当前位置: 首页 > 期刊 > 《医学临床研究》 > 1999年第2期
编号:10218045
胃粘膜异型增生和胃腺癌p53基因点突变研究
http://www.100md.com 《医学临床研究》 1999年第2期
     作者:孙延亮 顾其华 杨志毅

    单位:湖南省怀化市第一人民医院(怀化 418000)

    关键词:胃肿瘤;癌基因;点突变

    湖南医学990214 p53基因是体内重要的细胞生长调节基因[1],故其突变在人类肿瘤发生中具有重要作用。文献[2]报道,在人类的肺癌、食道癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌等均存在p53基因突变。本文采用聚合酶链直接测序技术分析17例胃粘膜中度异型增生和33例胃腺癌的p53基因第5,6,7,8外显子突变情况,探讨p53基因突变和胃腺癌发生的关系。

    1 材料和方法

    1.1 标本 胃粘膜中度异型增生17例来自本院内窥镜室活检,男性10例,年龄(57.80±9.45)岁,女性7例,年龄(51.71±9.00)岁。33例胃腺癌来自本院外科,男性20例,年龄(54.45±10.32)岁。女性13例,年龄(49.77±12.23)岁。对照组为30例慢性浅表性胃炎,男性20例,年龄(49.45±12.59)岁。女性10例,年龄(49.50±10.32岁),以上标本均经病理证实。
, 百拇医药
    1.2 引物设计合成 5′GCAGTTCCTCTTCCTGC-AGTACTC3′,5′AACCAGACCTCAGGCGGCTCATAG3′,5′TGTTGTCTCCTAGGTTGGCTCTGACTA3′,5′GTCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGTGC3′。

    1.3 DNA提取 活组织剪碎,玻璃棒匀浆,加入NE(50 mmol/L NaCl,25 mmol/L EDTANa2)460 ml,10%SDS 30 μl,蛋白酶K混合,55 ℃水浴中消化2 h,再用苯酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。

    1.4 目的基因扩增及产物回收 用15 mmol/L氯化钾5 μl, 2 mmol/L dNTP 5 μl,10倍扩增缓冲液5 μl,引物25 pmol,基因组DNA 1 μg,ddH2O适量配制50 μl反应体系。96 ℃预变性7 min,96 ℃下加入TaqDNA聚合酶5 U,94 ℃30 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,循环32次,72 ℃延伸7 min。产物用1%普通琼脂凝胶电泳,紫外光鉴定质量,并切下产物带,按1∶5体积加入TE缓冲液,置入95 ℃加热2 min,使琼脂溶解,再用苯酚-氯仿抽提法提取产物。
, 百拇医药
    1.5 序列测定 取双链模板200 μg,引物5 pmol,四色荧光测序试剂8 μg,ddH2O适量配制20 μg反应体系。进行测序反应,96 ℃预变性20 s,变性10 s,反应完成后用酒精沉淀纯化,待沉淀干燥后加入25 μl模板抑制剂(TSR),混匀,加热至95 ℃变性2 min,置于冰上迅速冷却,再用310 DNA测序仪测定。

    1.6 统计学处理 计数资料用四格表精确概率法。

    2 结果

    30例慢性浅表性胃炎组织中未发现p53基因点突变,突变率为0;17例胃粘膜中度异型增生组织中1例发现p53基因点突变,突变率5.88%;33例胃腺癌组织中9例发现p53基因点突变,突变率27.27%。慢性浅表性胃炎组织与胃腺癌组织中p53基因点突变差异有高度显著性(χ2=9.5455,P<0.005);慢性浅表性胃炎与胃粘膜中度异型增生组织中p53基因点突变差异无显著性(χ2=1.8031,P>0.05);胃粘膜中度异型增生与胃腺癌组织中p53基因点突变差异无显著性(χ2=3.2085,P>0.05)。
, http://www.100md.com
    1例胃粘膜中度异型增生p53基因点突变发生于第8外显子273密码子。9例胃腺癌p53基因点突变分布在第7外显子6例,突变率18.18%,突变点位于247,258,237密码子;分布在第8外显子3例,突变率9.09%,突变点集中于273密码子(详见附表)。

    附表 胃粘膜异型增生和胃腺癌p53基因突变谱 例号

    病理学

    p53基因突变

    氨基酸改变

    突 变

    密码子/外显子

    1

    中度异型增生
, http://www.100md.com
    CGT→CAT

    273/8 G→A

    Ary→His

    2

    腺 癌

    ATG→ATT

    237/7 G→T

    Met→Ile

    3

    腺 癌

    GAA→GTA

    258/7 A→T

, http://www.100md.com     Glu→Val

    4

    腺 癌

    GAA→GTA

    258/7 A→T

    Glu→Val

    5

    腺 癌

    AAC→AGC

    247/7 A→G

    Asn→Ser

    6

    腺 癌
, 百拇医药
    AAC→AGC

    247/7 A→G

    Asn→Ser

    7

    腺 癌

    AAC→AGC

    247/7 A→G

    Asn→Ser

    8

    腺 癌

    CGT→CAT

    273/8 G→A

, 百拇医药     Ary→His

    9

    腺 癌

    CGT→CAT

    273/8 G→A

    Ary→His

    10

    腺 癌

    CGT→CAT

    273/8 G→A

    Ary→His

    3 讨论

    p53基因位于人17号染色体短臂17P13.1[3],由11个外显子,10个内含子及两侧序列组成,表达53000D磷酸蛋白功能[4]。正常p53蛋白具有调节基因组的稳定性,细胞受损DNA的反应及细胞增殖作用[4]。这一过程可能是通过调节基因的转录过程,抑制基因复制过程来完成的。因此,发生突变的p53基因丧失抑制细胞增殖及转化能力[3,4]。目前多种肿瘤组织中均发现了p53基因突变,推测p53基因突变与肿瘤发生、演变及预后有关。本组慢性浅表性胃炎组织与胃腺癌组织中p53基因突变率比较有统计学意义,表明胃腺癌在其发生、发展过程中存在p53基因突变。胃粘膜中度异型增生与胃腺癌组中p53基因突变率比较无统计学意义,同时发现1例胃粘膜中度异型增生与3例胃腺癌组织中p53基因突变点均位于第8外显子273密码子,碱基为GA转换,表明两者之间p53基因突变点有相同之处,胃粘膜异型增生属于癌前病变,已为现代医学证实。文献[5]报道其p53基因突变率为31.3%,均分布在第5,6外显子,与本研究发现有所不同,但提示基因突变为癌变的早期行为。至于慢性浅表性胃炎与胃粘膜中度异型增生组织中p53基因突变率比较无统计学意义,考虑与胃粘膜中度异型增生病例偏少有关,尚有待进一步观察。
, http://www.100md.com
    本组胃腺癌组织中p53基因点突变率为27.27%,与文献报道胃癌p53基因突变率为18%[6]相接近。p53基因突变多集中于第7,8外显子。本研究发现胃腺癌p53基因突变热点为247,258,273,237密码子,碱基多为A→G,G→A转换,其次为A→T,G→T转换。因此,开展p53基因测序,对胃粘膜癌变识别和预后估计有重要参考价值。

    参考文献

    1 Arrold J,Jamin M,Cathy.The p53 tumor suppressor gene.Nature,1991,351:453

    2 Monica H,David S,Bert u,et al.p53 mutations in human cancer.Science,1991,253:49

    3 Robert A.Tumor suppressor gene.Science,1991,254:1138
, 百拇医药
    4 Subler MA,Martin DW,Deb S.Inhibition of viral and cellular promoters by human wild type p53.J Virol,1992,66(8):4757

    5 李 铮,吕有勇.p53基因点突变与胃粘膜细胞癌变的关系.中华肿瘤杂志,1998,20(2):90~93

    6 Semca R,David L,Castedo S,et al.p53 alternations in gastric carcinomas:a study of 56 primary tumor and 204 nodal metastases.Cancer Genet Cytogenet,1994,75(1):45

    (19981212 收稿), 百拇医药