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编号:10219574
人参皂甙通过GATA转录因子刺激巨核系祖细胞增殖△
http://www.100md.com 《临床血液学杂志》 1999年第2期
     作者:高瑞兰 金锦梅 吴超群 B.H.Chong

    单位:高瑞兰 金锦梅 浙江中医学院附属医院;吴超群 B.H.Chong 澳大利亚新南威尔士大学王子威尔士医院

    关键词:人参皂甙;CFU-Meg;GATA-2转录因子;造血生长因子

    临床血液学杂志990201 摘要 目的:了解人参皂甙(GS)对巨核系祖细胞(CFU-Meg )的刺激增殖作用,比较GS与生长因子TPO、IL-3对GATA转录调控蛋白的诱导作用。方法:正常人和ITP患者骨髓CFU-Meg培养和GS刺激试验、电泳带移动阻滞 试验(EMSA)、抗体胶移动试验(Supershift assay)和蛋白免疫印迹法(Western Blot)。结果:GS刺激正常CFU-Meg增殖,呈剂量依赖的方式,血小板减少性紫癜(ITP)患者的CFU-Meg也对GS感染。GS、TPO和IL-3均能诱导生长因子依赖MO7e细胞核内G ATA蛋白与DNA结合的活性及使GATA-2蛋白含量增加。GS+TPO或GS+IL-3可协同地诱导GATA 蛋白活性进一步增高。结论:GS能够通过类生长因子和增强生长因 子作用而刺激CFU-Meg增殖,GATA转录因子,主要是GATA-2参与造血细胞对GS反应的信号 传递途径。
, 百拇医药
    Ginsenosides Stimulate Proliferation of Human Mega-karyocytic Pr ogenitors Through GATA Transcription Factor

    Gao Ruilan,Wu Chaoqun,Jin Jinmai et al

    Affiliated Hospital,Zhejiang College of Traditional Chinese Medicine,Ha ngzhou,310006

    Abstract Objective:To investigate the action of ginsenosides (GS) on megakaryocytic progenitors (CFU-Meg) and possible mechanisms.M ethods:Using bone marrow culture of CFU-Meg,electrophoretic mobility s hift assay (EMSA),Supershift assay and Western blotting analysis.Result s:GS promoted proliferation of CFU-Meg in a dose-dependent manner.CFU -Meg from patients with idiopathic thrombocytopenia purpura was response to GS. GATA binding activity and GATA-2 protein induced by GS was elevated in growth f actor-dependent MO7e cells.GATA binding activity induced by the combination of GS with thrombopoietin (TPO),or GS with interleukin-3(IL-3) were higher than t hose by GS,TPO,or IL-3 alone.Conclusions:GS may stimulate the proliferation of CFU-Meg by enhancing the effect of TPO or IL-3,and by its gr owth factor-like function,and GATA binding factors,mainly GATA-2,may mediate t he response of megakaryocytes to GS.
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    Key words Ginsenosides CFU-Meg GATA transcription factor Haematopoietic growth factor

    人参作为抗衰老、强壮剂和补气血药物用于临床已有千余年历 史。目前国内外报道了人参提取物对神经、心血管、内分泌及抗肿瘤等作用的研究,但对血液学方面的研究很少 。作者以前报道了人参皂甙(GS)能够刺激正常人的再生障碍性贫血患者的红系、粒系祖细胞 增殖〔1〕。本文通过观察GS对GATA转录调控蛋白的诱导作用,研究GS对巨核系祖细 胞(CFU-Meg)的刺激增殖作用。由于GS刺激造血的作用类似于生长因子,故并与生长因子血 小板生成素(TPO)、白介素-3(IL-3)的作用相比较。

    1 材料和方法

    1.1 人骨髓CFU-Meg培养 参照Abgrall〔2〕的方法加以改良,正常骨髓标本取自胸外科手术切除 的肋骨,呈正常骨髓的非血液病患者。培养体系含5%去血小板的人AB型血清、15%胎牛血清 、1%BSA、10-5mol/L 2-ME、IL-3 20 ng/ml(R&D system)、TPO 30 ng/ml(Genetec h)、105有核细胞/孔,和0.9%的甲基纤维素作支持物。每份标本作3个孔,置含5%CO 2、充分湿化的培养箱中孵育14 d,计数CFU-Meg集落(>3个细胞)。洗去甲基纤维素,离 心涂片机制片。瑞氏-姬姆萨染色观察巨核细胞形态,并经单抗CD41、CD42( 军事医学科学院)标记,APAAP方法显色识别巨核细胞。
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    1.2 GS刺激试验 纯化的GS干燥粉末由本院中药研究室研制,纯度为86.3%。用IMDM培养液配 制成2 000 mg/L,过滤除菌,4℃保存。用前稀释成后加入正常骨髓CFU-Meg培养,终浓度 为1,5,10,20,50和100 μg/ml,以不加GS的培养作为对照,实验分成生长因子(TPO、IL -3)和无生长因子两组。

    1.3 原发性血小板减少性紫癜(ITP)患者的CFU-Meg对GS的敏感性 20例ITP患者为本院门诊和住院病人,诊断按第二届全国血液学会议所拟定的标 准〔3〕,以及首届中华血液学会全国血栓与止血学术会议修订标准〔4〕。男 6例,女14例,年龄6~65岁(中位数34岁)。骨髓涂片平均巨核细胞数152.9±19.8/ 片。ITP患者的骨髓CFU-Meg培养加入20 μg/ml的GS作敏感试验,以GS提高率>30%为体外C FU-Meg对GS敏感的标准。

    1.4 人巨核细胞株的GS处理和核蛋白制备 生长因子依赖细胞株MO7e由LK Ashman博士惠赠(Hanson肿瘤研究中心 澳大利亚 ),来自1例急性巨核细胞白血病婴儿的外周血。常规培养在含15%胎牛血清、10 ng/ml IL- 3的IMDM培养基中。在GS刺激前,细胞作饥饿处理,MO7e细胞去生长因子,在含0.5%胎 牛血清中18 h,然后分别加入GS、TPO、GS+TPO、IL-3、GS+IL-3,细胞与药物孵育2 h。 核蛋白提取方法按Dinam报道的加以改良,细胞经冷PBS洗涤后,悬浮在缓冲液A中,含蛋白 酶抑制剂Leupeptin、antipain、aprotinin和pepstatin(Sigma),均为10 μg/ml浓度,经 振荡后破碎细胞膜,收集细胞核,悬浮在缓冲液C中,超声粉碎器破碎细胞核,离心沉淀12 000 r/min,20 min,取上清,测定蛋白浓度。
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    1.5 电泳带移动阻滞试验(Electrophoretic Mobility shift As say,EMSA)和抗体胶移动试验(Supershift Assay) 将10 μg核蛋白加入20 μl的反应液中,含HEPES、NaCl、EDTA、甘油、BSA和 2.5 μg/ml poly(dI/dC),在4℃中作用15 min〔5〕。探针用具有与GATA-1、G ATA-2、GATA-3转录因子共同结合位点的双链寡核甘酸:

    5′-CAC TTG ATA ACA GAA AGT GAT AAC TC-3′

    3′-TG AAC TAT TGT CTT TCA CTA TTG AGA-5′

    探针经末端标记法用α-32P ATP(Amersham)标记后,测cpm值。稀释后取5 μ l(50 0 00 cpm)加入反应液中与核蛋白孵育30 min,反应产物用6%聚丙烯酰胺不变性胶电泳分析, 真空加热干胶后,用X片放射自显影显带,即与特异性DNA结合的GATA转录因子的复合物(GAT A binding complex),相同的实验重复3遍。
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    1.6 Supershift Assay 与上述EMSA相同,但探针与核蛋白结合前先加入1.5 μl(1 mg/ml)Trans CruzTMgel supershift抗体到20 μl反应混合液中,4℃孵育2 h,使抗原抗体结合反 应,抗体为抗人GATA-1(N6)、抗GATA-2(C-20)和抗GATA-3(HG3-31)(均购自Santa Cruz ),然后加入32P-ATP标记的GATA寡核苷酸探针5 μl,孵育30 min,6%聚丙烯酰胺不 变性胶电泳分析。

    1.7 蛋白免疫印级哉核提取物(10μg蛋白)加入SDS凝胶加样缓冲液25μg煮沸3min,样品经SDS-PAGE胶电泳分离后。将蛋白条带用电转移到硝酸纤维滤膜上,经1.2%BSA-TBS-T缓冲液封闭膜上非特异性位点后,加特异性抗人GATA-2(C-20)抗体0.5μg/ml,室温结合反应1h,常规洗膜,加辣根过氧化物酶标记的二抗(1:2000稀释),ECL发光剂(AMERSHAM)作用1MIN,曝光1~10MIN,显影后用光密度扫描仪分析结果,同样实验重复3遍。
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    2 结果

    2.1 GS对正常CFU-MEG的刺激增殖作用

    见图1。正常骨髓细胞培养14 d可见两种巨核细胞集落。①由3~10个细胞组成 的单纯巨核细胞集落;②多向祖细胞混合集落中的巨核细胞次级集落。无论是否存在生长因 子,CFU-Meg对GS的敏感性呈剂量依赖方式。培养加生长因子时(TPO 30 ng/ml和IL-3 20 ng/ml),GS 5~50 μg/ml能够提高集落产率20.1%~76.6%,显著高于不加GS的对 照组(P均<0.01);当培养中无生长因子时,仅能生长CFU-Meg集落2.1±0. 6/105细胞,GS 5~50 μg/ml仍能刺激增加一定数量的集落为5.2±1.3-11 .5±2.4/105细胞。提示GS 20 μg/ml是体外刺激CFU-Meg增殖的恰当浓度。

    2.2 ITP患者的CFU-Meg对GS敏感性 见附表。20例ITP患者的CFU-Meg产率为21.3±2.4/105细胞,GS 20 μg/ml时集落数为30.8±3.2/105细胞,高于不加GS的对照组(P<0.001 ),平均GS提高率为33.3±4.1%。ITP患者的CFU-Meg对GS的敏感性各不相同,如 果以GS提高率>30%作为对GS敏感的标准,则20例中有12例的CFU-Meg显示对GS敏感,GS提 高率为31.0%~75.5%。
, 百拇医药
    实验分为:生长因子和无生长因子二组

    图1 不同浓度的GS对CFU-Meg的刺激增殖作用 (n=9)

    附表 ITP患者的CFU-Meg对GS的敏感性 病例

    性别

    年龄

    骨髓巨核

    细胞/片

    CFU-Meg/

    105细胞

    GS提

    高率(%)
, 百拇医药
    无GS

    加GS

    1

    F

    56

    200

    15.0

    23.0

    47.7

    2

    F

    33

    100

, 百拇医药     5.3

    6.0

    11.0

    3

    M

    44

    35

    26.3

    42.6

    38.5

    4

    F

    48

    50
, 百拇医药
    13.0

    17.5

    25.7

    5

    M

    6

    300

    14.0

    15.0

    6.7

    6

    F

    22

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    27.0

    38.5

    42.5

    7

    F

    29

    250

    25.0

    30.0

    35.8

    8

    F

    65
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    32

    8.6

    14.4

    41.5

    9

    F

    30

    100

    36.6

    48.6

    33.0

    10

    M

, 百拇医药     34

    250

    29.0

    40.0

    36.0

    11

    F

    48

    80

    22.6

    38.3

    69.4

    12

, http://www.100md.com     F

    42

    179

    10.0

    15.0

    29.3

    13

    F

    35

    74

    35.0

    50.7

    31.0

, 百拇医药     14

    M

    8

    200

    22.0

    29.0

    17.5

    15

    F

    34

    117

    17.3

    29.3

    21.0
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    16

    F

    40

    150

    18.0

    28.0

    75.5

    17

    F

    32

    197

    9.0

    17.0

, http://www.100md.com     47.0

    18

    F

    45

    43

    35.0

    53.0

    33.0

    19

    F

    30

    150

    14.0

    26.6
, 百拇医药
    12.8

    20

    M

    8

    300

    43.8

    53.6

    11.0±s

    31.7

    ± 21.5

    21.3

    ±2.4
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    30.8

    ±3.2

    33.3

    ±4.1

    2.3 GS与TPO、GS与IL-3诱导GATA蛋白与DNA结合活性 见图2。生长因子依赖细胞株MO7e经GS、TPO或IL-3分别单独刺激处理2 h后, 提取核蛋白作EMSA,结果显示GS与TPO或IL-3具有相似的作用,细胞核中GATA蛋白与DNA结 合活性增加,而出现特异性带密度增加(泳道2,3,5)。当GS+TPO(泳道4),或GS+IL-3(泳 道6)时,MO7e细胞核内的GATA蛋白与DNA结合活性进一步增高,均高于单用GS、TPO或IL-3 。提示GS与生长因子对诱导GATA蛋白活性具有协同作用。

, 百拇医药     图2 EMSA显示GS、TPO和IL-3诱导的GATA转录 调控蛋白与DNA结合的活性

    2.4 分析GS诱导的GATA蛋白与DNA结合复合物的成份 见图3。加抗人GATA-1(泳道 3),GATA-2(泳道 4)和GATA-3(泳道 5)抗体与 核蛋白起反应后作Supershift assay。结果显示GATA蛋白与DNA复合物主要被GATA-2抗体结 合,其分子量增大,使特异性带向上移动而密度减低,提示其主要成份为GATA-2转录因子 。

    2.5 GS、TPO和IL-3处理细胞后核内GATA-2蛋白含量 见图4。MO7e细胞经GS+TPO(泳道 4)或GS+IL-3(泳道 6)刺激处理后,Western Bolt显示核蛋白与GATA-2抗体结合反应带,经光密度扫描分析GS+TPO或GS+IL-3处理后GAT A-2转录蛋白含量高于未经处理的细胞及单用GS、TPO或IL-3,亦提示GS与生长因子的协同性。
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    图3 Supershift assay分析GS诱导GATA与DNA 复合物的主要成份为GATA-2

    MO7e细胞经GS、TPO或IL-3刺激处理2 h,1为未经处理,2为GS,3为TP O,4为GS+TPO,5为IL-3,6为GS+IL-3

    图4 Western Blot分析细胞核内GATA-2转录 因子蛋白含量

    3 讨论

    当骨髓细胞在无生长因子的培养条件下,基本上不能形成CFU-Meg集落,而GS 20 和50 μg/ml可使CFU-Meg集落从2.1分别提高到11.6和11.5/105细胞。当生 长因子与GS合用时,则GS 5~50 μg/ml能够提高集落产率20.1%~76.6%,这从细 胞水平说明GS刺激CFU-Meg增殖的作用具有类生长因子及与生长因子起协同的作用。
, 百拇医药
    ITP是一种自身免疫性疾病,其骨髓巨核细胞增生,伴有成熟障碍。由于免疫机制,导致血 小板减少。在GS刺激试验中,20例ITP患者的CFU-Meg培养平均提高率为33.3±4.1 %,其中有12例ITP患者的提高率大于30%(31.0%~75.5%),以上结果提示GS不但能 使正常的CFU-Meg增殖,而且ITP患者的CFU-Meg也对GS敏感。

    细胞内信号传递途径是近年来研究生长因子作用机理的重要手段,而转录因子GATA族蛋白GA GA-1、GATA-2和GATA-3在血细胞生成中的调控作用〔7〕,主要是介导对生长因子 的早期反应,而调控与细胞增殖分化等有关基因的表达。因此,本文试用研究生长因子的方 法来探讨GS的作用机理,假设GATA转录调控蛋白参与造血细胞对GS的反应。由于能取到的人 原代巨核系祖细胞的数量远远不足于作细胞内信号传递途径的研究,故选用生长因子依赖MO 7e细胞株,该细胞株必须依赖生长因子才能增殖存活的这个特性与正常造血祖细胞相似。经 GS、TPO或IL-3分别单独处理后,EMSA出现GATA蛋白与DNA复合物的特异性带。提示GS对血 细胞的作用涉及到GATA转录因子,GS具有与TPO或IL-3相似的细胞内信号传递途径。用Supe rshift assay分析GS诱导的GATA蛋白与DNA复合物的成份主要为GATA-2,同时用GATA-2抗 体作Western印迹法也表明了GS与TPO或IL-3的作用相似,能诱导核内GATA-2蛋白含量 增加。文献报道GATA-1与红细胞发育和巨核细胞分化有关;GATA-2调控基因对生长因子的 反应涉及到早期造血细胞的增殖;GATA-3主要见于胸腺和T淋巴细胞〔8〕。GATA-2 基因表达不仅在早期的红细胞,而且在多向潜能的造血细胞。在鸡的红系祖细胞,增加GATA -2基因表达可促进细胞增殖,而在GATA-2基因缺陷的小鼠则出现严重的早期造血功能障碍 〔9,10〕。本文的结果与这些研究相符,即GS通过GATA-2转录因子调控与增殖有关 等基因表达而促进造血祖细胞增殖。
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    设想GS对生长因子的协同作用可能比直接的作用更为重要。人骨髓CFU-Meg集落形成的GS刺 激试验,生长因子依赖MO7e细胞经GS+TPO或GS+IL-3刺激处理后,核内GATA转录调控蛋白与 DNA结合的活性,以及GATA-2蛋白的含量二者均高于单用GS、TPO或IL-3。这些结果支持了 这个假设,GS除了类生长因子作用外,尚有增强造血生长因子的协同作用。

     为中国和澳大利亚两国政府合作项目,获澳大利亚政府科研基金资助

    邮政编码:杭州,310006

    参考文献

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    ( 1998-06-24 收稿), http://www.100md.com