动粒蛋白与人外周血淋巴细胞增殖关系的研究
作者：梁素华 陈家诗 杨小林
单位：(川北医学院生物学研究室 南充 637000)
关键词：动粒蛋白；淋巴细胞；增殖；ACA间接免疫荧光；放射自显影；蛋白免疫印迹
川北医学院学报/990203提 要 笔者以正常人外周血淋巴细胞为实验材料，加入2 μg/ml的PHA刺激，用3H—TdR标记，通过放射自显影，测定培养不同时间后进入细胞周期的淋巴细胞数量及M期的细胞数量，探讨细胞内动粒蛋白含量变化与淋巴细胞增殖的关系。ACA间接免疫荧光染色显示，正常未经转化的淋巴细胞和加PHA刺激培养至48 h的淋巴细胞内动粒荧光斑点小而微弱，加PHA刺激培养54～72 h的淋巴细胞内动粒荧光斑点亮度逐渐增强，体积逐渐增大。Western blot表明，17KD和52KD两种动粒蛋白在对照组和培养不同时间的各组淋巴细胞内均存在，且含量保持相对稳定，80KD和56KD两种动粒蛋白在未经培养和培养至48 h的淋巴细胞内不出现，80KD蛋白在培养54 h的细胞内可见。培养60～72 h，淋巴细胞内可被ACA特异识别的动粒蛋白共四种：80KD、56KD、52KD和17KD。
, 百拇医药
文章编号：1005-3697(1999)02-0007-03 中图分类号：R392.12 文献标识码：A
The Relationship Between Centromere Proteins and
Human Peripheral Blood Lymphocytes Proliferation
Liang Suhua et al
Department of Biology Cheng Jiashi
Sichuan Teacher′s College, Nanchong 637002
ABSTRACT The aim of this study of human peripheral blood lymphocytes stimulated with PHA at 2μg/ml and marked with 3 H—TdR at 0.2μCi/ml is to test lymphocytes number entering cell cycle and M phase, to explore the relationship between centromere proteins(CENP) content and lymphocytes proliferation by methods of autoradiography, indirect immunofluorescence(IIF) and western blot. Autoradiography shows that the number of lymphocytes entering the cell cycle and M phase rises when the lymphocytes are cultured. IIF of anticentromere antibody(ACA) shows that the kinetochore fluorescence with PHA stimulation for 60～72 hours is brighter than control cells, which indicates that the contents of CENP can rise. Western blot shows that ACA serum can recognize two kinds of CENP with different molecular weights(52KD、17KD) in control lymphocytes and in PHA-stimulated lymphocytes for 48 hours. ACA serum can recognize four kinds of CENP(80KD、56KD、52KD and 17KD)in PHA-stimulated lymphocytes cultured for 60～72 hours.
, 百拇医药
Key Words Centromere/kinetochore proteins Lymphocytes Proliferation ACA indirect immunofluorescence Western blot Autoradiography
动粒/着丝粒(Kinetochore/centromere)是真核细胞染色体上的一个重要结构，是有丝分裂和减数分裂过程中纺缍体微管实际附着的位置，主要由DNA、蛋白质及少量RNA组成。人类一种被称CREST综合征患者的血清中存在有抗动粒的抗体(anticentromere/kinetochore antibody, ACA)[1]。
笔者研究发现，在抗肿瘤药物三尖杉酯碱诱导HL60和L1210细胞程序死亡前后，细胞内均出现可被ACA特异识别的特殊的动粒蛋白带纹[2，3，4，5]。孙红等发现在RA诱导HL60细胞分化前后，细胞内动粒蛋白含量随细胞分化成熟而降低[6]。这表明动粒蛋白含量和种类可能随细胞增殖、分化及凋亡处于动态变化之中。笔者以正常人外周血淋巴细胞为材料，用PHA刺激、3H—TdR标记、采用放射自显影、ACA间接免疫荧光染色和蛋白免疫印迹(Western blot)技术，研究淋巴细胞转化前后动粒蛋白含量和种类的变化，从而探讨动粒蛋白与淋巴细胞增殖的动态关系。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 细胞培养及PHA刺激
正常人外周血淋巴细胞是用国产淋巴细胞分层液(军事医学科学院)从新鲜的人外周血中分离得到。然后用含12 %灭活小牛血清、2μg/mlPHA的RPMI1640(Gibco公司产)培养基，培养条件为37℃、5 %CO2，培养36 h取样一次。
1.2 3H—TdR标记
淋巴细胞培养至36 h,加入0.2 μci/ml的3H—TdR(中国原子能研究所供)，继续培养12 h后取样一次，以后每隔6 h取样，直至培养72 h终止。培养不同时间的淋巴细胞用作放射自显影、ACA间接免疫荧光染色及Western bolt。各组细胞在取样前4 h均加入秋胺阻断。
, 百拇医药
1.3 放射自显影
加入3H—TdR后不同时间取出的样品细胞用细胞离心涂片机(英国Shandon公司)将细胞离心到载片上，空气干燥后用甲醇：冰醋酸(9：1)室温固定10 min。然后将用蒸馏水稀释后的核子乳胶(1：1)覆盖于细胞上，待载片干燥后将其置入暗盒中，密封后在4℃冰箱中曝光5 d。显影、定影、Geimsa染色，在油镜(Olympus)下观察统计加3H—TdR后的不同样品中淋巴细胞总数、其中被3H—TdR标记上的细胞数以及M期的细胞数。
1.4 ACA间接免疫荧光染色[2]
未经培养的淋巴细胞、加PHA后培养36 h、加3H—TdR后12 h、18 h、24 h、30 h、36 h的淋巴细胞均用细胞离心涂片机将不同样品细胞离心到小盖片上，用预冷至-20℃的丙酮固定。用ACA血清为一抗(1∶200)孵育，并置入4℃冰箱中过夜，二抗用FITC标记的羊抗人IgG(军事医学科学院流行病研究所供)1∶20稀释，一抗、二抗孵育后均用PBS充分漂洗。甘油+PBS封片，Olympus荧光显微镜观察并摄片。同时用正常人血清代替ACA血清作阴性对照实验。
, http://www.100md.com
1.5 蛋白免疫印迹(Western blot)法[2]
加PHA后培养36 h、加3H—TdR后不同时间取样的淋巴细胞以及未经培养的新鲜淋巴细胞均用细胞裂解液(5 %Tris-Hcl、2.5 %SDS、10 %BME、1mM/LPSF)裂解，提取细胞的总蛋白，100℃煮5 min,用DU—50型紫外分光光度计(美国Beckman公司产)准确测定不同样品的总蛋白含量。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳将各样品中分子量大小不同的蛋白质分离开，分离胶浓度为12 %。采用石墨电极转移装置将SDS—凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。样品膜用0.1M/L冰醋酸室温下处理20 min，以灭活内源性碱性磷酸酶。2 %BSA+TBST封闭30 min，ACA血清(1∶1000稀释)为一抗孵育1 h，TBST充分漂洗，碱性磷示记的羊抗人IgG(美国Promega公司产品)为二抗(1∶10000稀释)，孵育30 min,TBST充分漂洗后，显色(Apbuffer+NBT+BCIP)并摄片。同时设不加PHA刺激的新鲜淋巴细胞为对照。
, 百拇医药
2 结果
2.1 3H—TdR标记的淋巴细胞数量
放射自显影结合Olympus显微镜观察结果显示(表1)，加3H—TdR后12 h的淋巴细胞中有少部分细胞核内出现黑色颗粒，表明培养基中的3H—TdR已随这部分细胞核DNA的复制掺入进新合成的DNA分子中，即在PHA的刺激下这部分淋巴细胞已从暂不增殖状态回到细胞周期中，此期进入周期的细胞比例占19.7 %，但此时未见被3H—TdR标记的M期淋巴细胞出现。加3H—TdR后18 h的淋巴细胞中被3H—TdR标记上的细胞数量较前一时期有所增加，并且视野中有被标记上的M期淋巴细胞出现，进入M期的淋巴细胞占统计总数的6.98 %。统计数据显示，随培养时间延长，被3H—TdR标记上的淋巴细胞数量逐渐增多，被3H—TdR标记上的M期细胞比例也逐渐上升。在实验时间范围内，加3H—TdR后36 h，被标记上的淋巴细胞及M期细胞均达到高峰，此期占统计数约71 %的细胞已恢复增殖能力，进入细胞周期循环。
, 百拇医药
表1 放射自显影测定进入细胞周期的淋巴细胞数量 培养时间
(h)
加3H—TdR
时间(h)
统计细胞
总 数
标记细胞
标记M期细胞
总数
%
总数
%
, 百拇医药
36
0
352
0
0
0
0
48
12
351
69
19.7
0
0
, http://www.100md.com
54
18
351
95
27.1
24
6.8
60
24
353
149
42.2
66
, http://www.100md.com 18.7
66
30
353
185
52.4
85
24.1
72
36
357
252
70.7
, 百拇医药 99
27.7
2.2 淋巴细胞转化前后动粒蛋白含量变化
用抗动粒抗体(ACA)为探针，采用间接免疫荧光染色，测定转化前后淋巴细胞内动粒蛋白含量变化，结果见图1。ACA可特异性地识别淋巴细胞核内的动粒/着丝粒蛋白，并与之结合，染色后核内呈现出特殊的荧光斑点，细胞质内无此种荧光斑点出现。在未加PHA刺激的新鲜淋巴细胞核内可见有微弱的动粒荧光斑点存在，加PHA刺激培养36～48 h的淋巴细胞核内动粒荧光斑点的大小和亮度无明显的变化，培养54 h的淋巴细胞核内动粒荧光斑点的亮度略有增强，培养66～72 h的淋巴细胞核内呈现出明亮、清晰的动粒荧光斑点。用正常人血清代替ACA，染色后细胞核内无荧光斑点出现。
2.3 淋巴细胞转化前后动粒蛋白种类的变化
Western blot结果显示，在培养不同时间的淋巴细胞中，ACA血清能够特异识别并与之结合的动粒蛋白类型不完全一致(图2、表2)。对照组淋巴细胞和加PHA后培养至48 h的细胞内，能被ACA血清特异识别的动粒蛋白带纹有两条，分子量为17KD和52KD，培养54 h后增加了一条微弱的分子量为80KD带纹，培养至60 h的细胞中又多了一条分了量为56 KD带纹，继续培养到66～72 h的细胞中，可被ACA血清特异识别的动粒蛋白带纹保持在四条，但分子量为80KD和56KD两种蛋白的带纹染色加深。17KD和52KD两种动粒蛋白在转化前后及培养不同时间的淋巴细胞中基本保持稳定。
, 百拇医药
图1 ACA间接免疫荧光染色显示加PHA(2μg/ml)刺激不
同时间的正常人外周血淋巴细胞内动粒蛋白含量的变化
A 对照组(未经培养的淋巴细胞) B 培养36 h的淋巴细胞
C 培养54 h的淋巴细胞D 培养72 h的淋巴细胞
表2 培养不同时间的淋巴细胞内动粒蛋白类型 Control
加PHA刺激
36 h
48 h
54 h
60 h
, 百拇医药
66 h
72 h
17KD
17KD
17KD
17KD
17KD
17KD
17KD
52KD
52KD
52KD
52KD
, 百拇医药
52KD
52KD
52KD
-
-
-
-
56KD
56KD
56KD
-
-
-
80KD
, http://www.100md.com
80KD
80KD
80KD
图2 Western blot显示加PHA刺激培养不同时间的正常
人外周血淋巴细胞中动粒蛋白组分和含量的变化。
A 低分子量标准蛋白 B 培养72 h的淋巴细胞
C 培养54 h的淋巴细胞 D 培养36 h的淋巴细胞
E 对照组(未经培养的淋巴细胞)
3 讨论
, http://www.100md.com
正常人外周血中的淋巴细胞是一种保持了增殖潜能而处于暂不增殖状态的细胞，一般可在外周血中循环数年都不分裂，但在抗原或植物细胞凝集素的刺激下可恢复其增殖能力，进入细胞周期循环[7]。动粒蛋白作为真核细胞染色体上的一个重要结构，目前认为它可能与细胞增殖、分化、衰老有关。本研究发现，在抗肿瘤药物三尖杉酯碱诱导HL60细胞和L1210细胞程序死亡过程中，细胞内动粒蛋白含量逐渐降低[2，3]，种类逐渐减少。孙红等发现RA诱导HL60细胞分化成熟时细胞内动粒蛋白含量也降低[6]。Cox等发现Hela细胞中分子量为14和34KD两种动粒蛋白的合成受到周期性的调节[8，9]。笔者的研究显示，新鲜外周血中处于暂不增殖状态的淋巴细胞中动粒荧光斑点微小，且模糊不清。在PHA刺激后淋巴细胞的转化过程中，随着被3H—TdR标记上的进入周期的淋巴细胞数量增多，细胞内动粒荧光斑点逐渐变亮、变清晰，表明细胞内动粒蛋白含量逐渐上升。Western blot显示，转化前后及培养时间长短不同的淋巴细胞中动粒蛋白种类也是不同的。分子量为17KD和52KD两种动粒蛋白在对照淋巴细胞和加PHA刺激培养不同时间的淋巴细胞中均存在，但它们在培养至72 h的细胞中含量较丰富。本研究曾发现，在旺盛增殖的人急性早幼粒白血病HL60细胞和抗肿瘤药物三尖杉酯碱诱导发生程序死亡的HL60细胞中均有17KD和52KD两种动粒蛋白存在，但在恶性增殖的HL60细胞内含量更丰富[2]。Earnshaw等在人宫颈癌Hela细胞内也发现有17KD蛋白存在[10]。分子量为56KD和80KD两种动粒蛋白则随进入细胞周期的淋巴细胞数量的增多而发生动态变化。当淋巴细胞培养至54 h时，Western blot出现了一种新的80KD动粒蛋白，之后，该种蛋白带纹随培养时间延长而加深。当细胞培养至60 h时，又出现了一条新的分子量为56 KD的动粒蛋白，该种蛋白含量也随细胞培养时间的延长而逐渐增加。在旺盛增殖的HL60细胞中也有56KD和80KD两种动粒蛋白存在。在Hela细胞中也发现有80KD蛋白存在，但在Hela细胞中未发现有56KD蛋白存在[5，10]。
, 百拇医药
本研究结果提示，淋巴细胞内动粒蛋白含量和种类变化与淋巴细胞增殖密切相关。那么淋巴细胞转化过程中细胞内动粒蛋白含量和种类为什么会发生变化?还有待进一步研究。
参考文献
1 Moroi Y, Peebles C, Fritzler MJ.Autoantibody to centromere(Kinetochore)in scleroderma sera. Proc Natl Acad Sci USA, 1980;77(3):1627
2 梁素华，杨新林，彭安等.三尖杉酯碱对HL60细胞动粒蛋白B基因表达的影响.解剖学报，1998；29(2)：190
3 梁素华，彭安，杨新林等.三尖杉酯碱对L1210细胞中动粒蛋白组分及CENP—B基因表达的影响.科学通报(待发)
, 百拇医药
4 梁素华，陈家诗.几种培养细胞动粒的比较研究.四川大学学报(自然科学版)，1996；33:278
5 杨新林，李时，梁素华等.哺乳动物的几种培养细胞的动粒蛋白的研究.解剖学报，1994；25(4)：385
6 孙红，王永潮.HL—60细胞分化对动粒蛋白及其基因表达的影响.北京师范大学学报(自然科学版)，1995；31(4)：521
7 汪德耀主编.普通细胞生物学.上海科技出版社，1998
8 Cox JV, Olmsted JB.Molecular biology of the cytoskeleton. New York:Cold Spring Harbor Lab, 1984;71～77
9 Cox JV, Schenk EA. Olmsted JB.Human anticentromere antibodies:distribution characterization of antigens and effect on microtubule organization. Cell, 1983;35:331
10 Earnshaw WC, Rothfield N.Identification of a family of human centromere proteins using autimmune sera from patients with scleroderma. Chromosoma(Berl), 1985;91(3/4):313
(收稿日期：1999-04-12), http://www.100md.com
单位：(川北医学院生物学研究室 南充 637000)
关键词：动粒蛋白；淋巴细胞；增殖；ACA间接免疫荧光；放射自显影；蛋白免疫印迹
川北医学院学报/990203提 要 笔者以正常人外周血淋巴细胞为实验材料，加入2 μg/ml的PHA刺激，用3H—TdR标记，通过放射自显影，测定培养不同时间后进入细胞周期的淋巴细胞数量及M期的细胞数量，探讨细胞内动粒蛋白含量变化与淋巴细胞增殖的关系。ACA间接免疫荧光染色显示，正常未经转化的淋巴细胞和加PHA刺激培养至48 h的淋巴细胞内动粒荧光斑点小而微弱，加PHA刺激培养54～72 h的淋巴细胞内动粒荧光斑点亮度逐渐增强，体积逐渐增大。Western blot表明，17KD和52KD两种动粒蛋白在对照组和培养不同时间的各组淋巴细胞内均存在，且含量保持相对稳定，80KD和56KD两种动粒蛋白在未经培养和培养至48 h的淋巴细胞内不出现，80KD蛋白在培养54 h的细胞内可见。培养60～72 h，淋巴细胞内可被ACA特异识别的动粒蛋白共四种：80KD、56KD、52KD和17KD。
, 百拇医药
文章编号：1005-3697(1999)02-0007-03 中图分类号：R392.12 文献标识码：A
The Relationship Between Centromere Proteins and
Human Peripheral Blood Lymphocytes Proliferation
Liang Suhua et al
Department of Biology Cheng Jiashi
Sichuan Teacher′s College, Nanchong 637002
ABSTRACT The aim of this study of human peripheral blood lymphocytes stimulated with PHA at 2μg/ml and marked with 3 H—TdR at 0.2μCi/ml is to test lymphocytes number entering cell cycle and M phase, to explore the relationship between centromere proteins(CENP) content and lymphocytes proliferation by methods of autoradiography, indirect immunofluorescence(IIF) and western blot. Autoradiography shows that the number of lymphocytes entering the cell cycle and M phase rises when the lymphocytes are cultured. IIF of anticentromere antibody(ACA) shows that the kinetochore fluorescence with PHA stimulation for 60～72 hours is brighter than control cells, which indicates that the contents of CENP can rise. Western blot shows that ACA serum can recognize two kinds of CENP with different molecular weights(52KD、17KD) in control lymphocytes and in PHA-stimulated lymphocytes for 48 hours. ACA serum can recognize four kinds of CENP(80KD、56KD、52KD and 17KD)in PHA-stimulated lymphocytes cultured for 60～72 hours.
, 百拇医药
Key Words Centromere/kinetochore proteins Lymphocytes Proliferation ACA indirect immunofluorescence Western blot Autoradiography
动粒/着丝粒(Kinetochore/centromere)是真核细胞染色体上的一个重要结构，是有丝分裂和减数分裂过程中纺缍体微管实际附着的位置，主要由DNA、蛋白质及少量RNA组成。人类一种被称CREST综合征患者的血清中存在有抗动粒的抗体(anticentromere/kinetochore antibody, ACA)[1]。
笔者研究发现，在抗肿瘤药物三尖杉酯碱诱导HL60和L1210细胞程序死亡前后，细胞内均出现可被ACA特异识别的特殊的动粒蛋白带纹[2，3，4，5]。孙红等发现在RA诱导HL60细胞分化前后，细胞内动粒蛋白含量随细胞分化成熟而降低[6]。这表明动粒蛋白含量和种类可能随细胞增殖、分化及凋亡处于动态变化之中。笔者以正常人外周血淋巴细胞为材料，用PHA刺激、3H—TdR标记、采用放射自显影、ACA间接免疫荧光染色和蛋白免疫印迹(Western blot)技术，研究淋巴细胞转化前后动粒蛋白含量和种类的变化，从而探讨动粒蛋白与淋巴细胞增殖的动态关系。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 细胞培养及PHA刺激
正常人外周血淋巴细胞是用国产淋巴细胞分层液(军事医学科学院)从新鲜的人外周血中分离得到。然后用含12 %灭活小牛血清、2μg/mlPHA的RPMI1640(Gibco公司产)培养基，培养条件为37℃、5 %CO2，培养36 h取样一次。
1.2 3H—TdR标记
淋巴细胞培养至36 h,加入0.2 μci/ml的3H—TdR(中国原子能研究所供)，继续培养12 h后取样一次，以后每隔6 h取样，直至培养72 h终止。培养不同时间的淋巴细胞用作放射自显影、ACA间接免疫荧光染色及Western bolt。各组细胞在取样前4 h均加入秋胺阻断。
, 百拇医药
1.3 放射自显影
加入3H—TdR后不同时间取出的样品细胞用细胞离心涂片机(英国Shandon公司)将细胞离心到载片上，空气干燥后用甲醇：冰醋酸(9：1)室温固定10 min。然后将用蒸馏水稀释后的核子乳胶(1：1)覆盖于细胞上，待载片干燥后将其置入暗盒中，密封后在4℃冰箱中曝光5 d。显影、定影、Geimsa染色，在油镜(Olympus)下观察统计加3H—TdR后的不同样品中淋巴细胞总数、其中被3H—TdR标记上的细胞数以及M期的细胞数。
1.4 ACA间接免疫荧光染色[2]
未经培养的淋巴细胞、加PHA后培养36 h、加3H—TdR后12 h、18 h、24 h、30 h、36 h的淋巴细胞均用细胞离心涂片机将不同样品细胞离心到小盖片上，用预冷至-20℃的丙酮固定。用ACA血清为一抗(1∶200)孵育，并置入4℃冰箱中过夜，二抗用FITC标记的羊抗人IgG(军事医学科学院流行病研究所供)1∶20稀释，一抗、二抗孵育后均用PBS充分漂洗。甘油+PBS封片，Olympus荧光显微镜观察并摄片。同时用正常人血清代替ACA血清作阴性对照实验。
, http://www.100md.com
1.5 蛋白免疫印迹(Western blot)法[2]
加PHA后培养36 h、加3H—TdR后不同时间取样的淋巴细胞以及未经培养的新鲜淋巴细胞均用细胞裂解液(5 %Tris-Hcl、2.5 %SDS、10 %BME、1mM/LPSF)裂解，提取细胞的总蛋白，100℃煮5 min,用DU—50型紫外分光光度计(美国Beckman公司产)准确测定不同样品的总蛋白含量。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳将各样品中分子量大小不同的蛋白质分离开，分离胶浓度为12 %。采用石墨电极转移装置将SDS—凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。样品膜用0.1M/L冰醋酸室温下处理20 min，以灭活内源性碱性磷酸酶。2 %BSA+TBST封闭30 min，ACA血清(1∶1000稀释)为一抗孵育1 h，TBST充分漂洗，碱性磷示记的羊抗人IgG(美国Promega公司产品)为二抗(1∶10000稀释)，孵育30 min,TBST充分漂洗后，显色(Apbuffer+NBT+BCIP)并摄片。同时设不加PHA刺激的新鲜淋巴细胞为对照。
, 百拇医药
2 结果
2.1 3H—TdR标记的淋巴细胞数量
放射自显影结合Olympus显微镜观察结果显示(表1)，加3H—TdR后12 h的淋巴细胞中有少部分细胞核内出现黑色颗粒，表明培养基中的3H—TdR已随这部分细胞核DNA的复制掺入进新合成的DNA分子中，即在PHA的刺激下这部分淋巴细胞已从暂不增殖状态回到细胞周期中，此期进入周期的细胞比例占19.7 %，但此时未见被3H—TdR标记的M期淋巴细胞出现。加3H—TdR后18 h的淋巴细胞中被3H—TdR标记上的细胞数量较前一时期有所增加，并且视野中有被标记上的M期淋巴细胞出现，进入M期的淋巴细胞占统计总数的6.98 %。统计数据显示，随培养时间延长，被3H—TdR标记上的淋巴细胞数量逐渐增多，被3H—TdR标记上的M期细胞比例也逐渐上升。在实验时间范围内，加3H—TdR后36 h，被标记上的淋巴细胞及M期细胞均达到高峰，此期占统计数约71 %的细胞已恢复增殖能力，进入细胞周期循环。
, 百拇医药
表1 放射自显影测定进入细胞周期的淋巴细胞数量 培养时间
(h)
加3H—TdR
时间(h)
统计细胞
总 数
标记细胞
标记M期细胞
总数
%
总数
%
, 百拇医药
36
0
352
0
0
0
0
48
12
351
69
19.7
0
0
, http://www.100md.com
54
18
351
95
27.1
24
6.8
60
24
353
149
42.2
66
, http://www.100md.com 18.7
66
30
353
185
52.4
85
24.1
72
36
357
252
70.7
, 百拇医药 99
27.7
2.2 淋巴细胞转化前后动粒蛋白含量变化
用抗动粒抗体(ACA)为探针，采用间接免疫荧光染色，测定转化前后淋巴细胞内动粒蛋白含量变化，结果见图1。ACA可特异性地识别淋巴细胞核内的动粒/着丝粒蛋白，并与之结合，染色后核内呈现出特殊的荧光斑点，细胞质内无此种荧光斑点出现。在未加PHA刺激的新鲜淋巴细胞核内可见有微弱的动粒荧光斑点存在，加PHA刺激培养36～48 h的淋巴细胞核内动粒荧光斑点的大小和亮度无明显的变化，培养54 h的淋巴细胞核内动粒荧光斑点的亮度略有增强，培养66～72 h的淋巴细胞核内呈现出明亮、清晰的动粒荧光斑点。用正常人血清代替ACA，染色后细胞核内无荧光斑点出现。
2.3 淋巴细胞转化前后动粒蛋白种类的变化
Western blot结果显示，在培养不同时间的淋巴细胞中，ACA血清能够特异识别并与之结合的动粒蛋白类型不完全一致(图2、表2)。对照组淋巴细胞和加PHA后培养至48 h的细胞内，能被ACA血清特异识别的动粒蛋白带纹有两条，分子量为17KD和52KD，培养54 h后增加了一条微弱的分子量为80KD带纹，培养至60 h的细胞中又多了一条分了量为56 KD带纹，继续培养到66～72 h的细胞中，可被ACA血清特异识别的动粒蛋白带纹保持在四条，但分子量为80KD和56KD两种蛋白的带纹染色加深。17KD和52KD两种动粒蛋白在转化前后及培养不同时间的淋巴细胞中基本保持稳定。
, 百拇医药
图1 ACA间接免疫荧光染色显示加PHA(2μg/ml)刺激不
同时间的正常人外周血淋巴细胞内动粒蛋白含量的变化
A 对照组(未经培养的淋巴细胞) B 培养36 h的淋巴细胞
C 培养54 h的淋巴细胞D 培养72 h的淋巴细胞
表2 培养不同时间的淋巴细胞内动粒蛋白类型 Control
加PHA刺激
36 h
48 h
54 h
60 h
, 百拇医药
66 h
72 h
17KD
17KD
17KD
17KD
17KD
17KD
17KD
52KD
52KD
52KD
52KD
, 百拇医药
52KD
52KD
52KD
-
-
-
-
56KD
56KD
56KD
-
-
-
80KD
, http://www.100md.com
80KD
80KD
80KD
图2 Western blot显示加PHA刺激培养不同时间的正常
人外周血淋巴细胞中动粒蛋白组分和含量的变化。
A 低分子量标准蛋白 B 培养72 h的淋巴细胞
C 培养54 h的淋巴细胞 D 培养36 h的淋巴细胞
E 对照组(未经培养的淋巴细胞)
3 讨论
, http://www.100md.com
正常人外周血中的淋巴细胞是一种保持了增殖潜能而处于暂不增殖状态的细胞，一般可在外周血中循环数年都不分裂，但在抗原或植物细胞凝集素的刺激下可恢复其增殖能力，进入细胞周期循环[7]。动粒蛋白作为真核细胞染色体上的一个重要结构，目前认为它可能与细胞增殖、分化、衰老有关。本研究发现，在抗肿瘤药物三尖杉酯碱诱导HL60细胞和L1210细胞程序死亡过程中，细胞内动粒蛋白含量逐渐降低[2，3]，种类逐渐减少。孙红等发现RA诱导HL60细胞分化成熟时细胞内动粒蛋白含量也降低[6]。Cox等发现Hela细胞中分子量为14和34KD两种动粒蛋白的合成受到周期性的调节[8，9]。笔者的研究显示，新鲜外周血中处于暂不增殖状态的淋巴细胞中动粒荧光斑点微小，且模糊不清。在PHA刺激后淋巴细胞的转化过程中，随着被3H—TdR标记上的进入周期的淋巴细胞数量增多，细胞内动粒荧光斑点逐渐变亮、变清晰，表明细胞内动粒蛋白含量逐渐上升。Western blot显示，转化前后及培养时间长短不同的淋巴细胞中动粒蛋白种类也是不同的。分子量为17KD和52KD两种动粒蛋白在对照淋巴细胞和加PHA刺激培养不同时间的淋巴细胞中均存在，但它们在培养至72 h的细胞中含量较丰富。本研究曾发现，在旺盛增殖的人急性早幼粒白血病HL60细胞和抗肿瘤药物三尖杉酯碱诱导发生程序死亡的HL60细胞中均有17KD和52KD两种动粒蛋白存在，但在恶性增殖的HL60细胞内含量更丰富[2]。Earnshaw等在人宫颈癌Hela细胞内也发现有17KD蛋白存在[10]。分子量为56KD和80KD两种动粒蛋白则随进入细胞周期的淋巴细胞数量的增多而发生动态变化。当淋巴细胞培养至54 h时，Western blot出现了一种新的80KD动粒蛋白，之后，该种蛋白带纹随培养时间延长而加深。当细胞培养至60 h时，又出现了一条新的分子量为56 KD的动粒蛋白，该种蛋白含量也随细胞培养时间的延长而逐渐增加。在旺盛增殖的HL60细胞中也有56KD和80KD两种动粒蛋白存在。在Hela细胞中也发现有80KD蛋白存在，但在Hela细胞中未发现有56KD蛋白存在[5，10]。
, 百拇医药
本研究结果提示，淋巴细胞内动粒蛋白含量和种类变化与淋巴细胞增殖密切相关。那么淋巴细胞转化过程中细胞内动粒蛋白含量和种类为什么会发生变化?还有待进一步研究。
参考文献
1 Moroi Y, Peebles C, Fritzler MJ.Autoantibody to centromere(Kinetochore)in scleroderma sera. Proc Natl Acad Sci USA, 1980;77(3):1627
2 梁素华，杨新林，彭安等.三尖杉酯碱对HL60细胞动粒蛋白B基因表达的影响.解剖学报，1998；29(2)：190
3 梁素华，彭安，杨新林等.三尖杉酯碱对L1210细胞中动粒蛋白组分及CENP—B基因表达的影响.科学通报(待发)
, 百拇医药
4 梁素华，陈家诗.几种培养细胞动粒的比较研究.四川大学学报(自然科学版)，1996；33:278
5 杨新林，李时，梁素华等.哺乳动物的几种培养细胞的动粒蛋白的研究.解剖学报，1994；25(4)：385
6 孙红，王永潮.HL—60细胞分化对动粒蛋白及其基因表达的影响.北京师范大学学报(自然科学版)，1995；31(4)：521
7 汪德耀主编.普通细胞生物学.上海科技出版社，1998
8 Cox JV, Olmsted JB.Molecular biology of the cytoskeleton. New York:Cold Spring Harbor Lab, 1984;71～77
9 Cox JV, Schenk EA. Olmsted JB.Human anticentromere antibodies:distribution characterization of antigens and effect on microtubule organization. Cell, 1983;35:331
10 Earnshaw WC, Rothfield N.Identification of a family of human centromere proteins using autimmune sera from patients with scleroderma. Chromosoma(Berl), 1985;91(3/4):313
(收稿日期：1999-04-12), http://www.100md.com