新型表皮细胞生物膜移植物的研究
作者：焦向阳 邢新 Stark GB Kopp J
单位：焦向阳 邢新 第二军医大学附属长海医院整形外科(上海，200433)；Stark GB Kopp J Department of Plastic and Hand Surgery, Freiburg University, Germany
关键词：表皮细胞；生物膜；生物膜细胞移植物； 创面愈合
中国修复/990212 【摘 要】 目的 将人表皮细胞接种到生物膜上构建一种新的表皮替代物——表皮细胞生物膜移植物(MCG)。方法 新鲜和冷冻保存的MCG移植到裸鼠全厚皮肤缺损创面，以单纯无接种细胞的生物膜作为对照。并行组织学、免疫组织化学及电镜观察。结果 表皮细胞可以生物膜为载体在体外进行培养，达60%～70%亚饱和状态时，表皮细胞生物膜可一起移植到创面，在创面上表皮细胞继续增殖分化，形成一层新生表皮。结论 表皮细胞生物膜移植物可作为一种新型表皮替代物修复皮肤缺损。
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THE STUDY OF NEW BIO-MEMBRANE-BRED EPIDERMAL CELL GRAFTS
JIAO Xiang-yang, Kopp J, XING Xin, et al.
Department of Plastic Surgery, Changhai Hospital, the Second Military Medical University. Shanghai, P.R. China 200443. E-mail: jscao ＠ ecmu.org.cn
【Abstract】 Objective The human epidermal cells were bred on a kind of bio-membrane, the bio-brane, in engineering a kind of new epidermal substitute, the bio-membrane bred cell graft. Methods Fresh and frozen grafts of biomembrane bred epidermal cells were transplanted into the full-thickness wounds of nude mice and those received simple Bio-brane were served as control. The wounds of the two groups were observed daily and biopsy was taken on the 3,5,7,10,21 and 35 days respectively. Results Epidermal cells could be cultured in vitro on the bio-membrane reaching the sub-saturated state of 60 to 70 percents. The bio-membrane after being grafted the epidermal cells continued to proliferate and differentiate to form a layer of new epidermis. There was no difference between the fresh and the frozen bio-membranes.Conclusion Bio-membrane bred with epidermal cells could be a kind of ideal epidermal substitute.
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【Key words】 Epidermal cell Bio-membrane Membrane-bred epidermal cell graft Wound healing
现代烧伤治疗已经拯救了大部分严重烧伤患者的生命，但如何处理巨大的烧伤创面仍然是个问题[1]。随着表皮细胞体外培养技术的开展，用培养的表皮细胞膜片移植覆盖创面已得到广泛应用。经过长期的临床观察，这种方法存在一些缺点，如耗时长，从取材到培养成完整的膜片需3～4周；细胞膜片菲薄易碎，难以操作；移植到创面后，接受率低，极易造成移植物脱失；即使在上皮化后，新生表皮不耐摩擦， 容易发生水泡， 造成残余创面[2]。
我们利用组织工程方法，在体外构建一种新的表皮替代物。首先在体外培养表皮细胞，将亚饱和状态的表皮细胞接种到一种过去只用来作临时敷料的生物膜上，形成生物膜细胞移植物(membrane cell graft, MCG)。待MCG成熟后，直接用于移植或冻存备用。
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1 材料与方法
1.1 表皮细胞培养
皮肤活检取自整形外科乳房或腹壁整形术患者多余的皮肤。用中性蛋白酶(dispase Ⅱ)将表皮与真皮分开，经胰酶消化、过滤，制成单细胞悬液，用无血清培养基(Gibco, USA)外加牛垂体提取物(25 μg/ml)、表皮生长因子(0.2 ng/ml)及庆大霉素(5 μg/ml)，在37℃，含5% CO2的孵箱内培养。
1.2 接种生物膜
生物膜具有双层结构，表面是一层扁平的硅胶膜，下面是一层整合有许多胶原颗粒的尼龙网。待表皮细胞传第1代时，将细胞接种到生物膜上(硅胶面朝下，将细胞接种到尼龙网面)。表皮细胞在生物膜上迅速增殖扩散，至60%～70%亚饱和状态时，将此移植物作移植或冻存。取部分移植物作体外光镜、电镜检查。
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1.3 移植物冻存
移植物仍保存在培养瓶内，换上含10% DMSO的新鲜培养基，按常规的细胞冻存方法，保存在-85℃。复苏时，将培养瓶置于38℃水浴箱，快速复温，再用新鲜培养基反复换液3～4次。复苏的MCG在孵育箱里培养2～3天后用于移植。
1.4 动物模型
用裸鼠36只，7～8周龄。12只用移植新鲜的MCG；12只用移植冷冻保存1个月的MCG；12只仅用没有接种细胞的生物膜作为对照。麻醉后，于动物背部尾侧正中作1.5 cm×1.5 cm的全层皮肤至肌筋膜切除。创面四角皮肤与肌层固定，覆盖同样大小的移植物，四边正中再缝合一针固定。手术后3、5、7、10、21及35天，每天每只动物伤口拍照，观察伤口愈合情况。每组各取2只动物处死取活检。
1.5 组织学观察
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所取活检组织置于液氮中，制成6 μm厚冰冻切片，常规HE染色。免疫组织化学检查，用抗人HLA-Ⅰ型抗原直接免疫荧光法、抗Laminin间接免疫酶化学法染色。
1.6 电镜观察
标本经固定、脱水及包埋后，扫描电镜下观察。
2 结果
2.1 体外MCG构建
第1代人表皮细胞接种到生物膜上后，可以观察到细胞很快贴膜生长，3天内可形成单层近50%亚饱和状(图1)。光镜、电镜下显示细胞保持高度增殖和移行能力(图2、3)。
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图1 人表皮细胞生物膜载体上培养构成的MCG(×200) 图2 MCG剖面观(范吉森染色×200)
Fig 1 Human epidermal cells bred on biomembrane as a carrier constituting biormembrane-cell graft (×200) Fig 2 Section of membrane cell graft (Van Giesen stain ×200)
图3 电镜下可见表皮细胞已全部覆盖生物膜(×200)
Fig 3 Epidermal cell completely covered the biomembrane under electron microscope (×200)
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2.2 MCG的冻存复苏
复苏后的MCG在显微镜下只见到很少的死细胞，经培养2天后，细胞迅速恢复增殖，与新鲜的MCG无明显区别。
2.3 伤口愈合大体观察
三组所有移植物移植后，很快与创面贴牢。MCG新鲜和冻存组在10天左右，生物膜干燥，大部分翘起，其下可见新生的上皮；约14天生物膜全部脱落，创面全部上皮化，有轻度伤口收缩。对照组约21天生物膜全部脱落，伤口全部上皮化，伤口收缩较明显。
2.4 光镜
MCG新鲜和冻存组无明显区别。第7天HE染色切片提示创面已全部上皮化，但生物膜的尼龙网仍与新生上皮粘附在一起(图4)。第21天，生物膜全部脱落，新生表皮逐渐增厚，抗人HLA-Ⅰ型抗原免疫组织化学染色显示阳性，证明新生表皮由移植的人表皮细胞形成，而不是来源于伤口边缘的自体细胞；抗Laminin染色阳性，提示已形成有成熟的基底膜(图5、6)。对照组第10天，创面尚未全部上皮化，第21天新生表皮已覆盖全部创面，但稍薄，抗Laminin染色阳性，抗HLA-Ⅰ型抗原染色阴性，说明新生表皮来源于伤口边缘的自体细胞。
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图4 MCG新鲜组移植术后第7天(HE×200)
Fig 4 The seventh day after grafting of membrane-cell garft (HE ×200)
图5 MCG冷冻组移植术后第21天(×200) 图6 MCG新鲜组移植术后第21天(×200)
Fig 5 Twenty-first day after grafting of frozen membrane-cell graft (×200) Fig 6 Twenty-first day after grafting of fresh membrane-cell garft(×200)
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2.5 电镜
MCG新鲜移植组第7天，电镜下可见表皮细胞从移植物上向创面移行(图7)。
图7 MCG新鲜组移植术后第7天(×200)
Fig 7 The seventh day after grafting of membrene-cell graft(×200)
3 讨论
生物膜长期以来在临床上被用作一种临时性敷料来覆盖大面积的烧伤创面。因其内层整合有大量胶原颗粒，可以迅速与创面紧密贴附。它允许创面生理性液体蒸发同时可防止蛋白等大分子物质丢失[3]。自1975年Rheinwald等成功地在体外培养大量表皮细胞以来，自体表皮细胞培养移植为大面积创面的修复开辟了新的思路。1979年Green等曾将表皮细胞在体外培养成多层细胞膜片后移植成功，但由于耗时长、不易操作、临床接受率低及新生表皮不耐摩擦等缺点，使这种方法在临床应用上受到很大的限制。近十多年来，许多学者又设计出一些新方法，Bell等[4]将表皮膜片与由成纤维细胞在胶原凝胶中生长形成的代用真皮相结合形成复合皮移植，Stark等报道将单个表皮细胞用纤维素胶制成悬液，利用它特有的粘性将细胞移植到创面。
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我们的研究提出了另一种新的细胞携带系统。将培养的表皮细胞接种到生物膜上，该膜本身的特性有利于细胞增殖和移行。移植到创面后，表皮细胞又可以从膜上移行至创床继续增殖。此时生物膜仍然贴附在创面上，维持着一个很好的内环境，使细胞在体内继续“培养”，直至形成新生表皮。实验结果表明，MCG新鲜组在移植后第7天创面已全部上皮化，第21天已形成成熟的基底膜。抗人HLA-Ⅰ型抗原免疫组织化学染色阳性，证明新生表皮来源于移植的人表皮细胞，而非来自伤口边缘的自体细胞。该研究还探讨了MCG冷冻保存的可能性，证实冷冻保存的MCG和新鲜MCG无明显差异。我们认为MCG是一种耗时短、储存方便，并能促进创面愈合的理想表皮替代物。
4 参考文献
[1] Muller MJ, Herndon DN. The challenge of burns. Lancet, 1994;343(3):216
[2] Herndon DN, Rutan RL. Comparison of cultured epidermal autograft and massive excision with serial autografting plus homograft overlay. J Burn Care Rehabil, 1992;13(2):154
[3] Smith DJ Jr. Use of biobrane in wound managemnt. J Burn Care Rehabil, 1995;16(4):317
[4] Bell E, Ehilich HP, Sher S, et al. Development and use of a living skin equivalent. Plast Reconstr Surg, 1981;67(3):386, http://www.100md.com
单位：焦向阳 邢新 第二军医大学附属长海医院整形外科(上海，200433)；Stark GB Kopp J Department of Plastic and Hand Surgery, Freiburg University, Germany
关键词：表皮细胞；生物膜；生物膜细胞移植物； 创面愈合
中国修复/990212 【摘 要】 目的 将人表皮细胞接种到生物膜上构建一种新的表皮替代物——表皮细胞生物膜移植物(MCG)。方法 新鲜和冷冻保存的MCG移植到裸鼠全厚皮肤缺损创面，以单纯无接种细胞的生物膜作为对照。并行组织学、免疫组织化学及电镜观察。结果 表皮细胞可以生物膜为载体在体外进行培养，达60%～70%亚饱和状态时，表皮细胞生物膜可一起移植到创面，在创面上表皮细胞继续增殖分化，形成一层新生表皮。结论 表皮细胞生物膜移植物可作为一种新型表皮替代物修复皮肤缺损。
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THE STUDY OF NEW BIO-MEMBRANE-BRED EPIDERMAL CELL GRAFTS
JIAO Xiang-yang, Kopp J, XING Xin, et al.
Department of Plastic Surgery, Changhai Hospital, the Second Military Medical University. Shanghai, P.R. China 200443. E-mail: jscao ＠ ecmu.org.cn
【Abstract】 Objective The human epidermal cells were bred on a kind of bio-membrane, the bio-brane, in engineering a kind of new epidermal substitute, the bio-membrane bred cell graft. Methods Fresh and frozen grafts of biomembrane bred epidermal cells were transplanted into the full-thickness wounds of nude mice and those received simple Bio-brane were served as control. The wounds of the two groups were observed daily and biopsy was taken on the 3,5,7,10,21 and 35 days respectively. Results Epidermal cells could be cultured in vitro on the bio-membrane reaching the sub-saturated state of 60 to 70 percents. The bio-membrane after being grafted the epidermal cells continued to proliferate and differentiate to form a layer of new epidermis. There was no difference between the fresh and the frozen bio-membranes.Conclusion Bio-membrane bred with epidermal cells could be a kind of ideal epidermal substitute.
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【Key words】 Epidermal cell Bio-membrane Membrane-bred epidermal cell graft Wound healing
现代烧伤治疗已经拯救了大部分严重烧伤患者的生命，但如何处理巨大的烧伤创面仍然是个问题[1]。随着表皮细胞体外培养技术的开展，用培养的表皮细胞膜片移植覆盖创面已得到广泛应用。经过长期的临床观察，这种方法存在一些缺点，如耗时长，从取材到培养成完整的膜片需3～4周；细胞膜片菲薄易碎，难以操作；移植到创面后，接受率低，极易造成移植物脱失；即使在上皮化后，新生表皮不耐摩擦， 容易发生水泡， 造成残余创面[2]。
我们利用组织工程方法，在体外构建一种新的表皮替代物。首先在体外培养表皮细胞，将亚饱和状态的表皮细胞接种到一种过去只用来作临时敷料的生物膜上，形成生物膜细胞移植物(membrane cell graft, MCG)。待MCG成熟后，直接用于移植或冻存备用。
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1 材料与方法
1.1 表皮细胞培养
皮肤活检取自整形外科乳房或腹壁整形术患者多余的皮肤。用中性蛋白酶(dispase Ⅱ)将表皮与真皮分开，经胰酶消化、过滤，制成单细胞悬液，用无血清培养基(Gibco, USA)外加牛垂体提取物(25 μg/ml)、表皮生长因子(0.2 ng/ml)及庆大霉素(5 μg/ml)，在37℃，含5% CO2的孵箱内培养。
1.2 接种生物膜
生物膜具有双层结构，表面是一层扁平的硅胶膜，下面是一层整合有许多胶原颗粒的尼龙网。待表皮细胞传第1代时，将细胞接种到生物膜上(硅胶面朝下，将细胞接种到尼龙网面)。表皮细胞在生物膜上迅速增殖扩散，至60%～70%亚饱和状态时，将此移植物作移植或冻存。取部分移植物作体外光镜、电镜检查。
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1.3 移植物冻存
移植物仍保存在培养瓶内，换上含10% DMSO的新鲜培养基，按常规的细胞冻存方法，保存在-85℃。复苏时，将培养瓶置于38℃水浴箱，快速复温，再用新鲜培养基反复换液3～4次。复苏的MCG在孵育箱里培养2～3天后用于移植。
1.4 动物模型
用裸鼠36只，7～8周龄。12只用移植新鲜的MCG；12只用移植冷冻保存1个月的MCG；12只仅用没有接种细胞的生物膜作为对照。麻醉后，于动物背部尾侧正中作1.5 cm×1.5 cm的全层皮肤至肌筋膜切除。创面四角皮肤与肌层固定，覆盖同样大小的移植物，四边正中再缝合一针固定。手术后3、5、7、10、21及35天，每天每只动物伤口拍照，观察伤口愈合情况。每组各取2只动物处死取活检。
1.5 组织学观察
, 百拇医药
所取活检组织置于液氮中，制成6 μm厚冰冻切片，常规HE染色。免疫组织化学检查，用抗人HLA-Ⅰ型抗原直接免疫荧光法、抗Laminin间接免疫酶化学法染色。
1.6 电镜观察
标本经固定、脱水及包埋后，扫描电镜下观察。
2 结果
2.1 体外MCG构建
第1代人表皮细胞接种到生物膜上后，可以观察到细胞很快贴膜生长，3天内可形成单层近50%亚饱和状(图1)。光镜、电镜下显示细胞保持高度增殖和移行能力(图2、3)。
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图1 人表皮细胞生物膜载体上培养构成的MCG(×200) 图2 MCG剖面观(范吉森染色×200)
Fig 1 Human epidermal cells bred on biomembrane as a carrier constituting biormembrane-cell graft (×200) Fig 2 Section of membrane cell graft (Van Giesen stain ×200)
图3 电镜下可见表皮细胞已全部覆盖生物膜(×200)
Fig 3 Epidermal cell completely covered the biomembrane under electron microscope (×200)
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2.2 MCG的冻存复苏
复苏后的MCG在显微镜下只见到很少的死细胞，经培养2天后，细胞迅速恢复增殖，与新鲜的MCG无明显区别。
2.3 伤口愈合大体观察
三组所有移植物移植后，很快与创面贴牢。MCG新鲜和冻存组在10天左右，生物膜干燥，大部分翘起，其下可见新生的上皮；约14天生物膜全部脱落，创面全部上皮化，有轻度伤口收缩。对照组约21天生物膜全部脱落，伤口全部上皮化，伤口收缩较明显。
2.4 光镜
MCG新鲜和冻存组无明显区别。第7天HE染色切片提示创面已全部上皮化，但生物膜的尼龙网仍与新生上皮粘附在一起(图4)。第21天，生物膜全部脱落，新生表皮逐渐增厚，抗人HLA-Ⅰ型抗原免疫组织化学染色显示阳性，证明新生表皮由移植的人表皮细胞形成，而不是来源于伤口边缘的自体细胞；抗Laminin染色阳性，提示已形成有成熟的基底膜(图5、6)。对照组第10天，创面尚未全部上皮化，第21天新生表皮已覆盖全部创面，但稍薄，抗Laminin染色阳性，抗HLA-Ⅰ型抗原染色阴性，说明新生表皮来源于伤口边缘的自体细胞。
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图4 MCG新鲜组移植术后第7天(HE×200)
Fig 4 The seventh day after grafting of membrane-cell garft (HE ×200)
图5 MCG冷冻组移植术后第21天(×200) 图6 MCG新鲜组移植术后第21天(×200)
Fig 5 Twenty-first day after grafting of frozen membrane-cell graft (×200) Fig 6 Twenty-first day after grafting of fresh membrane-cell garft(×200)
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2.5 电镜
MCG新鲜移植组第7天，电镜下可见表皮细胞从移植物上向创面移行(图7)。
图7 MCG新鲜组移植术后第7天(×200)
Fig 7 The seventh day after grafting of membrene-cell graft(×200)
3 讨论
生物膜长期以来在临床上被用作一种临时性敷料来覆盖大面积的烧伤创面。因其内层整合有大量胶原颗粒，可以迅速与创面紧密贴附。它允许创面生理性液体蒸发同时可防止蛋白等大分子物质丢失[3]。自1975年Rheinwald等成功地在体外培养大量表皮细胞以来，自体表皮细胞培养移植为大面积创面的修复开辟了新的思路。1979年Green等曾将表皮细胞在体外培养成多层细胞膜片后移植成功，但由于耗时长、不易操作、临床接受率低及新生表皮不耐摩擦等缺点，使这种方法在临床应用上受到很大的限制。近十多年来，许多学者又设计出一些新方法，Bell等[4]将表皮膜片与由成纤维细胞在胶原凝胶中生长形成的代用真皮相结合形成复合皮移植，Stark等报道将单个表皮细胞用纤维素胶制成悬液，利用它特有的粘性将细胞移植到创面。
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我们的研究提出了另一种新的细胞携带系统。将培养的表皮细胞接种到生物膜上，该膜本身的特性有利于细胞增殖和移行。移植到创面后，表皮细胞又可以从膜上移行至创床继续增殖。此时生物膜仍然贴附在创面上，维持着一个很好的内环境，使细胞在体内继续“培养”，直至形成新生表皮。实验结果表明，MCG新鲜组在移植后第7天创面已全部上皮化，第21天已形成成熟的基底膜。抗人HLA-Ⅰ型抗原免疫组织化学染色阳性，证明新生表皮来源于移植的人表皮细胞，而非来自伤口边缘的自体细胞。该研究还探讨了MCG冷冻保存的可能性，证实冷冻保存的MCG和新鲜MCG无明显差异。我们认为MCG是一种耗时短、储存方便，并能促进创面愈合的理想表皮替代物。
4 参考文献
[1] Muller MJ, Herndon DN. The challenge of burns. Lancet, 1994;343(3):216
[2] Herndon DN, Rutan RL. Comparison of cultured epidermal autograft and massive excision with serial autografting plus homograft overlay. J Burn Care Rehabil, 1992;13(2):154
[3] Smith DJ Jr. Use of biobrane in wound managemnt. J Burn Care Rehabil, 1995;16(4):317
[4] Bell E, Ehilich HP, Sher S, et al. Development and use of a living skin equivalent. Plast Reconstr Surg, 1981;67(3):386, http://www.100md.com