金属硫蛋白的研究进展
作者：赵京山 佟晓旭 尹桂山
单位：河北医科大学基础医学院生物化学教研室(石家庄 050017)
关键词：金属硫蛋白/生理学；金属硫蛋白/代谢；肿瘤/代谢
河北医科大学学报990244
中图号 R151.2
金属硫蛋白(metallothioneine,MT)是一种富含金属(Ag、Au、Bi、Cd、Hg、Zn等)和半胱氨酸的低分子质量的蛋白质,MT在体内被金属和其它因素诱导而合成,具有重要的生物学功能。它与微量元素的代谢、自由基的清除以及肿瘤等疾病的发生、预防和治疗有关,金属硫蛋白是近年来研究的热门课题之一,本文旨在概述MT的生理功能及研究进展。
1 理化性质特点
, http://www.100md.com
MT是一种相对分子质量较小(6 000～7 000ku),富含半胱氨酸的非酶蛋白质,其内含有大量的Cd、Cu、Zn、Hg、Au、Bi等,氨基酸组成为无芳香族氨基酸及组氨酸残基[1]。人、马、兔、鼠的MT基因已经克隆测序,其N端和C端分别为乙酰甲硫氨酸和丙氨酸,半胱氨酸的分布具有严格的相似性,令人惊奇的是在粗脉苞菌分离出来的MT虽然分子量较小,但基本结构与哺乳动物相似,这说明MT的基因在生物进化过程中较为保守。MT中的金属可脱去,去金属的硫蛋白在低pH值时较稳定。使各种金属硫蛋白50%的金属离子发生解离的pH值分别为:Zn-MT为3.5～4.5;Cd-MT为2.5～3.5;Cu-MT的pH低于1。因MT缺乏芳香族氨基酸,故无280 nm处的吸收峰,而具有与金属有关的吸收峰,不同的MT具有不同的吸收峰,据此可鉴定不同的MT,去金属的MT在190 nm处有一吸收峰。
无论是自然产生还是诱导产生的MT,其氨基酸组成基本相同,主要不同在于所含金属和金属的含量。Gunar用CdCl2注射大白鼠[2],Bremner分别用CuSO4和ZnSO4注射大白鼠诱导产生MT[3],他们对所得到的MT分别进行了分析,结果表明所有MT具有以下特征:①相对分子质量低;②含30%半胱氨酸且无芳香族氨基酸;③巯基与金属比例为3∶1,也有报道为2∶1或4∶1;④金属含量高,每mol含6个金属原子。
, 百拇医药
2 生理功能
2.1 参与微量元素的代谢及重金属的解毒:不同种属,不同组织来源的MT具有相似氨基酸顺序,并且金属离子与半胱氨酸的配位位置严格固定,提示该蛋白与金属离子有强大的螯合力,说明该蛋白与金属离子的代谢具有重要关系[4]。大白鼠饥饿后肝中Zn-MT含量增加,说明它参与Zn的正常代谢。MT可调节小肠对Cu、Zn等金属的吸收,MT的降解以及结合于其上的金属丢失、蓄积常会导致与某些金属元素有关的疾病,如Wilson病和Menkes病。通过研究,人们怀疑MT可能是Cd的运载蛋白,因它与Cd的亲和力特别强。
2.2 清除自由基:近年来,学者们注意到MT对自由基有非常强的清除作用,有以下事实:在细胞培养时若培养液中含有一定量的MT,对辐射损伤有一定的抵制作用。预先向肝细胞培养液中加入Zn,诱导产生MT,可保护3-甲基吲哚诱发的过氧化损伤。张保弦等的实验证明[5],CCl4在鼠肝代谢产生的CCl3O·2等自由基对肝的损伤作用,可因MT含量增加而得到有效的缓解。Cd-MT、Zn-MT能清除离体黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统所产生的·OH-自由基,也能清除产生的超氧负离子(·O-),但能力较差。
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2.3 参与应激反应:研究发现各种应激状态,例如电击、寒冷、高温、过度疲劳、饥饿等均可引起MT含量生高,同时发现与应激有关的糖皮质激素、肾上腺素等含量增加时,MT的含量也增加。我室利用中药调整大鼠的应激反应实验结果证明[6],MT确与应激反应有关,应激状态下MT含量增加,给予中药缓解应激状态,MT含量降低。
2.4 与肿瘤的关系:近年来的研究发现,一些肿瘤组织中MT含量增加,已在甲状腺癌、睾丸胚胎癌、膀胱癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、结肠癌等组织中观察到MT的过度表达。致癌过程中MT的表达与肿瘤的迅速生长、致癌物质的刺激、癌基因的激活有关。镉是动物和人类的致癌物,啮齿类动物吸入镉蒸气时,肺组织MT的增加与暴露频率相平行。化学致癌物乙基甲硝基脲可激活体外培养的S 49细胞MT基因的表达。肿瘤患者给予γ射线治疗时,骨髓、肝脏和淋巴细胞中MT的增加与累积暴露剂量有关。Ras基因的激活与多种肿瘤启动有关,将c-Ha-ras转染NIH3T3细胞,可激活MT的表达[7],研究发现该基因的激活发生在转录水平。
, 百拇医药
肿瘤细胞的耐药性是肿瘤化疗的主要障碍,对其机制的解释概括为细胞内药物蓄积减少,DNA修复能力增加和细胞解毒体含巯基分子的过量表达。细胞内含巯基的蛋白主要以MT为主,故MT在肿瘤抗药,尤其抗氯氨顺铂(CDDP)的作用受到重视。Lazo及其同事用ELISA检测了10个肿瘤细胞系MT的含量,发现凡MT含量增高的均显示出对烷化剂和CDDP的抗性。诱导细胞使其获得对CDDP的抗性,伴随MT水平的增加,而当细胞抗药表型逆转时,MT水平随之下降。最近,有人用靶向破坏MT基因的方法获得小鼠的胚胎纤维细胞,经CdCl2诱导,该细胞完全无MT表达,与对照细胞比较,对抗肿瘤药的敏感性增高[8]。
在肿瘤的预防和治疗中,MT可保护细胞抵抗重金属和烷化剂的致癌、致突变作用,MT还可用于肿瘤临床的辅助治疗和用作肿瘤标志物。这些都是目前学者们感兴趣的课题。
3 检测方法
, 百拇医药 目前检测MT的方法很多,大致可归为4类:①金属亲和分析法,即测定结合金属以计算MT含量,如Cd血红素饱和法、银饱和法、凝胶电泳和银染色法;②电化学法,即测定巯基以计算MT含量,如微分脉冲和循环伏安法;③蛋白分析法如放射免疫分析法(RIA);④色谱分析法。
选择MT测定方法的依据为:灵敏度高,特异性强,在上述方法中RIA灵敏度最高,极限为100 pg,是目前唯一能测出体液MT含量的方法,Thmos等的实验已证明这点[9]。其它方法仍适合于检测大多数组织中MT的含量。银染色法的极限值为50 ng,液相色谱法、电化学法、金属饱和分析法、银饱和法等方法的检出极限值为1 μg。
影响MT检测的因素也很多,主要有以下几点:①大量的非MT蛋白和非MT蛋白/MT蛋白的高比率会影响MT的检测。②生物体内MT的同分异构体的存在会影响免疫分析的结果。③金属与MT的结合也是选择MT检测方法时应考虑的一个因素。
, 百拇医药
参考文献
1.Kagi JHR.Metallothionein proceeding of the first international meeting metallothionein and other molecular weight metal binding protein.Experientia,1979,12(3):17
2.Gunnar.Seperate of two forms of rabbits MT by isoelectric focusing.Biochemistry J,1972,126(7):491
3.Bremner.Isolation of (copper,zinc)-thioneins from the liver of coppper-injection.Biochem J,1976,157(9):517
, 百拇医药
4.Kagi JHR.Metallothionein proceeding of the second international meeting metallothionein and other molecular weight metal binding protein.Experientia,1985,18(4):21
5.张宝弘.大鼠再生肝抗四氯化碳损伤作用与金属硫蛋白.北京医科大学学报,1990,24(6):425
6.赵晓林.滋补肝肾方药对应激大鼠的调整作用.中国中医基础医学杂志,1995,56(2):30
7.Schmid CJ,Hamar DH.Cell specificity and an effect of ras on human metallothionein gene expression.Proc Natl Acad Sci USA,1986,83(10):3346
8.Kondo Y,Woo ES,Michalska AE,et al.Metallothionein null cells have increased sensitivity to anticancer drugs.Cancer Res,1995,55(8):2021
9.Thmos OG.Fluorometric ELIS for the detection and quantitation of MT. J Immunl Methods,1986,89(7):239
(1997-07-22 收稿), 百拇医药
单位：河北医科大学基础医学院生物化学教研室(石家庄 050017)
关键词：金属硫蛋白/生理学；金属硫蛋白/代谢；肿瘤/代谢
河北医科大学学报990244
中图号 R151.2
金属硫蛋白(metallothioneine,MT)是一种富含金属(Ag、Au、Bi、Cd、Hg、Zn等)和半胱氨酸的低分子质量的蛋白质,MT在体内被金属和其它因素诱导而合成,具有重要的生物学功能。它与微量元素的代谢、自由基的清除以及肿瘤等疾病的发生、预防和治疗有关,金属硫蛋白是近年来研究的热门课题之一,本文旨在概述MT的生理功能及研究进展。
1 理化性质特点
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MT是一种相对分子质量较小(6 000～7 000ku),富含半胱氨酸的非酶蛋白质,其内含有大量的Cd、Cu、Zn、Hg、Au、Bi等,氨基酸组成为无芳香族氨基酸及组氨酸残基[1]。人、马、兔、鼠的MT基因已经克隆测序,其N端和C端分别为乙酰甲硫氨酸和丙氨酸,半胱氨酸的分布具有严格的相似性,令人惊奇的是在粗脉苞菌分离出来的MT虽然分子量较小,但基本结构与哺乳动物相似,这说明MT的基因在生物进化过程中较为保守。MT中的金属可脱去,去金属的硫蛋白在低pH值时较稳定。使各种金属硫蛋白50%的金属离子发生解离的pH值分别为:Zn-MT为3.5～4.5;Cd-MT为2.5～3.5;Cu-MT的pH低于1。因MT缺乏芳香族氨基酸,故无280 nm处的吸收峰,而具有与金属有关的吸收峰,不同的MT具有不同的吸收峰,据此可鉴定不同的MT,去金属的MT在190 nm处有一吸收峰。
无论是自然产生还是诱导产生的MT,其氨基酸组成基本相同,主要不同在于所含金属和金属的含量。Gunar用CdCl2注射大白鼠[2],Bremner分别用CuSO4和ZnSO4注射大白鼠诱导产生MT[3],他们对所得到的MT分别进行了分析,结果表明所有MT具有以下特征:①相对分子质量低;②含30%半胱氨酸且无芳香族氨基酸;③巯基与金属比例为3∶1,也有报道为2∶1或4∶1;④金属含量高,每mol含6个金属原子。
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2 生理功能
2.1 参与微量元素的代谢及重金属的解毒:不同种属,不同组织来源的MT具有相似氨基酸顺序,并且金属离子与半胱氨酸的配位位置严格固定,提示该蛋白与金属离子有强大的螯合力,说明该蛋白与金属离子的代谢具有重要关系[4]。大白鼠饥饿后肝中Zn-MT含量增加,说明它参与Zn的正常代谢。MT可调节小肠对Cu、Zn等金属的吸收,MT的降解以及结合于其上的金属丢失、蓄积常会导致与某些金属元素有关的疾病,如Wilson病和Menkes病。通过研究,人们怀疑MT可能是Cd的运载蛋白,因它与Cd的亲和力特别强。
2.2 清除自由基:近年来,学者们注意到MT对自由基有非常强的清除作用,有以下事实:在细胞培养时若培养液中含有一定量的MT,对辐射损伤有一定的抵制作用。预先向肝细胞培养液中加入Zn,诱导产生MT,可保护3-甲基吲哚诱发的过氧化损伤。张保弦等的实验证明[5],CCl4在鼠肝代谢产生的CCl3O·2等自由基对肝的损伤作用,可因MT含量增加而得到有效的缓解。Cd-MT、Zn-MT能清除离体黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统所产生的·OH-自由基,也能清除产生的超氧负离子(·O-),但能力较差。
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2.3 参与应激反应:研究发现各种应激状态,例如电击、寒冷、高温、过度疲劳、饥饿等均可引起MT含量生高,同时发现与应激有关的糖皮质激素、肾上腺素等含量增加时,MT的含量也增加。我室利用中药调整大鼠的应激反应实验结果证明[6],MT确与应激反应有关,应激状态下MT含量增加,给予中药缓解应激状态,MT含量降低。
2.4 与肿瘤的关系:近年来的研究发现,一些肿瘤组织中MT含量增加,已在甲状腺癌、睾丸胚胎癌、膀胱癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、结肠癌等组织中观察到MT的过度表达。致癌过程中MT的表达与肿瘤的迅速生长、致癌物质的刺激、癌基因的激活有关。镉是动物和人类的致癌物,啮齿类动物吸入镉蒸气时,肺组织MT的增加与暴露频率相平行。化学致癌物乙基甲硝基脲可激活体外培养的S 49细胞MT基因的表达。肿瘤患者给予γ射线治疗时,骨髓、肝脏和淋巴细胞中MT的增加与累积暴露剂量有关。Ras基因的激活与多种肿瘤启动有关,将c-Ha-ras转染NIH3T3细胞,可激活MT的表达[7],研究发现该基因的激活发生在转录水平。
, 百拇医药
肿瘤细胞的耐药性是肿瘤化疗的主要障碍,对其机制的解释概括为细胞内药物蓄积减少,DNA修复能力增加和细胞解毒体含巯基分子的过量表达。细胞内含巯基的蛋白主要以MT为主,故MT在肿瘤抗药,尤其抗氯氨顺铂(CDDP)的作用受到重视。Lazo及其同事用ELISA检测了10个肿瘤细胞系MT的含量,发现凡MT含量增高的均显示出对烷化剂和CDDP的抗性。诱导细胞使其获得对CDDP的抗性,伴随MT水平的增加,而当细胞抗药表型逆转时,MT水平随之下降。最近,有人用靶向破坏MT基因的方法获得小鼠的胚胎纤维细胞,经CdCl2诱导,该细胞完全无MT表达,与对照细胞比较,对抗肿瘤药的敏感性增高[8]。
在肿瘤的预防和治疗中,MT可保护细胞抵抗重金属和烷化剂的致癌、致突变作用,MT还可用于肿瘤临床的辅助治疗和用作肿瘤标志物。这些都是目前学者们感兴趣的课题。
3 检测方法
, 百拇医药 目前检测MT的方法很多,大致可归为4类:①金属亲和分析法,即测定结合金属以计算MT含量,如Cd血红素饱和法、银饱和法、凝胶电泳和银染色法;②电化学法,即测定巯基以计算MT含量,如微分脉冲和循环伏安法;③蛋白分析法如放射免疫分析法(RIA);④色谱分析法。
选择MT测定方法的依据为:灵敏度高,特异性强,在上述方法中RIA灵敏度最高,极限为100 pg,是目前唯一能测出体液MT含量的方法,Thmos等的实验已证明这点[9]。其它方法仍适合于检测大多数组织中MT的含量。银染色法的极限值为50 ng,液相色谱法、电化学法、金属饱和分析法、银饱和法等方法的检出极限值为1 μg。
影响MT检测的因素也很多,主要有以下几点:①大量的非MT蛋白和非MT蛋白/MT蛋白的高比率会影响MT的检测。②生物体内MT的同分异构体的存在会影响免疫分析的结果。③金属与MT的结合也是选择MT检测方法时应考虑的一个因素。
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参考文献
1.Kagi JHR.Metallothionein proceeding of the first international meeting metallothionein and other molecular weight metal binding protein.Experientia,1979,12(3):17
2.Gunnar.Seperate of two forms of rabbits MT by isoelectric focusing.Biochemistry J,1972,126(7):491
3.Bremner.Isolation of (copper,zinc)-thioneins from the liver of coppper-injection.Biochem J,1976,157(9):517
, 百拇医药
4.Kagi JHR.Metallothionein proceeding of the second international meeting metallothionein and other molecular weight metal binding protein.Experientia,1985,18(4):21
5.张宝弘.大鼠再生肝抗四氯化碳损伤作用与金属硫蛋白.北京医科大学学报,1990,24(6):425
6.赵晓林.滋补肝肾方药对应激大鼠的调整作用.中国中医基础医学杂志,1995,56(2):30
7.Schmid CJ,Hamar DH.Cell specificity and an effect of ras on human metallothionein gene expression.Proc Natl Acad Sci USA,1986,83(10):3346
8.Kondo Y,Woo ES,Michalska AE,et al.Metallothionein null cells have increased sensitivity to anticancer drugs.Cancer Res,1995,55(8):2021
9.Thmos OG.Fluorometric ELIS for the detection and quantitation of MT. J Immunl Methods,1986,89(7):239
(1997-07-22 收稿), 百拇医药