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编号:10222751
HBV前C/C基因EB病毒载体的构建及在HepG2细胞中的表达*
http://www.100md.com 《第一军医大学学报》 1999年第2期
     作者:周福元 隋礼丽 骆抗先

    单位:第一军医大学南方医院感染内科,广州,510515

    关键词:乙型肝炎病毒;变异;EB病毒载体;表达

    第一军医大学学报990201 摘要:目的 研究HBV 前C/C区基因变异的生物学意义。方法 构建HBV前C/C区基因EB病毒表达载体,采用脂质体介导方法将重组质粒转染到HepG2细胞,并表达HBeAg。结果 重组质粒经PCR和酶切鉴定均阳性,转染的细胞目的DNA和表达蛋白检测均阳性。结论 采用EB病毒载体构建HBV前C/C基因的表达载体,能在HepG2细胞中稳定表达目的蛋白。由于EB病毒载体以附着体的形式复制,不整合于宿主染色体基因中,拷贝数稳定,适合于体外研究HBV C/C基因变异的生物学意义。

    中图分类号:R512.6
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    Construction of Esptein-Barr viral vector with hepatitis B virus pre C/C gene and its expression in HepG2 cells

    Zhou Fuyuan, Sui Lili, Luo Kangxian

    Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515

    Abstract: Objective To study the biological significance of HBV preC/C gene mutation. Methods EB viral expression vector with HBV preC/C gene was constructed and transfected into HepG2 cells by means of lipoinfectin induction, and HBeAg was expressed in the transfected cells. Results The recombinant plasmid was detected positive by means of PCR and enzyme digestion, the goal DNA was contained and the goal protein was expressed in the transfected cells. Conclusion EB viral expression vector with HBV preC/C gene can express the goal protein in HepG2 cells steadily. Because EB viral vector do not integrated into the host chromogene and its copies keep steady, it can be used to study the biological significance of HBV preC/C gene mutation in vitro.
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    Key words: hepatitis B virus; mutation; EB viral vector; expression

    乙型肝炎病毒(HBV)HBcAg和HBeAg是HBV特异性的杀伤性T淋巴细胞(CTL)的主要靶抗原, 在病毒性乙型肝炎的发病机理中起着重要作用。为研究HBV前C/C区基因变异的生物学意义,作者采用质粒EBO-plpp构建了HBV前C/C区基因的表达载体, 并在HepG2中表达了HBeAg。

    1 材料与方法

    1.1 质粒 EBO-plpp由美国Scripps研究室Francis V. Chisari博士惠赠,其结构示意图如图1。

    图1 质粒EBO-plpp的结构示意图
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    Fig.1 Structure of expression vector EBO-plpp

    1.2 引物设计 5’端引物为:5’-CGTAAG-CTTTCACCAGCACCATGCAAC-3’, 3’端引物为:5’-TGTGGTACCAGCGCTGCGTGTAGTTTCTC-3’,扩增区段位于HBV1803-2804,包含HBV前C/C区,5’端引物含HindIII酶切位点,3’端引物含KpnI酶切位点。

    1.3 目的基因的制备 以质粒pcp10(含双拷贝ayw亚型HBV DNA)为模板,以上述引物扩增含HBV前C/C基因的DNA序列,经Hind III、Kpn I双酶切后,低溶点琼脂糖回收。

    1.4 载体的制备 小量抽提质粒EBO-plpp,经Hind III、Kpn I双酶切后,低溶点琼脂糖回收。

    1.5 目的基因和载体的连接、转化 目的基因和载体在T4连接酶的作用下,15 ℃连接过夜。取连接产物2 m l转化感受态细菌XL1-blue ,在Amp抗性培养板中37 ℃过夜。
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    1.6 重组质粒的鉴定 同时采用PCR和双酶消化两种方法。

    1.7 重组质粒转染HeG2细胞 采用脂质体介导方法。当HepG2细胞长满约70%培养瓶底部时进行转染。2 m g重组质粒和10 m l脂质体加入到总体积为200 m l的DMEM培养液中混匀30 min,再以0.8 ml DMEM培养液混合,缓慢加入到HepG2细胞中,5 h后加1ml含20%血清的DMEM培养液,48 h后1:15传代,潮霉素筛选。

    1.8 目的蛋白表达的检测 采用ELISA方法。

    2 结果

    2.1 EBO-plpp-前C/C重组质粒鉴定 结果见图2。从重组质粒可扩增出与目的DNA相同大小的片段,重组质粒经Hind III、Kpn I双酶切后,可得到分别与目的DNA和载体相同大小的两个片段。
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    图2 EBO-plpp-HBV前C/C重组质粒PCR 和酶切鉴定结果

    Fig.2 PCR and enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid pXT1-HBVc and EBO-plpp-HBVcL1: negative control; L2: λ DNA Hind Ⅲ/EcoRI; L3:positive control; L4: PCR product of the recombinant plasmid; L5: two-enzyme digestion of the recombinant plasmid; L6,7: single enzyme digestion of the recombinant plasmid; L8: profile of the recombinant plasmid

    2.2重组质粒转染HepG2细胞的鉴定 转染的HepG2细胞经潮霉素筛选后,提取细胞DNA,以上述引物扩增出与目的DNA相同大小的片段。
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    2.3重组质粒在HepG2 细胞中的表达 培养过夜的细胞上清经ELISA法检测,HBeAg阳性,分别以2.2.15细胞和未转染的HeG2细胞上清作阳性、阴性对照。

    3 讨论HBeAg和HBcAg是HBV特异性CTL的主要靶抗原,在病毒性乙型肝炎的发病机理中起着重要作用。HBV 前C/C区碱基突变,往往影响HBeAg和HBcAg的CTL作用表位,从而与疾病活动有关[1,2]。但HBV变异引起疾病活动改变的机理至今尚未阐明。为研究HBV前C/C区基因变异的生物学意义,我们应用EB病毒质粒EBO-plpp构建了HBV前C/C区基因的表达载体,并在HepG2细胞中表达目的蛋白,为研究HBV前C/C区基因变异的生物学意义奠定基础。

    质粒EBO-plpp为真核细胞稳定表达载体,由于具有源于EB病毒的质粒复制子(ORIP)和EB病毒核抗原基因(EBNA-1),它在真核细胞中以附着体的形式存在,独立复制与表达,不受宿主细胞的影响[3,4]。它带有潮霉素和氨苄青霉素抗性基因,两个SV40早期启动子分别启动潮霉素磷酸转移酶基因和外源基因的表达。一个SV40晚期启动子启动EBNA-1基因的表达。由于重组质粒EBO-plpp-前C/C在HepG2细胞中能保持稳定的状态,它的复制和表达不受整合于宿主细胞染色体的影响,另外,重组质粒在宿主细胞中的数量也比较稳定,保持在2~10个拷贝[3,4],有利于比较目的基因变异引起的生物学意义的改变。
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    参考文献

    1 骆抗先,朱幼芙,杨 洁等.乙型肝炎病毒感染时的C基因热点变异.中华实验和临床病毒学杂志,1997,11(1):29

    2 骆抗先, 侯金林, 梁炽森.乙型肝炎病毒感染及病毒变异. 中华传染病杂志,1996,14(2):101

    3 Guilhot H, Fowler P, Portillo G et al. Hepatitis B virus(HBV)-specific cytotoxic T-cell response in humans: production of target cells by stable expression of HBV-encoded protein in immortalized human B-cell lines. J Virol, 1992, 66(5): 2670

    4 Margolskee RF, Kavathas P, Berg P. Epstein-Barr virus shuttle vector for stable episomal replication of cDNA expression libraries in human cells. Mol Cell Biol, 1988,7: 2837

    (收稿日期:1998-10-12), 百拇医药