转化人胚肌腱细胞的体外培养及生物学特性研究
作者：杨志明 解慧琪 项舟 李胜富 魏启欧
单位：杨志明 解慧琪 项舟 华西医科大学附属第一医院骨科(成都，610041)，李胜富 魏启欧 移植免疫实验室
关键词：人胚肌腱细胞；转化细胞；体外培养；生物学特性
中国修复/990211 【摘 要】 目的 研究经pts A58H质粒转化的人胚肌腱细胞的生物学特性，探讨细胞生长特性与体外培养条件改变的关系。方法 取人胚肌腱细胞和经pts A58H质粒转化的人胚肌腱细胞，进行体外培养。对细胞进行形态学、超微结构及一般特征的观察。在不同培养条件下进行生长曲线绘制，平板克隆实验和软琼脂培养以及免疫组织化学法胶原染色。结果 在正常培养条件下，人胚肌腱细胞和转化人胚肌腱细胞的生长性状几乎无差异，且冻存复苏并不改变其生长特性。在39.5℃及35℃进行条件培养，转化细胞的生长特性发生改变。转化细胞能长期传代，增殖能力强，并存在接触抑制现象和血清营养依赖性，在软琼脂中不能生长，具有分泌Ⅰ型胶原的能力。结论 经pts A58H质粒转化的人胚肌腱细胞可长期连续传代。通过改变培养条件可控制其生长。无肿瘤细胞的生物学特点。可作为组织工程化肌腱的标准细胞。
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CULTURE OF THE TRANSFORMED HUMAN EMBRYONIC TENDON CELLS AND ITS BIOLOGICAL CHARACTERISTICS IN VITRO
YANG Zhi-ming, XIE Hui-qi, XIANG Zhou, et al.
Department of Orthopedic Surgery, First University Hospital, West China University of Medical Sciences. Chengdu Sichuan, P.R. China 610041. E-mail: orthop ＠ public.cd.sc.cn
【Abstract】 Objective This paper was to study the biological characteristics of the transformed human embryonic tendon cells, the relation between cell growth and culture conditions, and to compare these features with that of human embryonic tendon cells. Methods The pts A58H plasmid had successfully used to transform a tendon cell line from human embryo in our past work. The human embryonic tendon cells and the transformed human embryonic tendon cells were cultured in vitro. In different culture conditions, the growth curve were drawn respectively. Population dependence and proliferation capability of the cells were investigated through plate cloning test and soft agar culture. The collagen secreted by cells was identified by immunohistochemical method. Results In routine culture condition, the growth properties of the human embryonic tendon cell and transformed cells were almost identical. The growth properties of the transformed cells were not changed when the cells were frozen storage. There were changes of growth characteristics of the transformed cells when the culture temperature was changed. The transformed cells could subcultured continually and permanently. The proliferation capability of the transformed cells were stronger than that of the human embryonic tendon cells. Moreover, the growth of the transformed cells was serum-dependent, and the phenomenon of contact inhibition was observed. The transformed cells were not able to grow on soft agar culture. They had the capacity of secreting collagen type Ⅰ. Conclusion The transformed human embryonic tendon cells could be subcultured continually and permanently, and their growth could be controlled by changing their culture conditions and they hadno malignant tendency in biological characteristics. They could be taken as an ideal experimental material for tendon engineering.
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【Key words】 Human embryonic tendon cell Transformed cell Culture in vitro Biological characteristics
Foundation item: Natural Sciences Foundation of China (39870202), China Medical Board of New York (CMB)
人胚肌腱细胞在体外培养传代到第13代后，细胞的增殖能力就变得十分低下，不能适应组织工程的需要[1，2]。Gerhard等[3]研究了SV40大T抗原的结构区。我们用电穿孔法将SV40温度依赖株质粒pts A58H导入肌腱细胞，并经潮霉素B筛选，获得了阳性克隆，扩增后建立转化人胚肌腱细胞系，细胞可长期连续传代。我们的实验旨在了解该转化人胚肌腱细胞的生物学特性，探讨细胞生长特性与体外培养条件的关系，为构建组织工程人工化肌腱建立标准细胞提供细胞学理论基础。
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1 材料与方法
1.1 材料来源
肌腱取自自然流产的5月龄胎儿屈指肌腱，F12培养基及新生小牛血清(FCS)，系Gibco公司产品，经灭活过滤除菌及去支原体处理。免疫组织化学试剂(Ⅰ型、Ⅲ型胶原抗体等)，由北京中山生物技术有限公司提供。
1.2 人胚肌腱细胞培养
人胚肌腱细胞的分离培养，按Handerson分步酶消化法进行[4]。肌腱细胞的生物学形为及鉴定已于1995年报道过[5]，不再赘述。
1.3 转化人胚肌腱细胞的传代，冻存与复苏
用由Jefferson Cancer Institute, Thomas Jefferson University赠送的pts A58H质粒导入建立的转化人胚肌腱细胞，可进行连续传代。传代培养时，一般2天换培养液一次，半量换液。细胞融合成单层细胞后及时进行传代培养。
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冻存时，首先消化悬浮细胞，1 200 r/min离心6分钟，弃上清液，加入1.5 ml冻存保护液(F12培养基加入20% FCS，10%二甲基亚砜液)。置冻存管中，封口。经-85℃冰箱过夜后转至-152℃深低温冰箱。
复苏时，取出冻存管，迅速置入37℃水浴中溶解，吸细胞悬液至离心管中，加入含10% FCS的F12培养基，洗涤、离心二次，接种入培养瓶中。第2天换培养液一次。
按“慢冻快融”[6]法，隔代细胞进行冻存。取第54代连续传代的转化人胚肌腱细胞(transformed human embryonic tendon cell 54, THETC 54)，并复苏第38代转化人胚肌腱细胞(THETC 38)及第3代人胚肌腱细胞(Human embryonic tendon cell 3, HETC 3)进行实验。
1.4 生长曲线绘制
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取上述各代次细胞，0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液，血细胞计数板计数后定量接种于12孔培养板上培养，每3孔为一实验组，每24小时检测一组，每组计数六次，取平均值绘制曲线，即为生长曲线。在下列条件下绘制生长曲线：①37℃，F12+10% FCS。②39.5℃,F12+10% FCS； 39.5℃，F12+10% FCS培养1天→37℃，F12+10% FCS培养7天；37℃，F12+10% FCS。③35℃，F12+10% FCS；37℃，F12+10% FCS。④37℃，F12+10% FCS；37℃，F12+5% FCS；37℃，F12+2% FCS；37℃,F12+1% FCS。
1.5 克隆形成率测定
取上述各代次细胞及舌癌Tca 8 113细胞(取自华西医科大学分子生物学教研室)，消化制成细胞悬液，稀释，定量接种于6孔板(50个/孔)。台盼蓝染色计算活细胞率，置F12+10% FCS培养10天。甲醇固定，Giemsa染色，37℃，20分钟。于倒置显微镜下计算形成克隆数(以10个以上细胞团为一个克隆)，取平均值，计算克隆形成率，公式如下：
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克隆形成率=(形成克隆数)/(接种细胞数×活细胞率)×100%
1.6 软琼脂培养
取THETC 54，舌癌Tca 8 113细胞作软琼脂培养。称量琼脂糖，分别用三蒸水配制1.2%，0.7%的溶液。混匀，高压灭菌后，置于50℃水浴中。配制2×F12(2×抗生素，20% FCS)。1∶1混合1.2%琼脂糖和2×F12，定量加入6孔板中，室温下待其凝固。消化悬浮细胞，计数。取0.5 ml细胞悬液，加入2×F12+0.7%琼脂糖中(1∶1)。定量加入6孔板中。制成双层软琼脂培养基。置37℃，5% CO2孵箱中培养10天，观察形成克隆数。
1.7 形态及超微结构观察
取THETC 54，消化，悬浮离心收集细胞，3%戊二醛固定24小时，1%四氧化锇固定2小时后，逐级脱水，环氧树脂618包埋，切片、染色，于日本电子公司JEM-100 SX透射电镜下观察并照像。
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1.8 免疫组织化学法测定胶原类型
在6孔板中置入2 cm×2 cm载玻片，分别接种THETC 54、THETC 38和HETC 3三种细胞进行实验。37℃，5% CO2条件下培养细胞7天，在载玻片上细胞贴壁生长至单层细胞后，免疫组织化学法进行Ⅰ型、Ⅲ型胶原染色。每例均以省略一抗作空白对照。
2 结果
2.1 转化人胚肌腱细胞的生长特性
2.1.1 一般特征 人胚肌腱细胞原代培养时，刚游离出的肌腱细胞呈圆形，有折光性，36小时后大部分细胞贴壁，48小时后贴壁细胞延展为梭形，7～9天形成单层细胞。传代细胞一般6小时贴壁，18小时延展为梭形，5～7天可形成单层细胞。转化人胚肌腱细胞悬浮时呈圆形，有折光性，2～3小时后大部分细胞贴壁，10小时后贴壁细胞延展为梭形，4～5天形成单层细胞(图1)。体外培养人胚肌腱细胞的最佳条件为：温度37℃、饱和湿度，5% CO2浓度，培养液pH值为7.2。
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图1 转化人胚肌腱细胞贴壁生长，为梭形( ×40)
Fig 1 The spindle transformed human embryonic tendon cells grow closly to the wall ( ×40)
2.1.2 生长曲线 ①HETC 3、THETC 54及THETC 38三种细胞，在37℃，F12+10% FCS的生长曲线如图2所示，细胞倍增时间为20～36小时，4～6天生长达高峰，以后生长缓慢。三条曲线基本吻合，说明转化人胚肌腱细胞在连续传代及复苏后生长性状与人胚肌腱细胞相比无差异。②THETC 54，在39.5℃连续培养8天；在39.5℃培养1天转至37℃继续培养7天；在37℃连续培养8天，三条生长曲线如图3所示。由图可见连续39.5℃培养8天，细胞起初仍能保持增殖，但随时间延长，生长速度骤减，以后渐趋平稳。而39.5℃培养1天转至37℃继续培养，可见转入37℃后细胞能恢复生长。因pts A58H质粒为温度敏感性质粒，用该质粒转化哺乳动物细胞后，转化细胞呈现温度依赖性生长。该质粒在39.5℃失活，可见体外培养控制温度可以改变转化细胞的生长特性。③THETC 54，在35℃，F12+10% FCS时生长曲线如图4。由图可见细胞生长延缓，潜伏期明显延长。细胞倍增时间为5天，细胞生长增殖较在37℃时明显受到抑制，但仍能维持生长。④THECT 54，在不同血清浓度下生长曲线如图5所示。由图可见细胞在10% FCS中正常生长，细胞倍增时间约24小时，4～6天生长达高峰，以后生长缓慢。在5%、2%及1% FCS中培养时，细胞生长潜伏期明显延长，细胞增殖减缓，仅能维持生长，说明转化细胞生长仍存在血清营养依赖性。
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图2 各代次细胞在正常条件下的生长曲线图 图3 THETC 54在不同温度下的生长曲线图
Fig 2 The growth curves of different cells in normal condition Fig 3 The growth curves of THETC 54 in different temperature
图4 THETC 54在35℃的生长曲线图 图5 THETC 54在不同血清浓度下的生长曲线图
Fig 4 The growth curves of THETC 54 under 35℃ Fig 5 The growth curves of THETC 54 in different serum concentration
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2.1.3 克隆形成率测定 HETC 3克隆形成率为25%；THETC 54为37.3%；THETC 38为39.1%；舌癌Tca 8 113细胞为83%。
2.1.4 软琼脂培养 THETC 54在软琼脂中不能生长形成克隆，而对照组舌癌Tca 8 113细胞在软琼脂中可以形成克隆。
2.2 转化人胚肌腱细胞形态及超微结构
转化人胚肌腱细胞贴壁生长后形态呈梭形，细胞两极突起较长，在形成单层细胞后，细胞间隙变小，胞内可见小颗粒。细胞排列规则，有接触抑制现象。Giemsa染色显示：胞核为紫红色，圆形或椭圆形，居胞质中央，核仁多为一个，胞浆为淡紫色，胞质内有深染小颗粒(图6)。各代次细胞形态无明显差异。透射电镜见胞核为不规则形，核膜有凹陷， 核仁明显， 细胞表面有少许伪足，胞质内有胞饮小泡，粗面内质网丰富，中等数量线粒体及核蛋白体，少量溶酶体，说明细胞合成胶原活动旺盛(图7)。
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图6 转化人胚肌腱细胞(Giemsa染色 ×100)
Fig 6 Transformed human embryonic tendon cells (Giemsa ×100)
图7 转化人胚肌腱细胞透射电镜观察，粗面内质网丰富，中等数量线粒体及核蛋白体(EM ×100)
Fig 7 Electronmicrograph of transformed human embryonic tendon cells, abundant coarse endoplasmic reticulum, moderate mitochondrion and ribosome (EM ×100)
2.3 免疫组织化学法测定胶原类型
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经Ⅰ型、Ⅲ型胶原抗体染色后，人胚肌腱细胞与转化人胚肌腱细胞Ⅰ型胶原染色细胞内均可见棕黄色点状分布的颗粒(阳性)，胞核蓝色，而Ⅲ型胶原染色为阴性。
3 讨论
我们采用显微外科技术，移除了人胚肌腱外膜组织。再用短时整段肌腱的酶消化后，移去残存的外膜细胞，最后用胰蛋白酶及胶原酶混合液消化肌腱碎块，游离出肌腱细胞，获取比较纯净的肌腱细胞。用国外最新构建的带有潮霉素B筛选标记的SV40温度依赖株质粒pts A58H，采用电穿孔法将其导入肌腱细胞，并经潮霉素B筛选，获得了阳性克隆，扩增后建立转化人胚肌腱细胞系，选用F12培养液成功地传代培养了65代转化人胚肌腱细胞，经冻存复苏后，观察到冻存对转化细胞的生长、形态与合成胶原的能力无明显影响。转化细胞在温度37℃，饱和湿度，5% CO2浓度，培养液pH值为7.2时，细胞生长最为旺盛。传代培养时，一般2天换培养液一次，换液时须保留原液的一半，以免细胞外环境改变太大，不利于细胞生长。细胞融合成单层后应及时传代，以免因接触抑制、代谢产物积聚而引起死亡。在冻存和复苏时按“慢冻快融”的原则进行，使冻存的细胞温度逐次降低而冻结，复苏时快速解冻，迅速通过最易使细胞受损的温度(-5℃～0℃)。
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转化细胞的致瘤性是必须研究的问题，细胞的生物学特性是常用的方法之一，包括形态观察，超微结构观察，细胞生长曲线，克隆形成率测定等。
细胞生长曲线是一定数量的细胞在一定空间的培养皿中贴壁生长的细胞数与时间的关系曲线，一般可分为潜伏期，指数增生期和平顶期。细胞数量增加一倍的时间称细胞倍增时间，可从细胞生长曲线中测知。细胞生长曲线是反映细胞增殖生长力的重要指标。我们的研究结果表明，在正常培养条件下，转化人胚肌腱细胞与人胚肌腱细胞的生长性状几乎无差异，且冻存复苏并不改变其生长特性。通过39.5℃和35℃条件培养，见控制温度可改变转化人胚肌腱细胞的生长特性，且其生长存在血清营养依赖性。
细胞的转化可分为一般转化和恶性转化二种。一般转化细胞伸展良好，呈单层生长，有方向性，有接触抑制现象，具永生性，对血清要求较高，在软琼脂培养中不能生长等。而恶性转化细胞则具有伸展性差，核质比例增大，接触抑制消失，可呈重叠生长，对血清要求较低，在软琼脂培养中可以生长等特点。本实验结果证实，我们建立的转化人胚肌腱细胞增殖能力强于人胚肌腱细胞，但无肿瘤细胞的特征性改变。透射电镜观察细胞超微结构亦证明转化的人胚肌腱细胞并无恶性倾向，且仍有正常分泌Ⅰ型胶原的能力，这对于以后组织工程化肌腱的构建具有十分重要意义。
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4 小结
通过对人胚肌腱细胞与pts A58H质粒转化的人胚肌腱细胞的形态、功能及生长特性等方面的测试，我们认为这二种细胞在正常培养条件下生长性状无差异。通过条件培养，可以控制转化人胚肌腱细胞的生长，其增殖能力强，可长期连续传代，且具有正常分泌Ⅰ型胶原的功能。从细胞生物学特点来看，该转化人胚肌腱细胞无恶性肿瘤转化倾向。为组织工程化肌腱的研究提供了标准细胞。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870202)；美国纽约中华医学基金会(CMB)资助项目
5 参考文献
[1] 项 舟，杨志明，魏大鹏，等.类胰岛素生长因子1促腱细胞生长的实验研究.中华手外科杂志，1997；13(3)：183
[2] 项 舟，杨志明，夏庆杰，等.类胰岛素生长因子1及其受体mRNA在培养肌腱细胞内的表达.中国修复重建外科杂志，1997；11(6)：369
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[3] Gerhard L, Mary JT. Temperature-sensitive matarts identity crusial structural regions of simian virus 40 large t antigen. J Virology, 1989;63(10):4426
[4] Handerson G. Attachment and extracellular matrix differences between tendon and synovial fibroblastic cell. In Vitro, 1983;19(2):127
[5] 蔚 凡，杨志明，彭文珍.人胚腱细胞体外培养及生物学特性的研究.中国修复重建外科杂志，1995；9(3)：161
[6] 鄂 征.组织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社，1995：88～91, 百拇医药
单位：杨志明 解慧琪 项舟 华西医科大学附属第一医院骨科(成都，610041)，李胜富 魏启欧 移植免疫实验室
关键词：人胚肌腱细胞；转化细胞；体外培养；生物学特性
中国修复/990211 【摘 要】 目的 研究经pts A58H质粒转化的人胚肌腱细胞的生物学特性，探讨细胞生长特性与体外培养条件改变的关系。方法 取人胚肌腱细胞和经pts A58H质粒转化的人胚肌腱细胞，进行体外培养。对细胞进行形态学、超微结构及一般特征的观察。在不同培养条件下进行生长曲线绘制，平板克隆实验和软琼脂培养以及免疫组织化学法胶原染色。结果 在正常培养条件下，人胚肌腱细胞和转化人胚肌腱细胞的生长性状几乎无差异，且冻存复苏并不改变其生长特性。在39.5℃及35℃进行条件培养，转化细胞的生长特性发生改变。转化细胞能长期传代，增殖能力强，并存在接触抑制现象和血清营养依赖性，在软琼脂中不能生长，具有分泌Ⅰ型胶原的能力。结论 经pts A58H质粒转化的人胚肌腱细胞可长期连续传代。通过改变培养条件可控制其生长。无肿瘤细胞的生物学特点。可作为组织工程化肌腱的标准细胞。
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YANG Zhi-ming, XIE Hui-qi, XIANG Zhou, et al.
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【Abstract】 Objective This paper was to study the biological characteristics of the transformed human embryonic tendon cells, the relation between cell growth and culture conditions, and to compare these features with that of human embryonic tendon cells. Methods The pts A58H plasmid had successfully used to transform a tendon cell line from human embryo in our past work. The human embryonic tendon cells and the transformed human embryonic tendon cells were cultured in vitro. In different culture conditions, the growth curve were drawn respectively. Population dependence and proliferation capability of the cells were investigated through plate cloning test and soft agar culture. The collagen secreted by cells was identified by immunohistochemical method. Results In routine culture condition, the growth properties of the human embryonic tendon cell and transformed cells were almost identical. The growth properties of the transformed cells were not changed when the cells were frozen storage. There were changes of growth characteristics of the transformed cells when the culture temperature was changed. The transformed cells could subcultured continually and permanently. The proliferation capability of the transformed cells were stronger than that of the human embryonic tendon cells. Moreover, the growth of the transformed cells was serum-dependent, and the phenomenon of contact inhibition was observed. The transformed cells were not able to grow on soft agar culture. They had the capacity of secreting collagen type Ⅰ. Conclusion The transformed human embryonic tendon cells could be subcultured continually and permanently, and their growth could be controlled by changing their culture conditions and they hadno malignant tendency in biological characteristics. They could be taken as an ideal experimental material for tendon engineering.
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【Key words】 Human embryonic tendon cell Transformed cell Culture in vitro Biological characteristics
Foundation item: Natural Sciences Foundation of China (39870202), China Medical Board of New York (CMB)
人胚肌腱细胞在体外培养传代到第13代后，细胞的增殖能力就变得十分低下，不能适应组织工程的需要[1，2]。Gerhard等[3]研究了SV40大T抗原的结构区。我们用电穿孔法将SV40温度依赖株质粒pts A58H导入肌腱细胞，并经潮霉素B筛选，获得了阳性克隆，扩增后建立转化人胚肌腱细胞系，细胞可长期连续传代。我们的实验旨在了解该转化人胚肌腱细胞的生物学特性，探讨细胞生长特性与体外培养条件的关系，为构建组织工程人工化肌腱建立标准细胞提供细胞学理论基础。
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1 材料与方法
1.1 材料来源
肌腱取自自然流产的5月龄胎儿屈指肌腱，F12培养基及新生小牛血清(FCS)，系Gibco公司产品，经灭活过滤除菌及去支原体处理。免疫组织化学试剂(Ⅰ型、Ⅲ型胶原抗体等)，由北京中山生物技术有限公司提供。
1.2 人胚肌腱细胞培养
人胚肌腱细胞的分离培养，按Handerson分步酶消化法进行[4]。肌腱细胞的生物学形为及鉴定已于1995年报道过[5]，不再赘述。
1.3 转化人胚肌腱细胞的传代，冻存与复苏
用由Jefferson Cancer Institute, Thomas Jefferson University赠送的pts A58H质粒导入建立的转化人胚肌腱细胞，可进行连续传代。传代培养时，一般2天换培养液一次，半量换液。细胞融合成单层细胞后及时进行传代培养。
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冻存时，首先消化悬浮细胞，1 200 r/min离心6分钟，弃上清液，加入1.5 ml冻存保护液(F12培养基加入20% FCS，10%二甲基亚砜液)。置冻存管中，封口。经-85℃冰箱过夜后转至-152℃深低温冰箱。
复苏时，取出冻存管，迅速置入37℃水浴中溶解，吸细胞悬液至离心管中，加入含10% FCS的F12培养基，洗涤、离心二次，接种入培养瓶中。第2天换培养液一次。
按“慢冻快融”[6]法，隔代细胞进行冻存。取第54代连续传代的转化人胚肌腱细胞(transformed human embryonic tendon cell 54, THETC 54)，并复苏第38代转化人胚肌腱细胞(THETC 38)及第3代人胚肌腱细胞(Human embryonic tendon cell 3, HETC 3)进行实验。
1.4 生长曲线绘制
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取上述各代次细胞，0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液，血细胞计数板计数后定量接种于12孔培养板上培养，每3孔为一实验组，每24小时检测一组，每组计数六次，取平均值绘制曲线，即为生长曲线。在下列条件下绘制生长曲线：①37℃，F12+10% FCS。②39.5℃,F12+10% FCS； 39.5℃，F12+10% FCS培养1天→37℃，F12+10% FCS培养7天；37℃，F12+10% FCS。③35℃，F12+10% FCS；37℃，F12+10% FCS。④37℃，F12+10% FCS；37℃，F12+5% FCS；37℃，F12+2% FCS；37℃,F12+1% FCS。
1.5 克隆形成率测定
取上述各代次细胞及舌癌Tca 8 113细胞(取自华西医科大学分子生物学教研室)，消化制成细胞悬液，稀释，定量接种于6孔板(50个/孔)。台盼蓝染色计算活细胞率，置F12+10% FCS培养10天。甲醇固定，Giemsa染色，37℃，20分钟。于倒置显微镜下计算形成克隆数(以10个以上细胞团为一个克隆)，取平均值，计算克隆形成率，公式如下：
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克隆形成率=(形成克隆数)/(接种细胞数×活细胞率)×100%
1.6 软琼脂培养
取THETC 54，舌癌Tca 8 113细胞作软琼脂培养。称量琼脂糖，分别用三蒸水配制1.2%，0.7%的溶液。混匀，高压灭菌后，置于50℃水浴中。配制2×F12(2×抗生素，20% FCS)。1∶1混合1.2%琼脂糖和2×F12，定量加入6孔板中，室温下待其凝固。消化悬浮细胞，计数。取0.5 ml细胞悬液，加入2×F12+0.7%琼脂糖中(1∶1)。定量加入6孔板中。制成双层软琼脂培养基。置37℃，5% CO2孵箱中培养10天，观察形成克隆数。
1.7 形态及超微结构观察
取THETC 54，消化，悬浮离心收集细胞，3%戊二醛固定24小时，1%四氧化锇固定2小时后，逐级脱水，环氧树脂618包埋，切片、染色，于日本电子公司JEM-100 SX透射电镜下观察并照像。
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1.8 免疫组织化学法测定胶原类型
在6孔板中置入2 cm×2 cm载玻片，分别接种THETC 54、THETC 38和HETC 3三种细胞进行实验。37℃，5% CO2条件下培养细胞7天，在载玻片上细胞贴壁生长至单层细胞后，免疫组织化学法进行Ⅰ型、Ⅲ型胶原染色。每例均以省略一抗作空白对照。
2 结果
2.1 转化人胚肌腱细胞的生长特性
2.1.1 一般特征 人胚肌腱细胞原代培养时，刚游离出的肌腱细胞呈圆形，有折光性，36小时后大部分细胞贴壁，48小时后贴壁细胞延展为梭形，7～9天形成单层细胞。传代细胞一般6小时贴壁，18小时延展为梭形，5～7天可形成单层细胞。转化人胚肌腱细胞悬浮时呈圆形，有折光性，2～3小时后大部分细胞贴壁，10小时后贴壁细胞延展为梭形，4～5天形成单层细胞(图1)。体外培养人胚肌腱细胞的最佳条件为：温度37℃、饱和湿度，5% CO2浓度，培养液pH值为7.2。
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图1 转化人胚肌腱细胞贴壁生长，为梭形( ×40)
Fig 1 The spindle transformed human embryonic tendon cells grow closly to the wall ( ×40)
2.1.2 生长曲线 ①HETC 3、THETC 54及THETC 38三种细胞，在37℃，F12+10% FCS的生长曲线如图2所示，细胞倍增时间为20～36小时，4～6天生长达高峰，以后生长缓慢。三条曲线基本吻合，说明转化人胚肌腱细胞在连续传代及复苏后生长性状与人胚肌腱细胞相比无差异。②THETC 54，在39.5℃连续培养8天；在39.5℃培养1天转至37℃继续培养7天；在37℃连续培养8天，三条生长曲线如图3所示。由图可见连续39.5℃培养8天，细胞起初仍能保持增殖，但随时间延长，生长速度骤减，以后渐趋平稳。而39.5℃培养1天转至37℃继续培养，可见转入37℃后细胞能恢复生长。因pts A58H质粒为温度敏感性质粒，用该质粒转化哺乳动物细胞后，转化细胞呈现温度依赖性生长。该质粒在39.5℃失活，可见体外培养控制温度可以改变转化细胞的生长特性。③THETC 54，在35℃，F12+10% FCS时生长曲线如图4。由图可见细胞生长延缓，潜伏期明显延长。细胞倍增时间为5天，细胞生长增殖较在37℃时明显受到抑制，但仍能维持生长。④THECT 54，在不同血清浓度下生长曲线如图5所示。由图可见细胞在10% FCS中正常生长，细胞倍增时间约24小时，4～6天生长达高峰，以后生长缓慢。在5%、2%及1% FCS中培养时，细胞生长潜伏期明显延长，细胞增殖减缓，仅能维持生长，说明转化细胞生长仍存在血清营养依赖性。
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图2 各代次细胞在正常条件下的生长曲线图 图3 THETC 54在不同温度下的生长曲线图
Fig 2 The growth curves of different cells in normal condition Fig 3 The growth curves of THETC 54 in different temperature
图4 THETC 54在35℃的生长曲线图 图5 THETC 54在不同血清浓度下的生长曲线图
Fig 4 The growth curves of THETC 54 under 35℃ Fig 5 The growth curves of THETC 54 in different serum concentration
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2.1.3 克隆形成率测定 HETC 3克隆形成率为25%；THETC 54为37.3%；THETC 38为39.1%；舌癌Tca 8 113细胞为83%。
2.1.4 软琼脂培养 THETC 54在软琼脂中不能生长形成克隆，而对照组舌癌Tca 8 113细胞在软琼脂中可以形成克隆。
2.2 转化人胚肌腱细胞形态及超微结构
转化人胚肌腱细胞贴壁生长后形态呈梭形，细胞两极突起较长，在形成单层细胞后，细胞间隙变小，胞内可见小颗粒。细胞排列规则，有接触抑制现象。Giemsa染色显示：胞核为紫红色，圆形或椭圆形，居胞质中央，核仁多为一个，胞浆为淡紫色，胞质内有深染小颗粒(图6)。各代次细胞形态无明显差异。透射电镜见胞核为不规则形，核膜有凹陷， 核仁明显， 细胞表面有少许伪足，胞质内有胞饮小泡，粗面内质网丰富，中等数量线粒体及核蛋白体，少量溶酶体，说明细胞合成胶原活动旺盛(图7)。
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图6 转化人胚肌腱细胞(Giemsa染色 ×100)
Fig 6 Transformed human embryonic tendon cells (Giemsa ×100)
图7 转化人胚肌腱细胞透射电镜观察，粗面内质网丰富，中等数量线粒体及核蛋白体(EM ×100)
Fig 7 Electronmicrograph of transformed human embryonic tendon cells, abundant coarse endoplasmic reticulum, moderate mitochondrion and ribosome (EM ×100)
2.3 免疫组织化学法测定胶原类型
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经Ⅰ型、Ⅲ型胶原抗体染色后，人胚肌腱细胞与转化人胚肌腱细胞Ⅰ型胶原染色细胞内均可见棕黄色点状分布的颗粒(阳性)，胞核蓝色，而Ⅲ型胶原染色为阴性。
3 讨论
我们采用显微外科技术，移除了人胚肌腱外膜组织。再用短时整段肌腱的酶消化后，移去残存的外膜细胞，最后用胰蛋白酶及胶原酶混合液消化肌腱碎块，游离出肌腱细胞，获取比较纯净的肌腱细胞。用国外最新构建的带有潮霉素B筛选标记的SV40温度依赖株质粒pts A58H，采用电穿孔法将其导入肌腱细胞，并经潮霉素B筛选，获得了阳性克隆，扩增后建立转化人胚肌腱细胞系，选用F12培养液成功地传代培养了65代转化人胚肌腱细胞，经冻存复苏后，观察到冻存对转化细胞的生长、形态与合成胶原的能力无明显影响。转化细胞在温度37℃，饱和湿度，5% CO2浓度，培养液pH值为7.2时，细胞生长最为旺盛。传代培养时，一般2天换培养液一次，换液时须保留原液的一半，以免细胞外环境改变太大，不利于细胞生长。细胞融合成单层后应及时传代，以免因接触抑制、代谢产物积聚而引起死亡。在冻存和复苏时按“慢冻快融”的原则进行，使冻存的细胞温度逐次降低而冻结，复苏时快速解冻，迅速通过最易使细胞受损的温度(-5℃～0℃)。
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转化细胞的致瘤性是必须研究的问题，细胞的生物学特性是常用的方法之一，包括形态观察，超微结构观察，细胞生长曲线，克隆形成率测定等。
细胞生长曲线是一定数量的细胞在一定空间的培养皿中贴壁生长的细胞数与时间的关系曲线，一般可分为潜伏期，指数增生期和平顶期。细胞数量增加一倍的时间称细胞倍增时间，可从细胞生长曲线中测知。细胞生长曲线是反映细胞增殖生长力的重要指标。我们的研究结果表明，在正常培养条件下，转化人胚肌腱细胞与人胚肌腱细胞的生长性状几乎无差异，且冻存复苏并不改变其生长特性。通过39.5℃和35℃条件培养，见控制温度可改变转化人胚肌腱细胞的生长特性，且其生长存在血清营养依赖性。
细胞的转化可分为一般转化和恶性转化二种。一般转化细胞伸展良好，呈单层生长，有方向性，有接触抑制现象，具永生性，对血清要求较高，在软琼脂培养中不能生长等。而恶性转化细胞则具有伸展性差，核质比例增大，接触抑制消失，可呈重叠生长，对血清要求较低，在软琼脂培养中可以生长等特点。本实验结果证实，我们建立的转化人胚肌腱细胞增殖能力强于人胚肌腱细胞，但无肿瘤细胞的特征性改变。透射电镜观察细胞超微结构亦证明转化的人胚肌腱细胞并无恶性倾向，且仍有正常分泌Ⅰ型胶原的能力，这对于以后组织工程化肌腱的构建具有十分重要意义。
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4 小结
通过对人胚肌腱细胞与pts A58H质粒转化的人胚肌腱细胞的形态、功能及生长特性等方面的测试，我们认为这二种细胞在正常培养条件下生长性状无差异。通过条件培养，可以控制转化人胚肌腱细胞的生长，其增殖能力强，可长期连续传代，且具有正常分泌Ⅰ型胶原的功能。从细胞生物学特点来看，该转化人胚肌腱细胞无恶性肿瘤转化倾向。为组织工程化肌腱的研究提供了标准细胞。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870202)；美国纽约中华医学基金会(CMB)资助项目
5 参考文献
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