卵巢癌特异性转移因子的制备与鉴定*
作者：王威廉 周德南 唐凯 陈心秋 唐东平 黄薇
单位：广西医科大学附属肿瘤医院 南宁 530021
关键词：特异性转移因子(STF)；卵巢癌；白细胞粘附抑制试验(LAI)；四唑翁盐(MTT)
广西医科大学报990203
摘要 目的：为了卵巢癌手术后免疫治疗的需要，我们用透析法从用癌组织免疫的山羊脾及淋巴结制备了卵巢癌特异性转移因子(STF)。方法：按中国药典及白细胞粘附抑制试验(MTT法)对STF的理化性质和免疫学性质进行了检测和鉴定。结果：所制备的卵巢癌STF符合转移因子质量标准，具有对卵巢癌细胞抗原的特异性。在15例卵巢癌病人的临床应用中，未发现任何毒副反应。结论：用该法制备的卵巢癌STF，可以安全地应用于卵巢癌的免疫治疗。
中国图书资料分类法分类号 R730.51
, 百拇医药
THE PREPARATION AND IDENTIFICATTON FOR SPECIFIC TRANSFER FACTOR OF OVARIAN CANCER
Wang Weilian,Zhou Denan,Tang Kai,et al
(Affiliated Cancer Hospital,Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objective:To prepare specific transfer factor (STF) of ovarian cancer for the immuno-therapy of ovarian cancer after operation from goat splenocytes and lymphatic nodes by dialytic method.Methods:The chemical physics and immunological characters of the STF were examined and identified in accordance with Chinese pharmacopeia and using MTT-Leukocyte adherence inhibition assay (MTT-LAI) .Result:The result showed that the prepared STF of ovarian cancer is up to the standards of transfer factor's guality and possesses a specificity against ovarian cancer cell's antigen.No toxicity or side effect was found in 15 patients treated with STF.Conclusion:It suggests that the STF can be safely used in immunotherapy for the patients of ovarian cancer.
, 百拇医药
Key words specific trasfer factor (STF);ovarian cancer;leukocyte adherence inhibition test (LAI);tetrazolium salts(MTT)
肿瘤特异性转移因子(STF)作为一种细胞免疫因子，成功地成为一些肿瘤免疫治疗的有效制剂[1]。为了满足卵巢癌手术后免疫治疗的需要，我们用透析法从用癌组织免疫的山羊脾及淋巴结制备并鉴定了卵巢癌STF，在15例免疫治疗的卵巢癌病人中进行了毒副反应的观察。
1 材料与方法
1.1 肿瘤抗原液的准备：取手术切下的新鲜卵巢癌组织块，分离出生长状况好的癌组织，用生理盐水配成浓度约为1×108细胞/ml，经由8000～12000 r/min匀浆成细胞裂解液(肿瘤抗原液)，冰冻备用。
, http://www.100md.com
1.2 动物免疫：选择成年、健康的雄山羊，将与等量完全福氏佐剂充分混匀的肿瘤抗原液2 ml注射于羊皮内，每周加强1次，一共4次，最后一次免疫的同时用2 ml免疫制剂腹腔攻击一次。待免疫后的山羊足垫反应呈阳性，抽羊血分离白细胞做白细胞粘附抑制试验和淋巴细胞转化试验合格，则于48 h后将羊处死，取脾脏及淋巴结，用生理盐水洗净-20℃冷藏备用。
1.3 STF的制备：将山羊脾及淋巴结去包膜加入等质量生理盐水，8000～12000 r/min匀浆，每次3 min，共6次。然后-40℃冻融4次，直至镜检无完整细胞。再将冻融液放入透析袋在等体积去离子水中，冰箱透析24 h，取两次透析液合并，抽滤除菌。以最高吸收峰(252 nm)处8吸收单位(ABS)为一单位分装每毫升2单位，4℃保存[2]。
1.4 STF的性状鉴定：按药典规定进行无菌试验、热源试验、急性毒性试验及过敏试验。用紫外分光光度计测紫外吸收光谱。用质量分数为20%磺基水杨酸与等量STF反应检测蛋白含量。用Lowry微量法测STF多肽含量。
, 百拇医药
1.5 STF特异性生物活性的鉴定，采用白细胞粘附抑制试验(MTT法)[3]。取山羊静脉血，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离白细胞，按常规破坏红细胞后，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基配成2×106细胞/ml。在消毒培养板每孔加入白细胞悬液0.1 ml，分实验组和对照组，每组作3复孔。每组孔分别加入50 μl 1640培养液稀释的STF和肿瘤抗原液以及1640培养液和肿瘤抗原液，在37℃二氧化碳培养箱中培养2 h，弃去孔内上清。然后向孔内加入180 μl不含小牛血清的RPMI-1640液和20 μl MTT液，37℃再孵育3 h，离心微孔板，弃去上清，每孔加入200 μl二甲基亚砜，彻底溶解细胞内形成的甲颗粒后，用MR300酶标仪在波长490 nm测吸光度(A)。白细胞粘附抑制(LAI)指数按下列公式计算：
当LAI指数>20%时表示有细胞免疫反应。
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1.6 淋巴细胞转化率测定：光镜下计数淋巴母细胞并计算百分率。
2 结果
2.1 免疫前后山羊的LAI指数分别为(7.6±6.86)%，(21.3±7.0)%；淋巴细胞转化率分别为(42.6±4.41)%，(68.6±1.85)%。免疫前后LAI指数和淋巴细胞转化率均有显著差异(P<0.05)。说明山羊免疫后激发了满意的细胞免疫反应，免疫成功。
2.2 STF一般性状：本品为无色透明液体。pH值为6.5～7.0。用质量分数为20%磺基水杨酸与等量STF液反应，无混浊，无沉淀，蛋白质反应阴性。多肽含量800 mg/L。紫外吸收光谱分析，E 260 nm与E 280 nm比值大于2.0。STF的无菌试验、热源试验、小鼠急性毒性试验、过敏试验结果均阴性，符合中国药典生物制品标准。
2.3 STF特异性生物活性鉴定：淋巴细胞转化率实验组为61.5%，对照组为40.0%，提高率大于20%，有显著性差异(P<0.05)。白细胞粘附抑制指数(LAI指数)对照组为7.6%，实验组为20%(P<0.05)，表明STF的生物活性对卵巢癌细胞抗原有特异性。
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3 讨论
转移因子是细胞免疫激活剂，能特异性和非特异性地提高受体免疫功能，可以介导淋巴细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用，抑制或破坏肿瘤细胞的生长。转移因子是存在于白细胞中一种可透析的免疫小分子肽和多核甘酸，能将供体的某种抗原特异性迟发超敏反应转移给受体。它无种属特异性，可以在种属间传递，动物来源的转移因子可以用于人类。对牛、羊、鼠、猪等多种哺乳动物与人类的转移因子进行比较，均未发现较大差异，临床应用也未引起不良反应[4]。
转移因子依据其来源和免疫活性的不同，可以分成非特异性转移因子(NTF)和STF。它们的根本区别是NTF来自健康正常人或动物的白细胞、脾脏及淋巴组织；而STF来源于用抗原物质免疫过的人或动物的白细胞、脾脏及淋巴组织。因此，我们认为在制备过程中提高STF产量的第一个关键问题是：供体必须是免疫成功的，尽可能较高地激发供体产生细胞免疫反应，良好致敏的供体白细胞才能产生足够的STF。证明免疫成功的指标一般是动物的足垫反应、淋巴细胞转化试验、白细胞移动抑制试验或白细胞粘附抑制试验呈阳性或检测值显著提高。
, 百拇医药
STF制备过程中第二个关键是免疫脾脏和淋巴组织的匀浆和冻融必须彻底地破坏完整白细胞，使细胞内的小分子肽和多核甘酸能完全释放出来以便透析制备。在经典透析法的提取工艺中，要求对捣碎的组织细胞液进行10次冻融处理[5]。我们采用4次冻融间隔6次高速匀浆同样可以达到镜下无完整细胞的效果，缩短了制备时间，尽量减少了细菌污染的机会。
STF的特异性生物活性检测，以往都是采用白细胞移动抑制试验，这种方法在观察上容易受主观影响，产生偏差。国内学者多采用白细胞粘附抑制试验检测。我们采用四唑翁盐-白细胞粘附抑制试验(MTT-LAI)代替同位素-LAI试验，克服了同位素法在设备仪器上的困难，取得了比较满意的效果，在STF免疫活性质量控制上得到了保证，说明了MTT-LAI法目前也是比较精确、简便的STF特异性免疫活性的检测方法。
我们制备的STF已经在临床上用于15例卵巢癌病人的治疗，没有出现发热、疼痛、过敏等毒副反应，说明用以上方法制备的STF在临床应用上是安全的，值得进一步应用研究。
, 百拇医药
(本研究STF药典检测项目由广西医科大学药理教研室协助完成，谨致谢忱)
*区科委资助课题 9635097
参考文献
1 李丛壁，方天祺.特异性转移因子的免疫活性及临床应用.中国生化药物杂志，1994，15(1)：70
2 Stephen J.Rozzo,Charles H.Kirkpatrick.Purification of transfer factors.Molecular Immunology,1992,29(2):167
3 王 方，王国华，苏成芝，等.用MTT-LAI方法鉴定人胃癌特异性转移因子的免疫活性.免疫学杂志，1994，10(3)：181
4 徐丹滨.特异性转移因子.天津医学院学报，1992，16(1)：77
5 杨 峰，李广灿，傅由高，等.转移因子紫外吸收光谱A 260 nm与A 280 nm比值达标的初步探讨.中国药学杂志，1989，24(6)：353
收稿日期：1998-05-05, http://www.100md.com
单位：广西医科大学附属肿瘤医院 南宁 530021
关键词：特异性转移因子(STF)；卵巢癌；白细胞粘附抑制试验(LAI)；四唑翁盐(MTT)
广西医科大学报990203
摘要 目的：为了卵巢癌手术后免疫治疗的需要，我们用透析法从用癌组织免疫的山羊脾及淋巴结制备了卵巢癌特异性转移因子(STF)。方法：按中国药典及白细胞粘附抑制试验(MTT法)对STF的理化性质和免疫学性质进行了检测和鉴定。结果：所制备的卵巢癌STF符合转移因子质量标准，具有对卵巢癌细胞抗原的特异性。在15例卵巢癌病人的临床应用中，未发现任何毒副反应。结论：用该法制备的卵巢癌STF，可以安全地应用于卵巢癌的免疫治疗。
中国图书资料分类法分类号 R730.51
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THE PREPARATION AND IDENTIFICATTON FOR SPECIFIC TRANSFER FACTOR OF OVARIAN CANCER
Wang Weilian,Zhou Denan,Tang Kai,et al
(Affiliated Cancer Hospital,Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objective:To prepare specific transfer factor (STF) of ovarian cancer for the immuno-therapy of ovarian cancer after operation from goat splenocytes and lymphatic nodes by dialytic method.Methods:The chemical physics and immunological characters of the STF were examined and identified in accordance with Chinese pharmacopeia and using MTT-Leukocyte adherence inhibition assay (MTT-LAI) .Result:The result showed that the prepared STF of ovarian cancer is up to the standards of transfer factor's guality and possesses a specificity against ovarian cancer cell's antigen.No toxicity or side effect was found in 15 patients treated with STF.Conclusion:It suggests that the STF can be safely used in immunotherapy for the patients of ovarian cancer.
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Key words specific trasfer factor (STF);ovarian cancer;leukocyte adherence inhibition test (LAI);tetrazolium salts(MTT)
肿瘤特异性转移因子(STF)作为一种细胞免疫因子，成功地成为一些肿瘤免疫治疗的有效制剂[1]。为了满足卵巢癌手术后免疫治疗的需要，我们用透析法从用癌组织免疫的山羊脾及淋巴结制备并鉴定了卵巢癌STF，在15例免疫治疗的卵巢癌病人中进行了毒副反应的观察。
1 材料与方法
1.1 肿瘤抗原液的准备：取手术切下的新鲜卵巢癌组织块，分离出生长状况好的癌组织，用生理盐水配成浓度约为1×108细胞/ml，经由8000～12000 r/min匀浆成细胞裂解液(肿瘤抗原液)，冰冻备用。
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1.2 动物免疫：选择成年、健康的雄山羊，将与等量完全福氏佐剂充分混匀的肿瘤抗原液2 ml注射于羊皮内，每周加强1次，一共4次，最后一次免疫的同时用2 ml免疫制剂腹腔攻击一次。待免疫后的山羊足垫反应呈阳性，抽羊血分离白细胞做白细胞粘附抑制试验和淋巴细胞转化试验合格，则于48 h后将羊处死，取脾脏及淋巴结，用生理盐水洗净-20℃冷藏备用。
1.3 STF的制备：将山羊脾及淋巴结去包膜加入等质量生理盐水，8000～12000 r/min匀浆，每次3 min，共6次。然后-40℃冻融4次，直至镜检无完整细胞。再将冻融液放入透析袋在等体积去离子水中，冰箱透析24 h，取两次透析液合并，抽滤除菌。以最高吸收峰(252 nm)处8吸收单位(ABS)为一单位分装每毫升2单位，4℃保存[2]。
1.4 STF的性状鉴定：按药典规定进行无菌试验、热源试验、急性毒性试验及过敏试验。用紫外分光光度计测紫外吸收光谱。用质量分数为20%磺基水杨酸与等量STF反应检测蛋白含量。用Lowry微量法测STF多肽含量。
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1.5 STF特异性生物活性的鉴定，采用白细胞粘附抑制试验(MTT法)[3]。取山羊静脉血，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离白细胞，按常规破坏红细胞后，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基配成2×106细胞/ml。在消毒培养板每孔加入白细胞悬液0.1 ml，分实验组和对照组，每组作3复孔。每组孔分别加入50 μl 1640培养液稀释的STF和肿瘤抗原液以及1640培养液和肿瘤抗原液，在37℃二氧化碳培养箱中培养2 h，弃去孔内上清。然后向孔内加入180 μl不含小牛血清的RPMI-1640液和20 μl MTT液，37℃再孵育3 h，离心微孔板，弃去上清，每孔加入200 μl二甲基亚砜，彻底溶解细胞内形成的甲颗粒后，用MR300酶标仪在波长490 nm测吸光度(A)。白细胞粘附抑制(LAI)指数按下列公式计算：
当LAI指数>20%时表示有细胞免疫反应。
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1.6 淋巴细胞转化率测定：光镜下计数淋巴母细胞并计算百分率。
2 结果
2.1 免疫前后山羊的LAI指数分别为(7.6±6.86)%，(21.3±7.0)%；淋巴细胞转化率分别为(42.6±4.41)%，(68.6±1.85)%。免疫前后LAI指数和淋巴细胞转化率均有显著差异(P<0.05)。说明山羊免疫后激发了满意的细胞免疫反应，免疫成功。
2.2 STF一般性状：本品为无色透明液体。pH值为6.5～7.0。用质量分数为20%磺基水杨酸与等量STF液反应，无混浊，无沉淀，蛋白质反应阴性。多肽含量800 mg/L。紫外吸收光谱分析，E 260 nm与E 280 nm比值大于2.0。STF的无菌试验、热源试验、小鼠急性毒性试验、过敏试验结果均阴性，符合中国药典生物制品标准。
2.3 STF特异性生物活性鉴定：淋巴细胞转化率实验组为61.5%，对照组为40.0%，提高率大于20%，有显著性差异(P<0.05)。白细胞粘附抑制指数(LAI指数)对照组为7.6%，实验组为20%(P<0.05)，表明STF的生物活性对卵巢癌细胞抗原有特异性。
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3 讨论
转移因子是细胞免疫激活剂，能特异性和非特异性地提高受体免疫功能，可以介导淋巴细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用，抑制或破坏肿瘤细胞的生长。转移因子是存在于白细胞中一种可透析的免疫小分子肽和多核甘酸，能将供体的某种抗原特异性迟发超敏反应转移给受体。它无种属特异性，可以在种属间传递，动物来源的转移因子可以用于人类。对牛、羊、鼠、猪等多种哺乳动物与人类的转移因子进行比较，均未发现较大差异，临床应用也未引起不良反应[4]。
转移因子依据其来源和免疫活性的不同，可以分成非特异性转移因子(NTF)和STF。它们的根本区别是NTF来自健康正常人或动物的白细胞、脾脏及淋巴组织；而STF来源于用抗原物质免疫过的人或动物的白细胞、脾脏及淋巴组织。因此，我们认为在制备过程中提高STF产量的第一个关键问题是：供体必须是免疫成功的，尽可能较高地激发供体产生细胞免疫反应，良好致敏的供体白细胞才能产生足够的STF。证明免疫成功的指标一般是动物的足垫反应、淋巴细胞转化试验、白细胞移动抑制试验或白细胞粘附抑制试验呈阳性或检测值显著提高。
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STF制备过程中第二个关键是免疫脾脏和淋巴组织的匀浆和冻融必须彻底地破坏完整白细胞，使细胞内的小分子肽和多核甘酸能完全释放出来以便透析制备。在经典透析法的提取工艺中，要求对捣碎的组织细胞液进行10次冻融处理[5]。我们采用4次冻融间隔6次高速匀浆同样可以达到镜下无完整细胞的效果，缩短了制备时间，尽量减少了细菌污染的机会。
STF的特异性生物活性检测，以往都是采用白细胞移动抑制试验，这种方法在观察上容易受主观影响，产生偏差。国内学者多采用白细胞粘附抑制试验检测。我们采用四唑翁盐-白细胞粘附抑制试验(MTT-LAI)代替同位素-LAI试验，克服了同位素法在设备仪器上的困难，取得了比较满意的效果，在STF免疫活性质量控制上得到了保证，说明了MTT-LAI法目前也是比较精确、简便的STF特异性免疫活性的检测方法。
我们制备的STF已经在临床上用于15例卵巢癌病人的治疗，没有出现发热、疼痛、过敏等毒副反应，说明用以上方法制备的STF在临床应用上是安全的，值得进一步应用研究。
, 百拇医药
(本研究STF药典检测项目由广西医科大学药理教研室协助完成，谨致谢忱)
*区科委资助课题 9635097
参考文献
1 李丛壁，方天祺.特异性转移因子的免疫活性及临床应用.中国生化药物杂志，1994，15(1)：70
2 Stephen J.Rozzo,Charles H.Kirkpatrick.Purification of transfer factors.Molecular Immunology,1992,29(2):167
3 王 方，王国华，苏成芝，等.用MTT-LAI方法鉴定人胃癌特异性转移因子的免疫活性.免疫学杂志，1994，10(3)：181
4 徐丹滨.特异性转移因子.天津医学院学报，1992，16(1)：77
5 杨 峰，李广灿，傅由高，等.转移因子紫外吸收光谱A 260 nm与A 280 nm比值达标的初步探讨.中国药学杂志，1989，24(6)：353
收稿日期：1998-05-05, http://www.100md.com