孕酮对大鼠颌下腺表皮生长因子及其受体表达的影响
作者：林志明 林文霖 周瑞祥
单位：林志明 林文霖 (福建卫生学校 福州 350001)；周瑞祥 (福建医科大学组织胚胎学教研室 福州 350004)
关键词：孕酮；表皮生长因子；颌下腺；大鼠
福建医科大学学报990213 目的 探讨孕酮对大鼠颌下腺表皮生长因子(EGF)及其受体(EGFR)表达的影响。方法 用免疫组化方法观察注射1，3，5和7天孕酮后，成年雌性SD大鼠颌下腺EGF、EGFR表达及颗粒曲管(GCT)形态的改变。结果 与对照组比较，注射孕酮1天组，EGF的阳性表达最强，3天组较强，5天组减弱，7天组复又增强；EGFR的表达1,3天组减弱，5天组增强，7天组复又减弱，与EGF的表达基本相反。GCT最宽径及细胞高度的变化与EGFR的变化基本一致，或滞后出现。结论 孕酮促进大鼠颌下腺GCT合成EGF，EGF与EGFR之间存在反向调节，GCT的变化与EGFR的含量有关。
, 百拇医药
Influence of Progesterone on Epidermal Growth Factor and its Receptor Expression in Submandibular Gland of Rats
Lin Zhiming Lin Wenlin
(Fujian Health School,Fuzhou,350001)
Zhou Ruixiang
(Department of Histology ＆ Embryology,Fujian Medical University,Fuzhou,350004)
Objective To investigate the effect of progesterone on epidermal growth factor(EGF) and EGF receptor(EGFR) expression in submandibular gland of rats.Methods With immunohistochemical SP method,EGF and EGFR were investigated and the morphological parameters of granular convoluted tubule(GCT) were measured respectively in submandibular gland(SMG) of adult female SD rat injected by progesterone for 1,3,5 and 7 days(d).Results Compared with the untreated group,the expression of EGF,after the injection of progesterone,increased sharply and obviously in group 1d and group 3d,decreased in group 5d ,and then increased again in group 7d.But the expression of EGFR after the injection,decreased in group 1d and in group 3d ,increased in group 5d and then decreased again in group 7d.So it was contrary to that of EGF.The change of the diameter of GCT and the height of its cells was almost the same as that of EGFR or in a delayed fashion.Conclusion That progesterone would enhance the GCT cells in SMG of rats to synthesize EGF.Down-regulation lies between EGF and EGFR,the change of the GCT is related to the amount of EGFR.
, 百拇医药
Key words progesterone;epidermal growth factor;submandibular gland;rat
表皮生长因子(EGF)是Cohen从小鼠颌下腺提取的20多种生物活性多肽之一，主要定位于大、小鼠颌下腺颗粒曲管(GCT)细胞内，其合成和分泌具有明显的性差异[1]。许多学者的研究表明，雄激素对颌下腺GCT的发育及EGF的合成有明显的促进作用。近来有学者报道雌激素在调节颌下腺EGF的表达方面与雄激素有对抗作用或没有作用[2,3]。有关孕酮、妊娠影响下颌下腺EGF表达的报道不一致[4,5]，下颌下腺EGF受体(EGFR)定位研究报道甚少。本实验观察EGF、EGFR在大鼠颌下腺的定位，孕酮对二者的表达及GCT形态的影响，探讨其间相互关系。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组及模型制作
, 百拇医药
成年雌性SD大鼠20只，体重180～200g，随机分为对照组和实验组。两组动物每天均经阴道涂片观察其动情周期。对照组4只于动情间期放血处死取材；实验组16只，每个时间组4只，自动情间期开始肌肉注射孕酮(0.33mg.kg-1.d-1)，分别于注射1，3，5，7天后的次日上午放血处死，取颌下腺。
1.2 免疫组织化学方法
颌下腺经改良Bouin液固定，石蜡包埋，制成6μm厚连续切片，间隔30μm贴片，每只动物各取5片。切片经常规脱蜡水化后，入0.01mol/L,pH 6.0柠檬酸缓冲液，置于压力锅(浙江苏泊尔有限公司)内高压喷气1min，迅速冷却，PBS冲冼，分别进行EGF、EGFR免疫组织化学SP法染色，DAB显色，苏木精复染。兔抗人EGF、EGFR，SP试剂盒(即用型)均购自福州迈新公司，孕酮为上海第一制药厂产品。
, http://www.100md.com
1.3 统计 EGF、EGFR阳性表达 在显微镜下(×400)观察EGF、EGFR在颌下腺GCT内的阳性表达，每张切片于左上、右上、中间、左下、右下，随机取5个GCT，分别判定其EGF、EGFR表达程度，每组动物观察100个结构。EGF按颗粒密度分为±～+
6个等级；EGFR分为-～6个等级，数据经Ridit分析并进行显著性检验。
GCT最宽径及细胞高度 在显微镜下(×400)，观察EGFR表达的同时，用校正测微尺测量GCT正横切面的最宽外径，观察部位和数量同EGFR，并在显微镜下(×600)，观察经HE染色的GCT细胞高度，每组动物观察400个细胞。所得结果经方差分析，各组间两两比较。
2 结 果
, 百拇医药 EGF、EGFR主要定位于颌下腺GCT，颗粒呈浅黄色至棕褐色。EGF的阳性表达较EGFR强(图1)。EGF主要分布于GCT细胞的胞浆内，管腔内亦可见；EGFR主要分布于GCT细胞的胞浆，胞核内偶见(图2)。
图1 对照组 GCT内EGF阳性表达 ×400
图2 EGFR在GCT细胞核内的表达(苏木精复染) ×400
与对照组比较，注射孕酮1天，EGF表达最强，EGFR表达减弱；3天 EGF表达较强，EGFR表达继续减弱；5天 EGF表达减弱，EGFR表达开始增强；至7天 EGF表达复又增强(图3)，EGFR表达复又减弱，二者强弱的变化基本相反(图4)。
, 百拇医药
图3 注射孕酮7天，GCT内EGF阳性表达复又增强.×400
图4 孕酮对GCT内EGF、EGFR表达的影响
孕酮对EGF、EGFR表达与GCT最宽径及细胞高度的影响见附表。
附表 孕酮对大鼠颌下腺EGF、EGFR表达与GCT最宽径和细胞高度的影响 分组
EGF
EGFR
GCT最宽径(μm)
GCT细胞高度(μm)
对照组
, 百拇医药
0.50±0.06
0.50±0.06
49.20±2.8
17.10±1.12
孕酮组
第1组
0.70±0.06*
0.48±0.06
45.60±2.16*
16.60±0.98
第2组
, 百拇医药 0.59±0.06△
0.43±0.06
43.03±1.16**
16.10±0.99
第3组
0.49±0.06△
0.58±0.06☆
38.14±0.66**△△☆☆
13.83±0.51**△△☆☆
第4组
, 百拇医药
0.64±0.06*▲
0.38±0.06*▲
41.22±2.38**△▲
15.92±0.71▲▲
第1～4组，分别注射孕酮1，3，5，7天.与对照组比较，*：P<0.05，**：<0.01.与孕酮1天组比较，△：P<0.05，△△ ：P<0.01.与3天组比较，☆ ：P<0.05，☆☆ ：P<0.01.与5天组比较，▲:P<0.05，▲▲：P<0.01.
3 讨 论
3.1 孕酮作为一种性激素，对EGF合成的调节是本文探讨的问题之一。注射孕酮后，EGF的表达与对照组比较，总的变化呈增强趋势。Bullock等人报道，给小鼠注射醋酸甲基乙酰氧孕酮后，颌下腺EGF浓度增加40倍以上[4]，本文支持孕酮促进EGF合成的观点。此外，注射孕酮后的不同时期，颌下腺EGF表达的变化，可能表明当EGF含量下降时，孕酮以促进其合成为主；当EGF含量增高时，则以促进其分泌为主。
, 百拇医药
3.2 EGFR在颌下腺的定位研究甚少，笔者观察到大鼠颌下腺内EGFR的广泛表达，且主要定位在GCT细胞内，与EGF的定位相同，说明GCT细胞也具有一般内分泌细胞所具有的自分泌现象[6]。此外，孕酮影响EGFR表达的变化，与EGF的变化相反，当EGF表达增强时，EGFR的表达减弱，反之亦然，可能是孕酮通过影响EGF的含量进而影响EGFR的表达。有学者报道EGF和EGFR之间存在着反向调节。当EGF浓度增加时，EGFR的数量迅速减少，结合的活性明显降低[7]，本研究结果证实了这一点。
3.3 本实验注射孕酮1～5天后，与对照组比较，GCT细胞高度逐渐变低，其正横切面最宽径逐渐变小，7天组较5天组稍增大，但总体变化呈变小趋势。有报道孕酮、雌激素、妊娠引起GCT面积变小[8]，但其机制未见说明。笔者观察到GCT最宽径及细胞高度的变化与EGFR的变化基本一致，或滞后出现。本研究提示，GCT形态的变化与EGFR的含量有关。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Barka T.Biologically active polypeptide in submandibular glands.Histochem Cytochem,1980;28:836
2 Tuomela T,Miettinen P,Viinikka L,et al.Estrogen-androgen antagonism in the regulation of epidermal growth factor in mouse submandibular salivary gland and kidneys.Life Sci,1990;47:1925
3 Sawada K,Noumura T.Effects of castration and sex steroids on sexually dimorphic development of the mouse submandibular gland.Acta Anat,1991;140:97
, http://www.100md.com
4 Bullock LP,Barthe PL,Mowszowicz I,et al.The effect of progestins on submaxillary gland epidermal growth factor:demonstration of androgenic,synandrogenic and antiandrogenic actions.Endocrinology,1975;97:189
5 Tuomela T,Viinikka L,Perheentupa J.Epidermal growth factor in mice:changes during circadian and female reproductive cycles.Acta Endocrinologica,1990;123: 643
6 Berlove DT.Co-localization of putative vasopression receptors and vasopressinery in neurons in rat.Histochem,1990;94:653
7 张建福,郭世燕.上皮生长因子-尿抑胃素.生理科学进展,1984;15:151
8 Rins-de-David ML,Finkelberg-de-Sterin A,Godraij-A.Influence of gonadic hormones on the rat submaxillary gland.Arch Int Physiol Biochem Biophys,1991;99:107
(收稿:1999-02-08 修回:1999-04-22), 百拇医药
单位：林志明 林文霖 (福建卫生学校 福州 350001)；周瑞祥 (福建医科大学组织胚胎学教研室 福州 350004)
关键词：孕酮；表皮生长因子；颌下腺；大鼠
福建医科大学学报990213 目的 探讨孕酮对大鼠颌下腺表皮生长因子(EGF)及其受体(EGFR)表达的影响。方法 用免疫组化方法观察注射1，3，5和7天孕酮后，成年雌性SD大鼠颌下腺EGF、EGFR表达及颗粒曲管(GCT)形态的改变。结果 与对照组比较，注射孕酮1天组，EGF的阳性表达最强，3天组较强，5天组减弱，7天组复又增强；EGFR的表达1,3天组减弱，5天组增强，7天组复又减弱，与EGF的表达基本相反。GCT最宽径及细胞高度的变化与EGFR的变化基本一致，或滞后出现。结论 孕酮促进大鼠颌下腺GCT合成EGF，EGF与EGFR之间存在反向调节，GCT的变化与EGFR的含量有关。
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Influence of Progesterone on Epidermal Growth Factor and its Receptor Expression in Submandibular Gland of Rats
Lin Zhiming Lin Wenlin
(Fujian Health School,Fuzhou,350001)
Zhou Ruixiang
(Department of Histology ＆ Embryology,Fujian Medical University,Fuzhou,350004)
Objective To investigate the effect of progesterone on epidermal growth factor(EGF) and EGF receptor(EGFR) expression in submandibular gland of rats.Methods With immunohistochemical SP method,EGF and EGFR were investigated and the morphological parameters of granular convoluted tubule(GCT) were measured respectively in submandibular gland(SMG) of adult female SD rat injected by progesterone for 1,3,5 and 7 days(d).Results Compared with the untreated group,the expression of EGF,after the injection of progesterone,increased sharply and obviously in group 1d and group 3d,decreased in group 5d ,and then increased again in group 7d.But the expression of EGFR after the injection,decreased in group 1d and in group 3d ,increased in group 5d and then decreased again in group 7d.So it was contrary to that of EGF.The change of the diameter of GCT and the height of its cells was almost the same as that of EGFR or in a delayed fashion.Conclusion That progesterone would enhance the GCT cells in SMG of rats to synthesize EGF.Down-regulation lies between EGF and EGFR,the change of the GCT is related to the amount of EGFR.
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Key words progesterone;epidermal growth factor;submandibular gland;rat
表皮生长因子(EGF)是Cohen从小鼠颌下腺提取的20多种生物活性多肽之一，主要定位于大、小鼠颌下腺颗粒曲管(GCT)细胞内，其合成和分泌具有明显的性差异[1]。许多学者的研究表明，雄激素对颌下腺GCT的发育及EGF的合成有明显的促进作用。近来有学者报道雌激素在调节颌下腺EGF的表达方面与雄激素有对抗作用或没有作用[2,3]。有关孕酮、妊娠影响下颌下腺EGF表达的报道不一致[4,5]，下颌下腺EGF受体(EGFR)定位研究报道甚少。本实验观察EGF、EGFR在大鼠颌下腺的定位，孕酮对二者的表达及GCT形态的影响，探讨其间相互关系。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组及模型制作
, 百拇医药
成年雌性SD大鼠20只，体重180～200g，随机分为对照组和实验组。两组动物每天均经阴道涂片观察其动情周期。对照组4只于动情间期放血处死取材；实验组16只，每个时间组4只，自动情间期开始肌肉注射孕酮(0.33mg.kg-1.d-1)，分别于注射1，3，5，7天后的次日上午放血处死，取颌下腺。
1.2 免疫组织化学方法
颌下腺经改良Bouin液固定，石蜡包埋，制成6μm厚连续切片，间隔30μm贴片，每只动物各取5片。切片经常规脱蜡水化后，入0.01mol/L,pH 6.0柠檬酸缓冲液，置于压力锅(浙江苏泊尔有限公司)内高压喷气1min，迅速冷却，PBS冲冼，分别进行EGF、EGFR免疫组织化学SP法染色，DAB显色，苏木精复染。兔抗人EGF、EGFR，SP试剂盒(即用型)均购自福州迈新公司，孕酮为上海第一制药厂产品。
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1.3 统计 EGF、EGFR阳性表达 在显微镜下(×400)观察EGF、EGFR在颌下腺GCT内的阳性表达，每张切片于左上、右上、中间、左下、右下，随机取5个GCT，分别判定其EGF、EGFR表达程度，每组动物观察100个结构。EGF按颗粒密度分为±～+
6个等级；EGFR分为-～6个等级，数据经Ridit分析并进行显著性检验。GCT最宽径及细胞高度 在显微镜下(×400)，观察EGFR表达的同时，用校正测微尺测量GCT正横切面的最宽外径，观察部位和数量同EGFR，并在显微镜下(×600)，观察经HE染色的GCT细胞高度，每组动物观察400个细胞。所得结果经方差分析，各组间两两比较。
2 结 果
, 百拇医药 EGF、EGFR主要定位于颌下腺GCT，颗粒呈浅黄色至棕褐色。EGF的阳性表达较EGFR强(图1)。EGF主要分布于GCT细胞的胞浆内，管腔内亦可见；EGFR主要分布于GCT细胞的胞浆，胞核内偶见(图2)。
图1 对照组 GCT内EGF阳性表达 ×400
图2 EGFR在GCT细胞核内的表达(苏木精复染) ×400
与对照组比较，注射孕酮1天，EGF表达最强，EGFR表达减弱；3天 EGF表达较强，EGFR表达继续减弱；5天 EGF表达减弱，EGFR表达开始增强；至7天 EGF表达复又增强(图3)，EGFR表达复又减弱，二者强弱的变化基本相反(图4)。
, 百拇医药
图3 注射孕酮7天，GCT内EGF阳性表达复又增强.×400
图4 孕酮对GCT内EGF、EGFR表达的影响
孕酮对EGF、EGFR表达与GCT最宽径及细胞高度的影响见附表。
附表 孕酮对大鼠颌下腺EGF、EGFR表达与GCT最宽径和细胞高度的影响 分组
EGF
EGFR
GCT最宽径(μm)
GCT细胞高度(μm)
对照组
, 百拇医药
0.50±0.06
0.50±0.06
49.20±2.8
17.10±1.12
孕酮组
第1组
0.70±0.06*
0.48±0.06
45.60±2.16*
16.60±0.98
第2组
, 百拇医药 0.59±0.06△
0.43±0.06
43.03±1.16**
16.10±0.99
第3组
0.49±0.06△
0.58±0.06☆
38.14±0.66**△△☆☆
13.83±0.51**△△☆☆
第4组
, 百拇医药
0.64±0.06*▲
0.38±0.06*▲
41.22±2.38**△▲
15.92±0.71▲▲
第1～4组，分别注射孕酮1，3，5，7天.与对照组比较，*：P<0.05，**：<0.01.与孕酮1天组比较，△：P<0.05，△△ ：P<0.01.与3天组比较，☆ ：P<0.05，☆☆ ：P<0.01.与5天组比较，▲:P<0.05，▲▲：P<0.01.
3 讨 论
3.1 孕酮作为一种性激素，对EGF合成的调节是本文探讨的问题之一。注射孕酮后，EGF的表达与对照组比较，总的变化呈增强趋势。Bullock等人报道，给小鼠注射醋酸甲基乙酰氧孕酮后，颌下腺EGF浓度增加40倍以上[4]，本文支持孕酮促进EGF合成的观点。此外，注射孕酮后的不同时期，颌下腺EGF表达的变化，可能表明当EGF含量下降时，孕酮以促进其合成为主；当EGF含量增高时，则以促进其分泌为主。
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3.2 EGFR在颌下腺的定位研究甚少，笔者观察到大鼠颌下腺内EGFR的广泛表达，且主要定位在GCT细胞内，与EGF的定位相同，说明GCT细胞也具有一般内分泌细胞所具有的自分泌现象[6]。此外，孕酮影响EGFR表达的变化，与EGF的变化相反，当EGF表达增强时，EGFR的表达减弱，反之亦然，可能是孕酮通过影响EGF的含量进而影响EGFR的表达。有学者报道EGF和EGFR之间存在着反向调节。当EGF浓度增加时，EGFR的数量迅速减少，结合的活性明显降低[7]，本研究结果证实了这一点。
3.3 本实验注射孕酮1～5天后，与对照组比较，GCT细胞高度逐渐变低，其正横切面最宽径逐渐变小，7天组较5天组稍增大，但总体变化呈变小趋势。有报道孕酮、雌激素、妊娠引起GCT面积变小[8]，但其机制未见说明。笔者观察到GCT最宽径及细胞高度的变化与EGFR的变化基本一致，或滞后出现。本研究提示，GCT形态的变化与EGFR的含量有关。
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参考文献
1 Barka T.Biologically active polypeptide in submandibular glands.Histochem Cytochem,1980;28:836
2 Tuomela T,Miettinen P,Viinikka L,et al.Estrogen-androgen antagonism in the regulation of epidermal growth factor in mouse submandibular salivary gland and kidneys.Life Sci,1990;47:1925
3 Sawada K,Noumura T.Effects of castration and sex steroids on sexually dimorphic development of the mouse submandibular gland.Acta Anat,1991;140:97
, http://www.100md.com
4 Bullock LP,Barthe PL,Mowszowicz I,et al.The effect of progestins on submaxillary gland epidermal growth factor:demonstration of androgenic,synandrogenic and antiandrogenic actions.Endocrinology,1975;97:189
5 Tuomela T,Viinikka L,Perheentupa J.Epidermal growth factor in mice:changes during circadian and female reproductive cycles.Acta Endocrinologica,1990;123: 643
6 Berlove DT.Co-localization of putative vasopression receptors and vasopressinery in neurons in rat.Histochem,1990;94:653
7 张建福,郭世燕.上皮生长因子-尿抑胃素.生理科学进展,1984;15:151
8 Rins-de-David ML,Finkelberg-de-Sterin A,Godraij-A.Influence of gonadic hormones on the rat submaxillary gland.Arch Int Physiol Biochem Biophys,1991;99:107
(收稿:1999-02-08 修回:1999-04-22), 百拇医药