氟对大鼠脑组织中一氧化氮合成酶活性的影响
作者：徐顺清 舒柏华 陈志飞
单位：徐顺清 舒柏华(同济医科大学 环境医学研究所， 湖北 武汉 430030)；陈志飞(武汉市结核病防治所， 430030)
关键词：氟化物；一氧化氮合成酶；神经毒
中国地方病学杂志990203
【摘要】 目的 为研究氟对神经系统的作用机理。方法 利用化学发光分析技术测定大鼠脑组织中的一氧化氮合成酶的活性。结果 氟暴露大鼠脑组织中NOS活性明显高于对照组，直接在NOS反应液中加入氟化钠，NOS活性亦增加，而且这种增强作用能被一氧化氮合成酶的抑制剂L-硝基精氨酸所阻断。结论 无论在体内还是体外，氟能使一氧化氮合成酶的活性增高。
分类号：R599.9 文献标识码：A 论文编号：1000-4955(1999)02-0087—89
, 百拇医药
Effects of fluoride on activities of nitric oxide synthase in rat brain
XU Shunqing,SHU Baihua,CHEN Zhifei
Institute of Environmental Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To study the mechanism of neurotoxicity of fluoride.Methods The activities of nitric oxide synthase (NOS) from rat brain were determined by chemiluminescent method.Results The activities of NOS from the rats exposed to fluoride sodium were significantly higher than that of cantrao rats.When fluoride sodium was added to NOS,the increase in activities of NOS were observed.The increase of activities of NOS can be inhibited by NG-Nitiol-L-Arginine,a inhibitor of nitric oxide synthase.Conclusions Fluoride can enhance the activities of NOS in rat brain.
, 百拇医药
【Key words】 Fluoride Nitric oxide synthase Neurotoxicity
一氧化氮(nitric oxide,NO)是近年来发现的一种“气体样”信息分子，NO在神经系统、免疫系统及心血管系统中都具有极为重要的生物学作用[1～3]。体内的一氧化氮均由一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)催化合成。哺乳动物神经系统组织中主要含有结构型NOS，存在于神经元的细胞浆中，是一种胞浆酶。该酶分子上存在有钙调蛋白(Calmodulin,CaM)、NADPH、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黄素单核苷酸(FMN)等辅助因子的结合位点。在Ca2+和这些辅助因子的共同作用下，NOS可被激活，激活的NOS可使L-精氨酸(L-Arginine,L-Arg)分子中的胍基氮氧化脱落，生成NO和等当量的瓜氨酸。
氟对哺乳动物的神经系统有明显的影响，高文华等研究表明，氟可抑制大鼠脑突触膜ATPase活性[4]。为探讨氟对神经系统的作用及其机理，本文将定量研究氟对大鼠脑组织中NOS活性的影响。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂 L-Arg，L-硝基精氨酸(N-G-Nitro-L-Arginine,L-NNA)，还原型辅酶Ⅱ(β-NADPH),CaM,FAD,FMN,亮肽素(leupeptin),苯甲基黄酰氟(Phenylmethylsulphonyl Fluoride,PMSF)，抑凝乳蛋白酶素(Chemostatin)，大豆胰蛋白抑制剂(Soybean Trypsin Inhibitior,STI)，去铁乙胺(Desferroxamine),HEPES均购自SIGMA公司，二硫苏糖醇(Dithiothreitol)为Fluka公司产品。超氧化物歧化酶(SOD)为中科院上海生化所产品，鲁米诺(Luminol)为SERVA公司产品，NO气体由北京氦普气体工业有限公司提供。
1.2 实验动物处理 选用成年雄性SD大鼠(体重200～250g,由同济医科大学实验动物中心提供)，随机分为A、B、C、D 4组。A组腹腔注射生理盐水；B组腹腔注射氟化钠(每日5mg/kg体重)；C组腹腔注射L-NNA(每日25mg/kg体重)；D组腹腔注射L-NNA(每日25mg/kg体重)和氟化钠(5mg/kg体重)。给药3天后，断头处死动物，迅速取脑并在冰盒上分离待测脑区(大脑皮层、海马和小脑)，将其分装于液氮中冻存。
, 百拇医药
1.3 组织匀浆液的配制 50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)内含：蔗糖(0.32mol/L)、EDTA(1mmol/L)、Dithiothreitol(1mmol/L)、Leupeptin(2mg/L)、Chemostatin(5mg/L)、STI(5mg/L)、PMSF(10mg/L),4℃冰箱储存备用。
1.4 酶反应液的配制 50mmol/L的HEPES缓冲液(pH7.4)含有：NADPH(1mmol/L)、Dithiothreitol(1mmol/L)、CaCl2(1.25mmol/L)、CaM(10mg/L)、EDTA(1mmol/L)、L-Arg(2mmol/L)及一定量的FAD和FMN，4℃冰箱储存备用[5]。
1.5 发光液的配制 用2mmol/L碳酸缓冲液配制Luminol溶液，其中含有0.018mmol/L的Luminol、0.15mmol/L的Desferoxmine、临用前加入10mmol/L的H2O2[6]。
, 百拇医药
1.6 NOS活性的测定 将液氮中的脑组织样本取去融化，切取部分组织样本，加入适量的组织匀浆液，用匀浆器在冰浴中匀浆，用Lowery氏法测定匀浆液中的蛋白质含量。取匀浆液1ml离心(20000g,4℃)30min,取上清部分测定NOS活性。取上清液100μl和300μl酶反应液加入发光管中，37℃温浴15min后将其置于LKB1251型发光测试仪内，再从加样孔中注入发光试剂400μl，记录6s累计发光值。根据样本所测的发光值，从NO发光标准曲线查出所相当的NO浓度，然后根据样本量及样本中的蛋白质含量及酶触反应时间计算出NOS活性(pmol NO/mg pr/min)。
2 结果
2.1 氟对NOS活性的影响 4组大鼠脑组织NOS活性如表1所示，B组(氟化钠)大鼠的脑组织NOS活性高于A组(生理盐水)，二者之间差异有显著性意义(P<0.05)。
2.2 NOS抑制剂的影响 为探讨氟对NOS活性影响的机理，C组动物同时给予氟化钠和NOS抑制剂L-NNA，结果显示(表1)，C组的NOS活性显著低于B组(氟化钠组)，二者之间的差异有显著性意义(P<0.05)。
, 百拇医药
表1 氟对NOS活性的影响及L-NNA的干预作用 分组
样本数
NOS活性
A
5
17.6±3.8
B
5
23.4±4.2*
C
5
12.6±2.9
, 百拇医药
D
5
16.6±3.5#
注：*与A组比较，P<0.05;#与B组比较，P<0.05
2.3 体外氟对NOS活性的影响及L-NNA的阻断作用 在分离出的含NOS的匀浆上清液中分别加入不同的受试物，1h后测定NOS活性。结果显示(表2)，在体外，氟化钠也能使脑组织NOS活性增高(P<0.05)。在体外同时加入L-NNA和NaF，其NOS活性较仅加入NaF者有所降低，二者之间的差异有显著性意义(P<0.05)。
表2 体外氟对NOS的影响及L-NNA的干预作用 加入物
样本数
NOS活性
, 百拇医药
生理盐水
5
15.3±38
NaF(5mg/L)
5
18.6±4.0*
L-NNA(25mg/L)
5
12.3±2.5
L-NNA(25mg/L)+NaF(5mg/L)
5
14.1±3.3#
, 百拇医药
注：*与生理盐水比较，P<0.05;#与NaF比较，P<0.05
3 讨论
NO在神经系统中起着十分重要的作用，NO能起神经递质样作用，引起细胞内cGMP升高，产生生理效应。NO不仅能介导神经兴奋性传导，而且对小脑、海马等神经元突触和神经网络的构建产生重要影响。NO还参与一些物质对神经细胞的毒性作用。对NO作用机理的研究能阐明许多过去未能解释的生理和病理显现。
氟对哺乳动物的神经系统具有毒性作用，氟骨症的某些症状可能与氟的神经毒性有关，对氟的神经毒性机理目前仍研究很少。本文的研究结果表明，氟对引起大鼠脑组织NOS活性增高，且这种增高作用能被NOS抑制剂L-NNA所阻断。这说明氟在一定程度上可能引起中枢神经的兴奋；此外，NO对大脑的学习和记忆功能也有重要作用。Kayaya等研究表明[7]，氟能引起大鼠神经胶质瘤细胞产生cGMP增加，这一作用也可能是通过增加NOS活性而产生的。由氟所引起的脑组织NOS活性增高所带来的毒性作用仍不清楚，有待于进一步研究。
, http://www.100md.com
作者简介：徐顺清，男，1967年生，副教授
参考文献
[1] Komori K,Lorenz RR,Vanboutte PM.Nitric oxide,Ach and mechanical properties of canine arterial smooth muscle[J].Am J Physiol,1988,255(2):207
[2] Garthwaitc J,Charles SL,Williams RC,et al.Endothelium-derived relaxing factor release on activation of NMDA receptors suggest role as intercellular messenger in the brain[J].Nature,1988,336(24):385
, 百拇医药
[3] Knowles RG,Palacios M,Palmer RMJ,et al.Kinetic characteristics of nitric oxide synthase from rat brain[J].Biochem J,1990(2):216
[4] 高文华，赵西龙，赵忠良，等.氟化物对大鼠脑突触膜Ca2+、Ma2+-ATPase活性影响的研究[J].氟研究通讯，1993，8(1):59
[5] Rengasamy A,Johns RA.Characterization of endothelium relaxing factor/nitric oxide synthase from bovine cerebellum and mechanism of modulation by low and high oxygentension[J].J Pharmacol Exp Ther,1991,259(3):310
[6] 徐顺清，舒柏华，周宜开，等.化学发光法测定脑组织中一氧化氮合成酶活性[J].中国卫生检验杂志，1997,7(3):131
[7] Kayaya A,Uchitomi Y,Kuyaya A,et al.Differential regulation of intercellular signaling system by sodium fluoride in rat glioma cells[J].J Neurochem,1996,61(4):1483
收稿日期：1998-09-16；修订日期1998-10-04, 百拇医药
单位：徐顺清 舒柏华(同济医科大学 环境医学研究所， 湖北 武汉 430030)；陈志飞(武汉市结核病防治所， 430030)
关键词：氟化物；一氧化氮合成酶；神经毒
中国地方病学杂志990203
【摘要】 目的 为研究氟对神经系统的作用机理。方法 利用化学发光分析技术测定大鼠脑组织中的一氧化氮合成酶的活性。结果 氟暴露大鼠脑组织中NOS活性明显高于对照组，直接在NOS反应液中加入氟化钠，NOS活性亦增加，而且这种增强作用能被一氧化氮合成酶的抑制剂L-硝基精氨酸所阻断。结论 无论在体内还是体外，氟能使一氧化氮合成酶的活性增高。
分类号：R599.9 文献标识码：A 论文编号：1000-4955(1999)02-0087—89
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Effects of fluoride on activities of nitric oxide synthase in rat brain
XU Shunqing,SHU Baihua,CHEN Zhifei
Institute of Environmental Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To study the mechanism of neurotoxicity of fluoride.Methods The activities of nitric oxide synthase (NOS) from rat brain were determined by chemiluminescent method.Results The activities of NOS from the rats exposed to fluoride sodium were significantly higher than that of cantrao rats.When fluoride sodium was added to NOS,the increase in activities of NOS were observed.The increase of activities of NOS can be inhibited by NG-Nitiol-L-Arginine,a inhibitor of nitric oxide synthase.Conclusions Fluoride can enhance the activities of NOS in rat brain.
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【Key words】 Fluoride Nitric oxide synthase Neurotoxicity
一氧化氮(nitric oxide,NO)是近年来发现的一种“气体样”信息分子，NO在神经系统、免疫系统及心血管系统中都具有极为重要的生物学作用[1～3]。体内的一氧化氮均由一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)催化合成。哺乳动物神经系统组织中主要含有结构型NOS，存在于神经元的细胞浆中，是一种胞浆酶。该酶分子上存在有钙调蛋白(Calmodulin,CaM)、NADPH、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黄素单核苷酸(FMN)等辅助因子的结合位点。在Ca2+和这些辅助因子的共同作用下，NOS可被激活，激活的NOS可使L-精氨酸(L-Arginine,L-Arg)分子中的胍基氮氧化脱落，生成NO和等当量的瓜氨酸。
氟对哺乳动物的神经系统有明显的影响，高文华等研究表明，氟可抑制大鼠脑突触膜ATPase活性[4]。为探讨氟对神经系统的作用及其机理，本文将定量研究氟对大鼠脑组织中NOS活性的影响。
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1 材料与方法
1.1 试剂 L-Arg，L-硝基精氨酸(N-G-Nitro-L-Arginine,L-NNA)，还原型辅酶Ⅱ(β-NADPH),CaM,FAD,FMN,亮肽素(leupeptin),苯甲基黄酰氟(Phenylmethylsulphonyl Fluoride,PMSF)，抑凝乳蛋白酶素(Chemostatin)，大豆胰蛋白抑制剂(Soybean Trypsin Inhibitior,STI)，去铁乙胺(Desferroxamine),HEPES均购自SIGMA公司，二硫苏糖醇(Dithiothreitol)为Fluka公司产品。超氧化物歧化酶(SOD)为中科院上海生化所产品，鲁米诺(Luminol)为SERVA公司产品，NO气体由北京氦普气体工业有限公司提供。
1.2 实验动物处理 选用成年雄性SD大鼠(体重200～250g,由同济医科大学实验动物中心提供)，随机分为A、B、C、D 4组。A组腹腔注射生理盐水；B组腹腔注射氟化钠(每日5mg/kg体重)；C组腹腔注射L-NNA(每日25mg/kg体重)；D组腹腔注射L-NNA(每日25mg/kg体重)和氟化钠(5mg/kg体重)。给药3天后，断头处死动物，迅速取脑并在冰盒上分离待测脑区(大脑皮层、海马和小脑)，将其分装于液氮中冻存。
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1.3 组织匀浆液的配制 50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)内含：蔗糖(0.32mol/L)、EDTA(1mmol/L)、Dithiothreitol(1mmol/L)、Leupeptin(2mg/L)、Chemostatin(5mg/L)、STI(5mg/L)、PMSF(10mg/L),4℃冰箱储存备用。
1.4 酶反应液的配制 50mmol/L的HEPES缓冲液(pH7.4)含有：NADPH(1mmol/L)、Dithiothreitol(1mmol/L)、CaCl2(1.25mmol/L)、CaM(10mg/L)、EDTA(1mmol/L)、L-Arg(2mmol/L)及一定量的FAD和FMN，4℃冰箱储存备用[5]。
1.5 发光液的配制 用2mmol/L碳酸缓冲液配制Luminol溶液，其中含有0.018mmol/L的Luminol、0.15mmol/L的Desferoxmine、临用前加入10mmol/L的H2O2[6]。
, 百拇医药
1.6 NOS活性的测定 将液氮中的脑组织样本取去融化，切取部分组织样本，加入适量的组织匀浆液，用匀浆器在冰浴中匀浆，用Lowery氏法测定匀浆液中的蛋白质含量。取匀浆液1ml离心(20000g,4℃)30min,取上清部分测定NOS活性。取上清液100μl和300μl酶反应液加入发光管中，37℃温浴15min后将其置于LKB1251型发光测试仪内，再从加样孔中注入发光试剂400μl，记录6s累计发光值。根据样本所测的发光值，从NO发光标准曲线查出所相当的NO浓度，然后根据样本量及样本中的蛋白质含量及酶触反应时间计算出NOS活性(pmol NO/mg pr/min)。
2 结果
2.1 氟对NOS活性的影响 4组大鼠脑组织NOS活性如表1所示，B组(氟化钠)大鼠的脑组织NOS活性高于A组(生理盐水)，二者之间差异有显著性意义(P<0.05)。
2.2 NOS抑制剂的影响 为探讨氟对NOS活性影响的机理，C组动物同时给予氟化钠和NOS抑制剂L-NNA，结果显示(表1)，C组的NOS活性显著低于B组(氟化钠组)，二者之间的差异有显著性意义(P<0.05)。
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表1 氟对NOS活性的影响及L-NNA的干预作用 分组
样本数
NOS活性
A
5
17.6±3.8
B
5
23.4±4.2*
C
5
12.6±2.9
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D
5
16.6±3.5#
注：*与A组比较，P<0.05;#与B组比较，P<0.05
2.3 体外氟对NOS活性的影响及L-NNA的阻断作用 在分离出的含NOS的匀浆上清液中分别加入不同的受试物，1h后测定NOS活性。结果显示(表2)，在体外，氟化钠也能使脑组织NOS活性增高(P<0.05)。在体外同时加入L-NNA和NaF，其NOS活性较仅加入NaF者有所降低，二者之间的差异有显著性意义(P<0.05)。
表2 体外氟对NOS的影响及L-NNA的干预作用 加入物
样本数
NOS活性
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生理盐水
5
15.3±38
NaF(5mg/L)
5
18.6±4.0*
L-NNA(25mg/L)
5
12.3±2.5
L-NNA(25mg/L)+NaF(5mg/L)
5
14.1±3.3#
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注：*与生理盐水比较，P<0.05;#与NaF比较，P<0.05
3 讨论
NO在神经系统中起着十分重要的作用，NO能起神经递质样作用，引起细胞内cGMP升高，产生生理效应。NO不仅能介导神经兴奋性传导，而且对小脑、海马等神经元突触和神经网络的构建产生重要影响。NO还参与一些物质对神经细胞的毒性作用。对NO作用机理的研究能阐明许多过去未能解释的生理和病理显现。
氟对哺乳动物的神经系统具有毒性作用，氟骨症的某些症状可能与氟的神经毒性有关，对氟的神经毒性机理目前仍研究很少。本文的研究结果表明，氟对引起大鼠脑组织NOS活性增高，且这种增高作用能被NOS抑制剂L-NNA所阻断。这说明氟在一定程度上可能引起中枢神经的兴奋；此外，NO对大脑的学习和记忆功能也有重要作用。Kayaya等研究表明[7]，氟能引起大鼠神经胶质瘤细胞产生cGMP增加，这一作用也可能是通过增加NOS活性而产生的。由氟所引起的脑组织NOS活性增高所带来的毒性作用仍不清楚，有待于进一步研究。
, http://www.100md.com
作者简介：徐顺清，男，1967年生，副教授
参考文献
[1] Komori K,Lorenz RR,Vanboutte PM.Nitric oxide,Ach and mechanical properties of canine arterial smooth muscle[J].Am J Physiol,1988,255(2):207
[2] Garthwaitc J,Charles SL,Williams RC,et al.Endothelium-derived relaxing factor release on activation of NMDA receptors suggest role as intercellular messenger in the brain[J].Nature,1988,336(24):385
, 百拇医药
[3] Knowles RG,Palacios M,Palmer RMJ,et al.Kinetic characteristics of nitric oxide synthase from rat brain[J].Biochem J,1990(2):216
[4] 高文华，赵西龙，赵忠良，等.氟化物对大鼠脑突触膜Ca2+、Ma2+-ATPase活性影响的研究[J].氟研究通讯，1993，8(1):59
[5] Rengasamy A,Johns RA.Characterization of endothelium relaxing factor/nitric oxide synthase from bovine cerebellum and mechanism of modulation by low and high oxygentension[J].J Pharmacol Exp Ther,1991,259(3):310
[6] 徐顺清，舒柏华，周宜开，等.化学发光法测定脑组织中一氧化氮合成酶活性[J].中国卫生检验杂志，1997,7(3):131
[7] Kayaya A,Uchitomi Y,Kuyaya A,et al.Differential regulation of intercellular signaling system by sodium fluoride in rat glioma cells[J].J Neurochem,1996,61(4):1483
收稿日期：1998-09-16；修订日期1998-10-04, 百拇医药