4]Kallenberg CGM. ANCA-pathophysiology revisited. Clin Exp Lmmunol, 1995,100:1.
[5]Reumaux D, Paula JM, Dirk R, et al. Effect of tumor necrosis factor-induced integrin activation on Fc gamma receptor Ⅱ-mediated signal transduction: relevance for activation of neutrophils by anti-proteinase 3 on anti-myeloperoxidase antibodies. Blood, 1995, 86:3189.
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[6]Kallenbeng CGM. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and pathophysiology of inflammatory disorders. Rheum in Europe, 1995 (Supplement),2:234.
[7]Mayet WJ, Csernok E, Szymkowiak C. Human endothelial cells express proteinase 3, the target antigen of anti-cytoplasmic antibodies in Wegener's granulomatosis. Blood, 1993,82:1221.
[8]Brouwer E. Anti-myeloperoxidase associated proliferative glomerulonephritis: an animal model. J Exp Med, 1993,177:905.
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[9]Rao JK, Allen NB, Feussner JR, et al. A Prospective study of antineutrophil cytoplasmic antibody (C-ANCA) and clincal criteria in diagnosing Wegener's granulomatosis. Lancet, 1995, 346:926.
[10]Wolfgang L. Lmmunodiagnostic value of ANCA in rheumatic disease. Rheu in Europe, 1995(Supplement), 2:236.
[11]Schnabel A. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies in generalized autoimmune diseases. Lnt Arch Allergy Lmmunol, 1996,109:201.
收稿日期：1996-12-29
修回日期：1997-04-25, 百拇医药