吸水链霉菌FC904(Streptomyces hygroscopicus FC904)原生质体形成的影响因素
作者：强华 黄捷
单位：强华 (福建医科大学微生物学教研室 福州 350004)；黄捷 (福建省微生物研究所 福州 350007)
关键词：吸水链霉菌FC904；原生质体；制备
福建医科大学学报990215
目的 探讨吸水链霉菌FC904(S.hygroscopicus FC904)原生质体形成的影响因素。方法 用溶菌酶处理S.hygroscopicus FC904的菌丝体，比较在不同条件下原生质体的形成数。结果 S.hygroscopicus FC904在不同条件下原生质体的形成数不同,其原生质体形成的最适条件为：在菌丝体生长培养基中添加0.7%甘氨酸及10%的蔗糖；采用生长旺盛期的菌丝体制备原生质体；溶菌酶适宜浓度为2mg/ml；溶菌温度范围30～37℃；溶菌前每毫升压积菌丝体宜用P缓冲液5ml悬浮。结论 菌丝体生长培养基成分、菌龄、溶菌酶浓度、溶菌温度是影响S.hygroscopicus FC904原生质体形成的主要因素。
, 百拇医药
Factors Affecting the Formation of Protoplasts from Streptomyces hygroscopicus FC904
Qiang Hua
(Department of Microbiology,Fujian Medical University,Fuzhou,350004)
Huang Jie
(Fujian Institute of Microbiology,Fuzhou,350007)
Objective To study the factors affecting the formation of protoplasts from Streptomyces.hygroscopic(S.hygroscopicus) FC904.Methods Mycelia of S.hygroscopicus FC904 were treated with lysozyme and the numbers of protoplasts under different conditions were compared.Results The numbers of protoplasts under different conditions were different.The optimal conditions for the formation of the protoplasts are:(1)Media for mycelia growth should be supplemented with 0.7% glycine and 10% sucrose.(2)Mycelia used for preparing protoplasts should be acquired from mycelia in exponential phase.(3)Optimal concentration of lysozyme is 2mg/ml.(4)Favorable lytic temperature is 30～37℃.(5) Before digesting,1ml mycelia debris should be suspended in 5ml P buffer.Conclusion Component of the media for mycelia growth, growth phase of the mycelia,lysozyme concentration and lytic temperature are the main factors affecting the formation of protoplast from S.hygroscopicus FC904.
, 百拇医药
Key words Streptomyces hygroscopicus FC904;protoplast;preparation
新型强效免疫抑制剂雷帕霉素以其强效低毒而备受世人注目。吸水链霉菌FC904(S.hygroscopicus FC904)是福建省微生物研究所分离的能产生雷帕霉素的菌株。本文摸索该产生菌原生质体形成的最适条件，为进一步进行诱变育种、原生质体融合以及遗传学研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 菌株 S.hygroscopicus FC904
1.2 菌丝体培养基 由葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，K2HPO4.3H2O，MgSO4.7H2O组成。
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1.3 主要试剂 甘氨酸(上海新华化工厂),溶菌酶(上海伯奥生物科技公司),原生质体缓冲液(P缓冲液)按文献[1]配制。
1.4 原生质体制备
在菌丝体生长培养基中添加10%蔗糖及0.7%甘氨酸，移种入孢子斜面培养物，于26℃振荡培养(200r/min)42～46h；离心收集菌丝体，加入P缓冲液洗涤菌丝体两遍,每遍离心(3000r/min)10min，弃上清液；每毫升压积菌丝体加入P缓冲液5ml悬浮；加入溶菌酶(P缓冲液配制，25nm纤维微孔滤膜过滤,终浓度2mg/ml),30～37℃作用60min，其间每隔15min用无菌吸管吹打以利原生质体释放,并取样用显微镜观察原生质体形成情况。酶解结束用差速离心除去未酶解菌丝体，过滤收集原生质体，用血细胞计数器计数，比较在不同因素下原生质体的形成数。
2 结 果
在添加有甘氨酸及蔗糖的培养基中生长的菌丝体有利于制备原生质体，其浓度以甘氨酸0.7%及蔗糖10%最为适宜。不同菌龄的菌丝体对溶菌酶的敏感度不同，处于生长旺盛期(菌龄42～46h)的菌丝体最有利于该菌株原生质体的形成。适合于该菌株原生质体形成的溶菌酶浓度为2mg/ml,继续提高溶菌酶浓度，原生质体形成数不再提高。有利于S.hygroscopicus FC904原生质体形成的适宜温度范围为30～37℃。溶菌前的菌丝体密度也会影响溶菌效果，离心后每毫升压积菌丝体宜加P缓冲液5ml悬浮(表1,2)。
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表1 不同因素对S.hygroscopicus FC904原生质体形成的影响 影响因素
平均原生质体数(个/ml)
甘氨酸+蔗糖浓度(%)
0.1+1
0
0.5+5
4.6×107
0.7+5
9.5×107
0.7+10
4.5×108
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0.7+20
2.2×108
菌龄(h)
24～30
0
42～46
3.8×108
50～54
3.0×105
溶菌酶浓度(mg/ml)
0.5
0
, 百拇医药
1.0
6.5×105
2.0
4.1×108
4.0
4.6×108
溶菌温度(℃)
26
4.5×105
30
3.6×108
, 百拇医药
37
3.5×108
表2 菌丝体密度对S.hygroscopicus FC904原生质体形成的影响 菌丝体压积∶P缓冲液体积
平均原生质体数(个/ml)
1∶2
7.7×105
1∶5
4.3×108
1∶8
4.8×108
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3 讨 论
原生质体无细胞壁，有利于生化或遗传操作。原生质体的分离依赖于菌丝细胞壁在裂解酶中的降解，同时受菌丝体培养基的成分、菌龄、溶菌酶浓度及酶解温度等因素的影响。由于不同微生物的遗传及生理特征各不相同，因此，原生质体的分离制备因种而异，必须摸索适合于各自菌株的最佳原生质体形成条件。
(1)在添加适当浓度的甘氨酸及蔗糖的培养基中生长的菌丝体有利于制备原生质体。细胞壁肽聚糖中的四肽侧链由L-丙氨酸、D-谷氨酸、L-赖氨酸和D-丙氨酸组成[2]，甘氨酸可以替代肽聚糖中的D-丙氨酸，从而影响细胞壁之间的相互交联，而蔗糖则可能会扰乱菌体生长时的代谢过程[3]。因此，甘氨酸和蔗糖在抑制菌丝体生长的同时也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性，在二者之间必须寻找一个适宜的浓度。对S.hygroscopicus FC904来说，菌丝体生长培养基中添加0.7%甘氨酸与10%蔗糖，最有利于S.hygroscopicus FC904原生质体的形成。
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(2)有报道太长菌龄的菌丝壁易老化增厚，不利于原生质体的释放，太短菌体易破裂，原生质体释放量减少[4]。本文结果也表明菌龄适中，处于对数生长期的菌丝体最有利于该菌株原生质体的形成。
(3)实验表明，溶菌酶浓度>2mg/ml、溶菌温度30～37℃都有利于制备原生质体，但是最佳溶菌酶浓度及溶菌温度应尽可能选择较低者，因为溶菌酶浓度及溶菌温度越高，原生质体越不稳定且易破裂，造成再生困难[3]。
(4)溶菌前菌丝体密度太大也不利于溶菌，因为同等菌量的菌丝体在相同的溶菌酶浓度下，菌丝体密度越大，所用的溶菌酶量就越少。
参考文献
1 邓子新，唐纪良.链霉菌遗传操作手册.长沙：湖南科学技术出版社,1988：173
2 陆德源(编).医学微生物学.第4版.北京：人民卫生出版社,1997：11
3 徐小雪,张庭兰,郑幼霞.影响链霉菌原生质体形成、再生的因素.实验生物学报,1984；17：25
4 韩 黎,陈世平,索继红.微小根毛霉致病株的原生质体形成条件.微生物学通报,1998；25：27
(收稿：1998-10-15 修回：1999-04-16), 百拇医药
单位：强华 (福建医科大学微生物学教研室 福州 350004)；黄捷 (福建省微生物研究所 福州 350007)
关键词：吸水链霉菌FC904；原生质体；制备
福建医科大学学报990215
目的 探讨吸水链霉菌FC904(S.hygroscopicus FC904)原生质体形成的影响因素。方法 用溶菌酶处理S.hygroscopicus FC904的菌丝体，比较在不同条件下原生质体的形成数。结果 S.hygroscopicus FC904在不同条件下原生质体的形成数不同,其原生质体形成的最适条件为：在菌丝体生长培养基中添加0.7%甘氨酸及10%的蔗糖；采用生长旺盛期的菌丝体制备原生质体；溶菌酶适宜浓度为2mg/ml；溶菌温度范围30～37℃；溶菌前每毫升压积菌丝体宜用P缓冲液5ml悬浮。结论 菌丝体生长培养基成分、菌龄、溶菌酶浓度、溶菌温度是影响S.hygroscopicus FC904原生质体形成的主要因素。
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Factors Affecting the Formation of Protoplasts from Streptomyces hygroscopicus FC904
Qiang Hua
(Department of Microbiology,Fujian Medical University,Fuzhou,350004)
Huang Jie
(Fujian Institute of Microbiology,Fuzhou,350007)
Objective To study the factors affecting the formation of protoplasts from Streptomyces.hygroscopic(S.hygroscopicus) FC904.Methods Mycelia of S.hygroscopicus FC904 were treated with lysozyme and the numbers of protoplasts under different conditions were compared.Results The numbers of protoplasts under different conditions were different.The optimal conditions for the formation of the protoplasts are:(1)Media for mycelia growth should be supplemented with 0.7% glycine and 10% sucrose.(2)Mycelia used for preparing protoplasts should be acquired from mycelia in exponential phase.(3)Optimal concentration of lysozyme is 2mg/ml.(4)Favorable lytic temperature is 30～37℃.(5) Before digesting,1ml mycelia debris should be suspended in 5ml P buffer.Conclusion Component of the media for mycelia growth, growth phase of the mycelia,lysozyme concentration and lytic temperature are the main factors affecting the formation of protoplast from S.hygroscopicus FC904.
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Key words Streptomyces hygroscopicus FC904;protoplast;preparation
新型强效免疫抑制剂雷帕霉素以其强效低毒而备受世人注目。吸水链霉菌FC904(S.hygroscopicus FC904)是福建省微生物研究所分离的能产生雷帕霉素的菌株。本文摸索该产生菌原生质体形成的最适条件，为进一步进行诱变育种、原生质体融合以及遗传学研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 菌株 S.hygroscopicus FC904
1.2 菌丝体培养基 由葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，K2HPO4.3H2O，MgSO4.7H2O组成。
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1.3 主要试剂 甘氨酸(上海新华化工厂),溶菌酶(上海伯奥生物科技公司),原生质体缓冲液(P缓冲液)按文献[1]配制。
1.4 原生质体制备
在菌丝体生长培养基中添加10%蔗糖及0.7%甘氨酸，移种入孢子斜面培养物，于26℃振荡培养(200r/min)42～46h；离心收集菌丝体，加入P缓冲液洗涤菌丝体两遍,每遍离心(3000r/min)10min，弃上清液；每毫升压积菌丝体加入P缓冲液5ml悬浮；加入溶菌酶(P缓冲液配制，25nm纤维微孔滤膜过滤,终浓度2mg/ml),30～37℃作用60min，其间每隔15min用无菌吸管吹打以利原生质体释放,并取样用显微镜观察原生质体形成情况。酶解结束用差速离心除去未酶解菌丝体，过滤收集原生质体，用血细胞计数器计数，比较在不同因素下原生质体的形成数。
2 结 果
在添加有甘氨酸及蔗糖的培养基中生长的菌丝体有利于制备原生质体，其浓度以甘氨酸0.7%及蔗糖10%最为适宜。不同菌龄的菌丝体对溶菌酶的敏感度不同，处于生长旺盛期(菌龄42～46h)的菌丝体最有利于该菌株原生质体的形成。适合于该菌株原生质体形成的溶菌酶浓度为2mg/ml,继续提高溶菌酶浓度，原生质体形成数不再提高。有利于S.hygroscopicus FC904原生质体形成的适宜温度范围为30～37℃。溶菌前的菌丝体密度也会影响溶菌效果，离心后每毫升压积菌丝体宜加P缓冲液5ml悬浮(表1,2)。
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表1 不同因素对S.hygroscopicus FC904原生质体形成的影响 影响因素
平均原生质体数(个/ml)
甘氨酸+蔗糖浓度(%)
0.1+1
0
0.5+5
4.6×107
0.7+5
9.5×107
0.7+10
4.5×108
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0.7+20
2.2×108
菌龄(h)
24～30
0
42～46
3.8×108
50～54
3.0×105
溶菌酶浓度(mg/ml)
0.5
0
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1.0
6.5×105
2.0
4.1×108
4.0
4.6×108
溶菌温度(℃)
26
4.5×105
30
3.6×108
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3.5×108
表2 菌丝体密度对S.hygroscopicus FC904原生质体形成的影响 菌丝体压积∶P缓冲液体积
平均原生质体数(个/ml)
1∶2
7.7×105
1∶5
4.3×108
1∶8
4.8×108
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3 讨 论
原生质体无细胞壁，有利于生化或遗传操作。原生质体的分离依赖于菌丝细胞壁在裂解酶中的降解，同时受菌丝体培养基的成分、菌龄、溶菌酶浓度及酶解温度等因素的影响。由于不同微生物的遗传及生理特征各不相同，因此，原生质体的分离制备因种而异，必须摸索适合于各自菌株的最佳原生质体形成条件。
(1)在添加适当浓度的甘氨酸及蔗糖的培养基中生长的菌丝体有利于制备原生质体。细胞壁肽聚糖中的四肽侧链由L-丙氨酸、D-谷氨酸、L-赖氨酸和D-丙氨酸组成[2]，甘氨酸可以替代肽聚糖中的D-丙氨酸，从而影响细胞壁之间的相互交联，而蔗糖则可能会扰乱菌体生长时的代谢过程[3]。因此，甘氨酸和蔗糖在抑制菌丝体生长的同时也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性，在二者之间必须寻找一个适宜的浓度。对S.hygroscopicus FC904来说，菌丝体生长培养基中添加0.7%甘氨酸与10%蔗糖，最有利于S.hygroscopicus FC904原生质体的形成。
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(2)有报道太长菌龄的菌丝壁易老化增厚，不利于原生质体的释放，太短菌体易破裂，原生质体释放量减少[4]。本文结果也表明菌龄适中，处于对数生长期的菌丝体最有利于该菌株原生质体的形成。
(3)实验表明，溶菌酶浓度>2mg/ml、溶菌温度30～37℃都有利于制备原生质体，但是最佳溶菌酶浓度及溶菌温度应尽可能选择较低者，因为溶菌酶浓度及溶菌温度越高，原生质体越不稳定且易破裂，造成再生困难[3]。
(4)溶菌前菌丝体密度太大也不利于溶菌，因为同等菌量的菌丝体在相同的溶菌酶浓度下，菌丝体密度越大，所用的溶菌酶量就越少。
参考文献
1 邓子新，唐纪良.链霉菌遗传操作手册.长沙：湖南科学技术出版社,1988：173
2 陆德源(编).医学微生物学.第4版.北京：人民卫生出版社,1997：11
3 徐小雪,张庭兰,郑幼霞.影响链霉菌原生质体形成、再生的因素.实验生物学报,1984；17：25
4 韩 黎,陈世平,索继红.微小根毛霉致病株的原生质体形成条件.微生物学通报,1998；25：27
(收稿：1998-10-15 修回：1999-04-16), 百拇医药