酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶测定条件的研究
作者：张冬云 黄济群 瘳兆全
单位：广州医学院生物化学教研室，广州 510260
关键词：酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶；测定条件
广州医学院学报990228 中图分类号 Q555
酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶(TAT酶)是肝细胞氨基酸分解代谢中的一种转氨酶，催化L-酪氨酸与α-酮戊二酸转氨生成对羟基苯丙酮酸和L-谷氨酸。近年来，在探讨诱导肝癌细胞分化的研究中，该酶作为一个观察肝癌细胞分化的重要指标[1,2]。但该酶测定条件在不同文献报道中差异很大[3,4]。因此，本研究对TAT酶的测定条件进行探讨，以得出适宜的条件，为肝癌细胞分化研究提供实验方法的依据。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 试剂和仪器 磷酸吡哆醛、二硫苏糖醇(DTT)、L-酪氨酸为Sigma公司产品，其余试剂均为国产分析纯。
测定仪器为752C紫外可见分光光度计
1.2 测定方法 在0.2ml肝匀浆中加入3.0ml L-酪氨酸、0.2ml EDTA、0.2ml DTT和0.2ml磷酸吡哆醛，37℃水浴预热5min后加入0.2ml α-酮戊二酸，摇匀，37℃保温30min，加入10mmol/L NaOH 0.2ml，剧烈振荡终止反应，37℃继续保温30min使转变为对331nm紫外光有强烈吸收的对羟基苯甲酸。对照管中加入NaOH终止反应后加入肝匀浆，以对照管调零，在331nm波长处测吸光度[3](A)，从对羟基苯甲醛的吸光度标准曲线上求出对羟基苯甲醛量，从而得出酶反应产物对羟基苯丙酮酸的量，每分钟生成的对羟基苯丙酮酸的μmol数为TAT酶的活力单位。
2 结果与讨论
, 百拇医药
2.1 标准曲线的制作
用对羟基苯甲醛标准品用蒸馏水分别配成100μmmol/L、200μmmol/L、300μmmol/L、400μmmol/L、500μmmol/L、600μmmol/L、700μmmol/L、800μmmol/L和1000μmmol/L溶液，以蒸馏水为空白调零，在311nm波长处测吸光度，绘制标准曲线，见图1。
图1 TAT酶活性的标准曲线
2.2 酶浓度对酶活性的影响
取新鲜小鼠肝脏，用生理盐水冲洗后称重，捣碎，用pH7.4 0.1mmol/L Tris-HCl缓冲液配成10%匀浆液，106Hz超声波粉碎1.5min，离心，取上清液，用pH7.4 0.1mmol/L Tris-HCl缓冲液将肝匀浆等倍系列稀释，测定酶活性，绘制酶浓度-酶活性关系曲线图见图2。
, 百拇医药
图2 酶浓度-酶活性关系图
由结果可见，酶浓度与酶活性的关系在很宽范围内呈直线关系。
2.3 保温时间对酶活性的影响
保温时间由10～90min测定酶活性结果如图3所示。
图3 保温时间与酶活性曲线
由图可见，酶促反应随保温时间的延长而增加，至30min最高，再延长保温时间，反应速度不再增加，故保温时间以30min为宜。
2.4 L-酪氨酸浓度对酶活性的影响
L-酪氨酸浓度对酶活性的影响如图4所示。
, 百拇医药
图4 酪氨酸浓度对酶活性的影响
由图可见，L-酪氨酸3mmol/L时酶活性已达最高水平，故可用此浓度测定TAT活性。
2.5 α-酮戊二酸浓度对酶活性的影响
α-酮戊二酸浓度由3mmol/L至150mmol/L与酶活性的关系如图5所示。
图5 α-酮戊二酸对酶活性影响曲线
由图可见，TAT酶底物α-酮戊二酸由低浓度递增酶活性相应升高，至50mmol/L时酶活性最高(P<0.01),但更高的浓度酶活性反而降低。α-酮戊二酸对紫外吸收较强，提高α-酮戊二酸浓度有助于提高方法的灵敏度，但α-酮戊二酸浓度过高，对照管紫外吸收太高，掩盖了酶反应的结果，这可能是高浓度α-酮戊二酸作底物时酶活性反而降低的原因。
, http://www.100md.com
2.6 磷酸吡哆醛浓度对酶活性的影响结果如表1所示。
表1 磷酸吡哆醛浓度对TAT活性的影响 磷酸吡哆醛(mmo/L)
0.5
1.0
1.25
2.5
5.0
10.0
酶活性(IU)
20.83±0.78
22.1±0.63
, 百拇医药 22.5±0.58
22.8±0.85
22.7±0.85
22.9±0.80
结果显示，磷酸吡哆醛的浓度为1mmol/L时，酶活性比浓度为0.5mmol/L时增加，统计学上有差异(P<0.05)，而与浓度为1.25mmol/L以上各浓度相比，酶活性无显著差异(P>0.05)，可见，TAT酶测定时，用1mmol/L的磷酸吡哆醛已能满足要求。
2.7 EDTA和DTT浓度对酶活性的影响
当DTT浓度为0.5mmol/L时，EDTA浓度由0.5mmol/L至10mmol/L测得的酶活性基本一致(P>0.05)，如表2所示。表2 EDTA浓度对TAT活性的影响 EDTA (mmol/L)
, http://www.100md.com
0.5
1.25
2.5
5.0
10.0
酶活性(IU)
22.7±0.39
22.5±0.28
22.7±0.30
22.9±0.27
22.9±0.25
当EDTA浓度为0.5mmol/L时，DTT浓度由0.5～5.0mmol/L酶活性基本相同(P>0.05)，但不加入DTT则酶活性明显降低(P<0.01)，如表3所示。表3 DTT浓度对TAT活性的影响 DTT (mmol/L)
, 百拇医药
0
0.5
1.25
2.5
5.0
酶活性(IU)
16.8±0.54
22.0±0.64
22.4±0.50
22.5±0.48
22.4±0.50
EDTA与DTT单独或同时加入对酶活性影响如表4所示。表4 EDTA与DTT对TAT活性的影响 组别
, http://www.100md.com
条件
酶活性(IU)
1
加入0.2ml 0.5mmol/L EDTA和0.2ml0.5mmol/L DTT
21.74±0.57
2
加入0.2ml 0.5mmol/L EDTA和0.2ml生理盐水
21.74±0.57
3
加入0.2ml 0.5mmol/L DTT和0.2ml生理盐水
14.08±0.54
, 百拇医药
4
加入0.4ml 0.5mmol/L EDTA
22.28±0.61
实验中加入EDTA和DTT是用于抑制对羟基苯丙酮酸氧化酶的活性，以消除其对实验结果的影响。实验结果表明，0.5mmol/L EDTA或0.5mmol/L DTT单独加入时酶活性较低，即未能完全抑制对羟基苯丙酮酸氧化酶的活性，两者同时加入或加倍EDTA的加入量均可完全抑制对羟基苯丙酮酸氧化酶，使测定值增高。
由上述实验看来，TAT酶活性测定条件中，保温时间以30min为宜，底物L-酪氨酸浓度可选用3mmol/L，α-酮戊二酸浓度选用50mmol/L，磷酸吡哆醛的1mmol/L为好。如省去DTT，单独加入0.5mmol/L EDTA，则应将加入体积增加一倍。
参考文献
, http://www.100md.com
1 艾兆伟，查锡良，刘毅，等.视黄酸对人肝癌细胞浆中某些表型的逆转作用.生物化学与生物物理学报，1990；22(2)：135
2 朱文渊，黄炜，黄济群.丁酸钠对Bel-7402人肝癌细胞几种酶活性的影响.实用癌症杂志，1998；13(3)：187
3 Diamondstone TI.Assay of tyrosine transaminase activity by concersion of p-hydroxyphenylpyruvate to p-hydroxybenzaldehyde Anal Biochem,1966；16:395
4 Kohli kk,Obuch A,Stellwagen RH.Protection aminotransferase against proteolytic digestion by nucteotide derivatives.Biochim Bioplys Acta,1988；956:77
(收稿：1999-03-09), 百拇医药
单位：广州医学院生物化学教研室，广州 510260
关键词：酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶；测定条件
广州医学院学报990228 中图分类号 Q555
酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶(TAT酶)是肝细胞氨基酸分解代谢中的一种转氨酶，催化L-酪氨酸与α-酮戊二酸转氨生成对羟基苯丙酮酸和L-谷氨酸。近年来，在探讨诱导肝癌细胞分化的研究中，该酶作为一个观察肝癌细胞分化的重要指标[1,2]。但该酶测定条件在不同文献报道中差异很大[3,4]。因此，本研究对TAT酶的测定条件进行探讨，以得出适宜的条件，为肝癌细胞分化研究提供实验方法的依据。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 试剂和仪器 磷酸吡哆醛、二硫苏糖醇(DTT)、L-酪氨酸为Sigma公司产品，其余试剂均为国产分析纯。
测定仪器为752C紫外可见分光光度计
1.2 测定方法 在0.2ml肝匀浆中加入3.0ml L-酪氨酸、0.2ml EDTA、0.2ml DTT和0.2ml磷酸吡哆醛，37℃水浴预热5min后加入0.2ml α-酮戊二酸，摇匀，37℃保温30min，加入10mmol/L NaOH 0.2ml，剧烈振荡终止反应，37℃继续保温30min使转变为对331nm紫外光有强烈吸收的对羟基苯甲酸。对照管中加入NaOH终止反应后加入肝匀浆，以对照管调零，在331nm波长处测吸光度[3](A)，从对羟基苯甲醛的吸光度标准曲线上求出对羟基苯甲醛量，从而得出酶反应产物对羟基苯丙酮酸的量，每分钟生成的对羟基苯丙酮酸的μmol数为TAT酶的活力单位。
2 结果与讨论
, 百拇医药
2.1 标准曲线的制作
用对羟基苯甲醛标准品用蒸馏水分别配成100μmmol/L、200μmmol/L、300μmmol/L、400μmmol/L、500μmmol/L、600μmmol/L、700μmmol/L、800μmmol/L和1000μmmol/L溶液，以蒸馏水为空白调零，在311nm波长处测吸光度，绘制标准曲线，见图1。
图1 TAT酶活性的标准曲线
2.2 酶浓度对酶活性的影响
取新鲜小鼠肝脏，用生理盐水冲洗后称重，捣碎，用pH7.4 0.1mmol/L Tris-HCl缓冲液配成10%匀浆液，106Hz超声波粉碎1.5min，离心，取上清液，用pH7.4 0.1mmol/L Tris-HCl缓冲液将肝匀浆等倍系列稀释，测定酶活性，绘制酶浓度-酶活性关系曲线图见图2。
, 百拇医药
图2 酶浓度-酶活性关系图
由结果可见，酶浓度与酶活性的关系在很宽范围内呈直线关系。
2.3 保温时间对酶活性的影响
保温时间由10～90min测定酶活性结果如图3所示。
图3 保温时间与酶活性曲线
由图可见，酶促反应随保温时间的延长而增加，至30min最高，再延长保温时间，反应速度不再增加，故保温时间以30min为宜。
2.4 L-酪氨酸浓度对酶活性的影响
L-酪氨酸浓度对酶活性的影响如图4所示。
, 百拇医药
图4 酪氨酸浓度对酶活性的影响
由图可见，L-酪氨酸3mmol/L时酶活性已达最高水平，故可用此浓度测定TAT活性。
2.5 α-酮戊二酸浓度对酶活性的影响
α-酮戊二酸浓度由3mmol/L至150mmol/L与酶活性的关系如图5所示。
图5 α-酮戊二酸对酶活性影响曲线
由图可见，TAT酶底物α-酮戊二酸由低浓度递增酶活性相应升高，至50mmol/L时酶活性最高(P<0.01),但更高的浓度酶活性反而降低。α-酮戊二酸对紫外吸收较强，提高α-酮戊二酸浓度有助于提高方法的灵敏度，但α-酮戊二酸浓度过高，对照管紫外吸收太高，掩盖了酶反应的结果，这可能是高浓度α-酮戊二酸作底物时酶活性反而降低的原因。
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2.6 磷酸吡哆醛浓度对酶活性的影响结果如表1所示。
表1 磷酸吡哆醛浓度对TAT活性的影响 磷酸吡哆醛(mmo/L)
0.5
1.0
1.25
2.5
5.0
10.0
酶活性(IU)
20.83±0.78
22.1±0.63
, 百拇医药 22.5±0.58
22.8±0.85
22.7±0.85
22.9±0.80
结果显示，磷酸吡哆醛的浓度为1mmol/L时，酶活性比浓度为0.5mmol/L时增加，统计学上有差异(P<0.05)，而与浓度为1.25mmol/L以上各浓度相比，酶活性无显著差异(P>0.05)，可见，TAT酶测定时，用1mmol/L的磷酸吡哆醛已能满足要求。
2.7 EDTA和DTT浓度对酶活性的影响
当DTT浓度为0.5mmol/L时，EDTA浓度由0.5mmol/L至10mmol/L测得的酶活性基本一致(P>0.05)，如表2所示。表2 EDTA浓度对TAT活性的影响 EDTA (mmol/L)
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0.5
1.25
2.5
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酶活性(IU)
22.7±0.39
22.5±0.28
22.7±0.30
22.9±0.27
22.9±0.25
当EDTA浓度为0.5mmol/L时，DTT浓度由0.5～5.0mmol/L酶活性基本相同(P>0.05)，但不加入DTT则酶活性明显降低(P<0.01)，如表3所示。表3 DTT浓度对TAT活性的影响 DTT (mmol/L)
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0.5
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5.0
酶活性(IU)
16.8±0.54
22.0±0.64
22.4±0.50
22.5±0.48
22.4±0.50
EDTA与DTT单独或同时加入对酶活性影响如表4所示。表4 EDTA与DTT对TAT活性的影响 组别
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条件
酶活性(IU)
1
加入0.2ml 0.5mmol/L EDTA和0.2ml0.5mmol/L DTT
21.74±0.57
2
加入0.2ml 0.5mmol/L EDTA和0.2ml生理盐水
21.74±0.57
3
加入0.2ml 0.5mmol/L DTT和0.2ml生理盐水
14.08±0.54
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4
加入0.4ml 0.5mmol/L EDTA
22.28±0.61
实验中加入EDTA和DTT是用于抑制对羟基苯丙酮酸氧化酶的活性，以消除其对实验结果的影响。实验结果表明，0.5mmol/L EDTA或0.5mmol/L DTT单独加入时酶活性较低，即未能完全抑制对羟基苯丙酮酸氧化酶的活性，两者同时加入或加倍EDTA的加入量均可完全抑制对羟基苯丙酮酸氧化酶，使测定值增高。
由上述实验看来，TAT酶活性测定条件中，保温时间以30min为宜，底物L-酪氨酸浓度可选用3mmol/L，α-酮戊二酸浓度选用50mmol/L，磷酸吡哆醛的1mmol/L为好。如省去DTT，单独加入0.5mmol/L EDTA，则应将加入体积增加一倍。
参考文献
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1 艾兆伟，查锡良，刘毅，等.视黄酸对人肝癌细胞浆中某些表型的逆转作用.生物化学与生物物理学报，1990；22(2)：135
2 朱文渊，黄炜，黄济群.丁酸钠对Bel-7402人肝癌细胞几种酶活性的影响.实用癌症杂志，1998；13(3)：187
3 Diamondstone TI.Assay of tyrosine transaminase activity by concersion of p-hydroxyphenylpyruvate to p-hydroxybenzaldehyde Anal Biochem,1966；16:395
4 Kohli kk,Obuch A,Stellwagen RH.Protection aminotransferase against proteolytic digestion by nucteotide derivatives.Biochim Bioplys Acta,1988；956:77
(收稿：1999-03-09), 百拇医药