不同组织中DNA提取及其影响因素分析
作者：董明 袁媛 王建敏
单位：董明 袁媛(中国医科大学肿瘤研究所，沈阳 110001)；王建敏(沈阳市第八人民医院血库 110024)
关键词：DNA提取；血液；新鲜组织；冰冻组织
不同组织中DNA提取及其影响因素分析中国图书分类号 R342.3
文献标识码 A 文章编号 1001-7399(1999)02-0178-02
根据医疗科研的需要，我们分别从人全血、新鲜组织及OCT包埋冰冻组织中提取DNA，提取的方法各有不同，特别是我们自己摸索了一套提取OCT包埋冰冻组织DNA的方法。在实验过程中，分别总结了各方法的影响因素，供实验工作者应用时参考。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料来源 本实验所用外周血、新鲜组织及OCT包埋冰冻组织均采自胃癌手术患者。
1.2 外周血DNA的提取 采静脉血10 ml，加入细胞裂解液，离心弃上清，进一步溶解蛋白质后，置37℃水浴过夜，次日用酚/氯仿/异戊醇抽提2次，加3 mol.L-1醋酸钠及冷无水乙醇沉淀DNA，再用TE缓冲液溶解DNA，置-20℃冰箱储存备用。
1.3 新鲜组织DNA的提取 从新鲜离体胃手术标本上取胃粘膜组织约0.2 g，将其剪碎，加入DNA提取液(组织DNA提取液的有效成分为：Sucrose、20×SSC、10% SDS、500 mmol.L-1 EDTA)和蛋白酶K，置37℃水浴中振荡24 h，用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提2次，加入醋酸钠，冷无水乙醇沉淀DNA，再加入TE缓冲液使DNA溶解。次日用RNA酶作用3～4 h，重复抽提、沉淀DNA步骤，进一步纯化DNA。
, 百拇医药
1.4 OCT包埋冰冻组织DNA的提取
1.4.1 OCT的清除 从-20℃冰箱中取出冰冻组织块，置于盛有无菌TE缓冲液(pH 8.0)的小平皿中，待其逐渐溶化，用小镊子将肉眼可见的半透明OCT剔除，再尽量切除沾有OCT的组织，用无菌TE缓冲液反复冲洗3次，然后将组织剪碎并转移至离心管中。
1.4.2 粗提DNA 向上述离心管中加入DNA提取液5 ml混匀后，加0.7 ml蛋白酶K，置37℃水浴振荡24 h，次日加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，3?000 r.min-1离心10 min，反复此过程后加入3 mol*L-1醋酸钠及冷无水乙醇沉淀DNA，用TE缓冲液溶解DNA后，置4℃冰箱暂存。
1.4.3 去除RNA 向含有DNA粗提物的离心管中加入RNA酶12 μl,置37℃水浴中震荡3～4 h。
, http://www.100md.com
1.4.4 纯化DNA 从37℃水浴中取出离心管，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液混匀，3000 r.min-1，离心10 min，移上层液体至新离心管中，重复上步至除尽蛋白，加入3 mol.L-1醋酸钠及无水乙醇，见形成絮状物后弃上清，用70%乙醇洗DNA 2次，空气干燥5 min，加入适当体积TE缓冲液，置4℃冰箱保存。
1.5 DNA含量测定及琼脂糖电泳
2 结果
经UV-260紫外分光光度计检测，从全血中提取人类基因组DNA，平均100 ml全血可提取200～300 μg DNA；新鲜组织及OCT包埋冰冻组织提取DNA，平均0.2 g组织可获得200～300 μg DNA。波峰描记在波长260 nm(从260 nm向190 nm描记)处出现主峰。0.8%琼脂糖凝胶电泳显示DNA条带均匀。OCT包埋冰冻组织与新鲜组织及全血提取的DNA电泳结果相比基本一致(图1)。
, 百拇医药
图1 DNA琼脂糖凝胶电泳图
No.1～6新鲜组织
No.7～11 OCT包埋组织
3 讨论
从不同组织中提取DNA，方法有所不同。实际应用中，某些因素对提取DNA的成功至关重要。从全血中提取DNA时，裂解血细胞使用液体为Sucrose细胞溶解液，配制时应每加完一种药物，使用磁力搅拌器充分搅拌均匀，待药品全部加完后，继续搅 拌1 h，置室温12 h以上方可使用。切忌使用刚配制完的Sucrose细胞溶解液。用储存于4℃冰箱中的细胞溶解液时，注意先将其置37℃温箱预热40 min。
在提取新鲜组织DNA时，若使用4℃冰箱保存2个月以上的饱和酚溶液，其上层缓冲液的pH往往有所下降，注意应用等体积1.0 mol.L-1 Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液置换液体酚数次，直至上层缓冲液pH>7.6。
, 百拇医药
以往从组织中提取DNA，常用手术离体后短时间内未经任何化学试剂处理的新鲜标本。由于取材受客观条件的限制，实验进度受到一定影响。我们利用保存于-20℃冰箱2年以上、曾经用于免疫组化研究剩余的OCT包埋冰冻组织块提取DNA，并进一步将其应用于分子杂交实验，获得较为满意的结果。
OCT是一种固形剂，用其包埋组织，进行冰冻切片。在使用OCT包埋冰冻组织提取DNA时，首先要耐心细致的用小镊子剔除肉眼可见的半透明OCT，必要时用手术刀片切除沾有OCT的组织，再用无菌TE缓冲液反复冲洗冰冻组织块，以去除残余OCT分子，避免OCT的微量存在而影响DNA纯度。
作者简介：董明，女，42岁，主管技师。
收稿日期：1998-06-26
修回日期：1998-12-02, http://www.100md.com
单位：董明 袁媛(中国医科大学肿瘤研究所，沈阳 110001)；王建敏(沈阳市第八人民医院血库 110024)
关键词：DNA提取；血液；新鲜组织；冰冻组织
不同组织中DNA提取及其影响因素分析中国图书分类号 R342.3
文献标识码 A 文章编号 1001-7399(1999)02-0178-02
根据医疗科研的需要，我们分别从人全血、新鲜组织及OCT包埋冰冻组织中提取DNA，提取的方法各有不同，特别是我们自己摸索了一套提取OCT包埋冰冻组织DNA的方法。在实验过程中，分别总结了各方法的影响因素，供实验工作者应用时参考。
1 材料与方法
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1.1 材料来源 本实验所用外周血、新鲜组织及OCT包埋冰冻组织均采自胃癌手术患者。
1.2 外周血DNA的提取 采静脉血10 ml，加入细胞裂解液，离心弃上清，进一步溶解蛋白质后，置37℃水浴过夜，次日用酚/氯仿/异戊醇抽提2次，加3 mol.L-1醋酸钠及冷无水乙醇沉淀DNA，再用TE缓冲液溶解DNA，置-20℃冰箱储存备用。
1.3 新鲜组织DNA的提取 从新鲜离体胃手术标本上取胃粘膜组织约0.2 g，将其剪碎，加入DNA提取液(组织DNA提取液的有效成分为：Sucrose、20×SSC、10% SDS、500 mmol.L-1 EDTA)和蛋白酶K，置37℃水浴中振荡24 h，用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提2次，加入醋酸钠，冷无水乙醇沉淀DNA，再加入TE缓冲液使DNA溶解。次日用RNA酶作用3～4 h，重复抽提、沉淀DNA步骤，进一步纯化DNA。
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1.4 OCT包埋冰冻组织DNA的提取
1.4.1 OCT的清除 从-20℃冰箱中取出冰冻组织块，置于盛有无菌TE缓冲液(pH 8.0)的小平皿中，待其逐渐溶化，用小镊子将肉眼可见的半透明OCT剔除，再尽量切除沾有OCT的组织，用无菌TE缓冲液反复冲洗3次，然后将组织剪碎并转移至离心管中。
1.4.2 粗提DNA 向上述离心管中加入DNA提取液5 ml混匀后，加0.7 ml蛋白酶K，置37℃水浴振荡24 h，次日加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，3?000 r.min-1离心10 min，反复此过程后加入3 mol*L-1醋酸钠及冷无水乙醇沉淀DNA，用TE缓冲液溶解DNA后，置4℃冰箱暂存。
1.4.3 去除RNA 向含有DNA粗提物的离心管中加入RNA酶12 μl,置37℃水浴中震荡3～4 h。
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1.4.4 纯化DNA 从37℃水浴中取出离心管，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液混匀，3000 r.min-1，离心10 min，移上层液体至新离心管中，重复上步至除尽蛋白，加入3 mol.L-1醋酸钠及无水乙醇，见形成絮状物后弃上清，用70%乙醇洗DNA 2次，空气干燥5 min，加入适当体积TE缓冲液，置4℃冰箱保存。
1.5 DNA含量测定及琼脂糖电泳
2 结果
经UV-260紫外分光光度计检测，从全血中提取人类基因组DNA，平均100 ml全血可提取200～300 μg DNA；新鲜组织及OCT包埋冰冻组织提取DNA，平均0.2 g组织可获得200～300 μg DNA。波峰描记在波长260 nm(从260 nm向190 nm描记)处出现主峰。0.8%琼脂糖凝胶电泳显示DNA条带均匀。OCT包埋冰冻组织与新鲜组织及全血提取的DNA电泳结果相比基本一致(图1)。
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图1 DNA琼脂糖凝胶电泳图
No.1～6新鲜组织
No.7～11 OCT包埋组织
3 讨论
从不同组织中提取DNA，方法有所不同。实际应用中，某些因素对提取DNA的成功至关重要。从全血中提取DNA时，裂解血细胞使用液体为Sucrose细胞溶解液，配制时应每加完一种药物，使用磁力搅拌器充分搅拌均匀，待药品全部加完后，继续搅 拌1 h，置室温12 h以上方可使用。切忌使用刚配制完的Sucrose细胞溶解液。用储存于4℃冰箱中的细胞溶解液时，注意先将其置37℃温箱预热40 min。
在提取新鲜组织DNA时，若使用4℃冰箱保存2个月以上的饱和酚溶液，其上层缓冲液的pH往往有所下降，注意应用等体积1.0 mol.L-1 Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液置换液体酚数次，直至上层缓冲液pH>7.6。
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以往从组织中提取DNA，常用手术离体后短时间内未经任何化学试剂处理的新鲜标本。由于取材受客观条件的限制，实验进度受到一定影响。我们利用保存于-20℃冰箱2年以上、曾经用于免疫组化研究剩余的OCT包埋冰冻组织块提取DNA，并进一步将其应用于分子杂交实验，获得较为满意的结果。
OCT是一种固形剂，用其包埋组织，进行冰冻切片。在使用OCT包埋冰冻组织提取DNA时，首先要耐心细致的用小镊子剔除肉眼可见的半透明OCT，必要时用手术刀片切除沾有OCT的组织，再用无菌TE缓冲液反复冲洗冰冻组织块，以去除残余OCT分子，避免OCT的微量存在而影响DNA纯度。
作者简介：董明，女，42岁，主管技师。
收稿日期：1998-06-26
修回日期：1998-12-02, http://www.100md.com