系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞凋亡及其临床意义
作者：谢敏 王曾礼 刘小菁 强欧 刘刚
单位：华西医科大学附属第一医院内科(成都610041)
关键词：系统性红斑狼疮；凋亡
华西医学WEST CHINA MEDICAL JOURNAL1999年 第14卷 第2期 Vol 摘要：目的：通过29例系统性红斑狼疮(SLE)外周血淋巴细胞的凋亡现象观察，探讨细胞凋亡及其相关基因与SLE病情的关系。方法：采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法及流式细胞仪(FCM)观察SLE外周血淋巴细胞凋亡现象。结果：①SLE患者外周血淋巴细胞凋亡率明显高于正常组及类风湿关节炎(RA)组(P<0.001)，经48小时培养后，凋亡率更高可达33.44%；②凋亡率与疾病活动程度呈正相关(r＝0.866)，P<0.001)。结论：凋亡率的变化可作为评估SLE病情的一种指标。
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[中图分类号]R593.24+1 [文献标识码]A
[文章编号]1002-0179(1999)02-0140-03
Prliminary Study on Apoptosis in Peripheral Blood Lymphocytes of Patients with Systemic Lupus Erythematosus
XIE Ming,WANG Zeng-li,LIU Xiao-jing,et al
First University Hospital,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041
Abstract:Objective:To observe the relationship between systemic lupus erythematosus(SLE)peripheral blood lymphocytes(PBL)apoptosis and its clinical significance.Methods:Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labelling(TUNEL)technique and flow cytometry(FCM)were used to detect the apoptotic cell in 29 cases of SLE.Results:The rate of apoptosis of PBL was significantly higher in SLE patients than those in normal control(P<0.001)and in rheumatoid arthritis(RA)(P<0.001)，After 48 hour culture the apoptotic rate was further increased in SLE patients(33.4%).There was a significant correlation between SLE activity and rate of apoptosis in vitro(r＝0.866，P<0.001).Conclusion:Increased rate of apoptosis may be an index of valuation of severity of SLE patients.
, 百拇医药
Key words:systemic lupus erythematosus,apoptosis
(Received:1998-09-06)
随着研究手段的完善与对细胞凋亡作用的认识，现已证明细胞凋亡在免疫系统的发育以及免疫反应的过程中起重要作用。系统性红斑狼疮(SLE)的主要免疫学特征是患者血液中含有大量的抗核(如核心蛋白，DNA等)抗体及抗其它自身抗原(如红细胞表面抗原等)的抗体，抗原抗体复合物在结缔组织中沉着而引起病理损害。至于其中的免疫调节过程，以及细胞因子信号传递途径等，至今尚未完全阐明。近年来研究逐渐表明，SLE患者及实验小鼠体内细胞凋亡紊乱，表明细胞凋亡过程可能参与SLE的发病。
细胞凋亡(apoptosis)，是Kerr等(1972年)首先提出的。是一种受遗传控制的单个细胞自灭过程，免疫系统中多种细胞因子、抗原及受体和细胞成份等均与细胞凋亡的诱导有关。本研究应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)以及流式细胞技术，检测29例SLE患者外周血淋巴细胞的凋亡，旨在探讨SLE患者的免疫异常与细胞凋亡及其调控之间的关系。
, 百拇医药
1 对象与方法
1.1 对象 SLE患者29例，均为女性，年龄16～48岁，平均32±9岁，类风湿关节炎(RA)11例，均为女性，年龄17～50岁，平均35±4岁，并选择年龄、性别与之匹配的健康对照组11例，亦均为女性，年龄18～35岁，平均28±4岁。所有病例均符合ARA 1982年修订的诊断标准。SLE全部非活动期病例在研究期间均仍服用强的松5～20mg/日，活动期病例，则在增加激素剂量或加用环磷酰胺之前取血，因此，活动期与非活动期在药物治疗上并无很大差别。RA组均为未经治疗病例。SLE活性指数(activity inder)则按Bombarier[1]方法判定(SLEDAI)。
1.2 外周血淋巴细胞分离、培养
无菌肝素抗凝血3ml，加入等量无菌生理盐水，混匀后轻覆于5ml淋巴细胞分离液上，2500rpm离心20分钟，收集淋巴细胞，用RPMI1640液洗2次后，一部分做细胞涂片，一部分加入细胞培养板(6孔)中培养。37℃，5%二氧化碳，48hr后，收集细胞，做细胞涂片或甩片(玻片预先用APES打底)。细胞分离均在采血后5hr内完成。苔盼蓝示细胞活力均大于96%(98%，99%亦有)。
, 百拇医药
1.3 末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法 采用BM公司末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labelling, TUNEL)，将上述细胞甩片，室温下风干。浸泡于4%多聚甲醛(以PBS pH7.4配制)中，室温下固定30min；PBS洗，0.3%H2O2阻断30min；PBS洗，0.1%Triton-X-100(用0.1%柠檬酸配制)打孔；用吸水纸将细胞周边水擦干，加20～40ul TUNEL反应混合液，置于湿盒中，37℃孵化60min。PBS洗两次后封片。荧光显微镜下观察结果，并计数。
1.4 流式细胞仪(FCM)-DNA检测 将分离及培养48hr后的淋巴细胞用D-Hank's 液离心，洗涤两遍，调整细胞浓度1×106个/ml，70%冷乙醇悬浮固定，4℃过夜。FCM测定：使用美国Coulter公司ELITE ESP型流式细胞仪，激光室工作波长488nm，每份样品检测10000个细胞，测量速率，60～90个细胞/秒。测定结果经Coulter公司Elite软件处理，低于Go/G1期DNA含量的细胞为凋亡细胞，其所占细胞总数的比例为凋亡率。
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1.5 统计学处理 用等级相关分析疾病活动性与凋亡的关系，两组间比较用t检验，以P<0.05具统计学意义。
2 结果
2.1 FCM与TUNEL检测凋亡的相关性 用该两种不同方法测定凋亡，具明显相关性(r=0.678,p<0.001)，见图1。
图1.FCM与TUNEL检测凋亡的相关性
2.2 外周血淋巴细胞(PBL)凋亡 将29例SLE、11例RA、11例正常者的PBL不加任何刺激培养48小时。结果显示：随培养时间延长，其凋亡率增高，见图2(FCM法)、图3(TUNEL法)。
, 百拇医药
图2.PBL不加任何刺激培养48hr。FCM检测凋亡细胞，由左到右，培养前、培养48hr，RA与正常组结果相似，未列出。
图3.示0、48hr凋亡细胞百分数，以
±s表示 培养前，SLE患者的淋巴细胞凋亡率明显高于正常组及RA组，分别为1.58±0.89%，0.8±0.39%，及0.82±0.52%(P均<0.001)，活动期患者细胞凋亡率尤较正常组为高(2.17±0.77%，P<0.001)。培养48hr后，活动期SLE患者凋亡细胞百分率可高达62%，较非活动期SLE患者明显增高(分别为33.44±10.47%，21.69±3.43%，P<0.001)，后者仍较正常组及RA组高(P均<0.001),见表1。
表1.培养前、后淋巴细胞凋亡率(±s)
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组别
例数
PBL凋亡百分数(%)
培养前
培养48hr
正常对照组
11
0.8±0.39
11±1.53
SLE组
29
1.58±0.89△
, 百拇医药
28.17±9.95△
活动期(SLEDAI>9)
16
2.17±0.77*
33.44±10.47*
非活动期(SLEDAI<5)
13
0.87±0.33
21.69±3.43
RA组
11
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0.82±0.37**
10.35±1.24**
*SLE活动期与非活动期比较 P<0.001
**RA与正常组比较 P>0.05
△SLE与正常组及RA组比较 P均<0.001
2.3 疾病活动性与淋巴细胞凋亡的关系 SLE活性用SLEDAI评价，结果显示疾病活动性与体外淋巴细胞凋亡率呈正相关，且具统计学意义(r=0.8663,P<0.001)，见图4。
图4.疾病活动性与淋巴细胞凋亡的关系
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4 讨论
我们用两种检测方法评价外周血淋巴细胞(PBL)的凋亡现象，结果表明两者明显相关，TUNEL技术结果，发现正常淋巴细胞置于组织培养中可发生凋亡，与Bell等[2]报道一致，且发现SLE患者外周血淋巴细胞在组织培养中,其凋亡率明显高于正常组(分别为1.58±0.89%, 0.8±0.39%,P<0.001)，随培养时间的延长， 差异更明显。Emlen[3]等报道：凋亡与激素、细胞毒药物或细胞分离过程无关，本文资料亦发现SLE活动期较非活动期凋亡率增加，而活动期与非活动期患者在药物治疗方面并无差别，因此，活动期患者凋亡增加, 推测与激素或细胞毒药物无关，而与SLE患者淋巴细胞本身异常有关。
SLE患者PBL体外凋亡增加是否具特异性或仅与慢性炎症有关？为此我们同时检测RA患者淋巴细胞凋亡，结果显示: RA组与正常组相比，两组淋巴细胞凋亡率无明显差异(P>0.05)，提示SLE 患者淋巴细胞凋亡的变化至少部分具有特异性。
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本组资料表明:凋亡率与疾病活动性明显相关(r=0.866,P<0.001)凋亡越明显，疾病越活跃。淋巴细胞凋亡率增高与SLE等自身免疫性疾病的发病有何关系？细胞凋亡特点是染色质浓集、核碎裂，形成凋亡小体，此类小体常含有数目不定的核小体、细胞器及核物质，在生理条件下，凋亡小体迅速被吞噬细胞吞噬或自然脱落离开生物体，由于此种死亡过程并不导致溶酶体及细胞膜破裂，故无细胞内容物外泄，不能激活免疫活性细胞[4]，但当凋亡率增加，吞噬细胞不能迅速吞噬凋亡小体时，凋亡小体膜破裂，细胞内显现出凋亡DNA片段，并作为非自身抗原被免疫活性细胞识别，导致形成抗胞内成分，如dsDNA的自身抗体，此类抗体即可促发SLE或加速其进展。Casciola-Rosen等[5]亦证实：由紫外线诱导角化细胞形成的凋亡气泡中含有胞核及胞浆抗原。Emlen等认为：凋亡时，核小体可进入细胞外基质，核小体刺激淋巴细胞，增加DNA及免疫球蛋白合成。因此，凋亡越多，提供核抗原越多，更进一步增加疾病的活动性。
综上所述，SLE患者PBL凋亡率增加说明体内凋亡或凋亡相关性免疫机制失调，在SLE发病机制中起一定作用，凋亡率的变化有可能作为评估SLE病情的一种指标。
, 百拇医药
5 参考文献
1 Bombardier C, Gladman DD, Urowitz MB, et al. Derivation of the SLEDAI. A disease activity index for lupus patients. Arthri Rheuma, 1992;35:630～40.
2 Bell DA, Morrison B, VandenBygaart P. Immunogenic DNA- related factors. Nucleosomes spontaneously released from normal murine lymphoid cells stimulate proliferation and immunoglobulin synthesis of normal mouse lymphocytes, J Clin Invest, 1990; 85:1487～1496.
, 百拇医药
3 Emlen W, Niebur J, Kadera R. Accelerated in vitro apoptosis of lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus. J Immunol,1994;152:3685～3692.
4 Mountz JD, Wu J, Cheng J, et al. Autoimmune disease a problem of defective apoptosis. Arthri Rheuma, 1994;37:1415～1420.
5 Casciola-Rosen CA, Anhalt G, Rosen A. Autoantigens targeted in spstemic lupus erythematosus are clustered in two populations of surface structure on apoptotic keratinocytes. J Exp Med, 1994;179:1317～1330.
(收稿日期：1998-09-06), 百拇医药
单位：华西医科大学附属第一医院内科(成都610041)
关键词：系统性红斑狼疮；凋亡
华西医学WEST CHINA MEDICAL JOURNAL1999年 第14卷 第2期 Vol 摘要：目的：通过29例系统性红斑狼疮(SLE)外周血淋巴细胞的凋亡现象观察，探讨细胞凋亡及其相关基因与SLE病情的关系。方法：采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法及流式细胞仪(FCM)观察SLE外周血淋巴细胞凋亡现象。结果：①SLE患者外周血淋巴细胞凋亡率明显高于正常组及类风湿关节炎(RA)组(P<0.001)，经48小时培养后，凋亡率更高可达33.44%；②凋亡率与疾病活动程度呈正相关(r＝0.866)，P<0.001)。结论：凋亡率的变化可作为评估SLE病情的一种指标。
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[中图分类号]R593.24+1 [文献标识码]A
[文章编号]1002-0179(1999)02-0140-03
Prliminary Study on Apoptosis in Peripheral Blood Lymphocytes of Patients with Systemic Lupus Erythematosus
XIE Ming,WANG Zeng-li,LIU Xiao-jing,et al
First University Hospital,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041
Abstract:Objective:To observe the relationship between systemic lupus erythematosus(SLE)peripheral blood lymphocytes(PBL)apoptosis and its clinical significance.Methods:Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labelling(TUNEL)technique and flow cytometry(FCM)were used to detect the apoptotic cell in 29 cases of SLE.Results:The rate of apoptosis of PBL was significantly higher in SLE patients than those in normal control(P<0.001)and in rheumatoid arthritis(RA)(P<0.001)，After 48 hour culture the apoptotic rate was further increased in SLE patients(33.4%).There was a significant correlation between SLE activity and rate of apoptosis in vitro(r＝0.866，P<0.001).Conclusion:Increased rate of apoptosis may be an index of valuation of severity of SLE patients.
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Key words:systemic lupus erythematosus,apoptosis
(Received:1998-09-06)
随着研究手段的完善与对细胞凋亡作用的认识，现已证明细胞凋亡在免疫系统的发育以及免疫反应的过程中起重要作用。系统性红斑狼疮(SLE)的主要免疫学特征是患者血液中含有大量的抗核(如核心蛋白，DNA等)抗体及抗其它自身抗原(如红细胞表面抗原等)的抗体，抗原抗体复合物在结缔组织中沉着而引起病理损害。至于其中的免疫调节过程，以及细胞因子信号传递途径等，至今尚未完全阐明。近年来研究逐渐表明，SLE患者及实验小鼠体内细胞凋亡紊乱，表明细胞凋亡过程可能参与SLE的发病。
细胞凋亡(apoptosis)，是Kerr等(1972年)首先提出的。是一种受遗传控制的单个细胞自灭过程，免疫系统中多种细胞因子、抗原及受体和细胞成份等均与细胞凋亡的诱导有关。本研究应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)以及流式细胞技术，检测29例SLE患者外周血淋巴细胞的凋亡，旨在探讨SLE患者的免疫异常与细胞凋亡及其调控之间的关系。
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1 对象与方法
1.1 对象 SLE患者29例，均为女性，年龄16～48岁，平均32±9岁，类风湿关节炎(RA)11例，均为女性，年龄17～50岁，平均35±4岁，并选择年龄、性别与之匹配的健康对照组11例，亦均为女性，年龄18～35岁，平均28±4岁。所有病例均符合ARA 1982年修订的诊断标准。SLE全部非活动期病例在研究期间均仍服用强的松5～20mg/日，活动期病例，则在增加激素剂量或加用环磷酰胺之前取血，因此，活动期与非活动期在药物治疗上并无很大差别。RA组均为未经治疗病例。SLE活性指数(activity inder)则按Bombarier[1]方法判定(SLEDAI)。
1.2 外周血淋巴细胞分离、培养
无菌肝素抗凝血3ml，加入等量无菌生理盐水，混匀后轻覆于5ml淋巴细胞分离液上，2500rpm离心20分钟，收集淋巴细胞，用RPMI1640液洗2次后，一部分做细胞涂片，一部分加入细胞培养板(6孔)中培养。37℃，5%二氧化碳，48hr后，收集细胞，做细胞涂片或甩片(玻片预先用APES打底)。细胞分离均在采血后5hr内完成。苔盼蓝示细胞活力均大于96%(98%，99%亦有)。
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1.3 末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法 采用BM公司末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labelling, TUNEL)，将上述细胞甩片，室温下风干。浸泡于4%多聚甲醛(以PBS pH7.4配制)中，室温下固定30min；PBS洗，0.3%H2O2阻断30min；PBS洗，0.1%Triton-X-100(用0.1%柠檬酸配制)打孔；用吸水纸将细胞周边水擦干，加20～40ul TUNEL反应混合液，置于湿盒中，37℃孵化60min。PBS洗两次后封片。荧光显微镜下观察结果，并计数。
1.4 流式细胞仪(FCM)-DNA检测 将分离及培养48hr后的淋巴细胞用D-Hank's 液离心，洗涤两遍，调整细胞浓度1×106个/ml，70%冷乙醇悬浮固定，4℃过夜。FCM测定：使用美国Coulter公司ELITE ESP型流式细胞仪，激光室工作波长488nm，每份样品检测10000个细胞，测量速率，60～90个细胞/秒。测定结果经Coulter公司Elite软件处理，低于Go/G1期DNA含量的细胞为凋亡细胞，其所占细胞总数的比例为凋亡率。
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1.5 统计学处理 用等级相关分析疾病活动性与凋亡的关系，两组间比较用t检验，以P<0.05具统计学意义。
2 结果
2.1 FCM与TUNEL检测凋亡的相关性 用该两种不同方法测定凋亡，具明显相关性(r=0.678,p<0.001)，见图1。
图1.FCM与TUNEL检测凋亡的相关性
2.2 外周血淋巴细胞(PBL)凋亡 将29例SLE、11例RA、11例正常者的PBL不加任何刺激培养48小时。结果显示：随培养时间延长，其凋亡率增高，见图2(FCM法)、图3(TUNEL法)。
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图2.PBL不加任何刺激培养48hr。FCM检测凋亡细胞，由左到右，培养前、培养48hr，RA与正常组结果相似，未列出。
图3.示0、48hr凋亡细胞百分数，以
±s表示 培养前，SLE患者的淋巴细胞凋亡率明显高于正常组及RA组，分别为1.58±0.89%，0.8±0.39%，及0.82±0.52%(P均<0.001)，活动期患者细胞凋亡率尤较正常组为高(2.17±0.77%，P<0.001)。培养48hr后，活动期SLE患者凋亡细胞百分率可高达62%，较非活动期SLE患者明显增高(分别为33.44±10.47%，21.69±3.43%，P<0.001)，后者仍较正常组及RA组高(P均<0.001),见表1。表1.培养前、后淋巴细胞凋亡率(
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组别
例数
PBL凋亡百分数(%)
培养前
培养48hr
正常对照组
11
0.8±0.39
11±1.53
SLE组
29
1.58±0.89△
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28.17±9.95△
活动期(SLEDAI>9)
16
2.17±0.77*
33.44±10.47*
非活动期(SLEDAI<5)
13
0.87±0.33
21.69±3.43
RA组
11
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0.82±0.37**
10.35±1.24**
*SLE活动期与非活动期比较 P<0.001
**RA与正常组比较 P>0.05
△SLE与正常组及RA组比较 P均<0.001
2.3 疾病活动性与淋巴细胞凋亡的关系 SLE活性用SLEDAI评价，结果显示疾病活动性与体外淋巴细胞凋亡率呈正相关，且具统计学意义(r=0.8663,P<0.001)，见图4。
图4.疾病活动性与淋巴细胞凋亡的关系
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4 讨论
我们用两种检测方法评价外周血淋巴细胞(PBL)的凋亡现象，结果表明两者明显相关，TUNEL技术结果，发现正常淋巴细胞置于组织培养中可发生凋亡，与Bell等[2]报道一致，且发现SLE患者外周血淋巴细胞在组织培养中,其凋亡率明显高于正常组(分别为1.58±0.89%, 0.8±0.39%,P<0.001)，随培养时间的延长， 差异更明显。Emlen[3]等报道：凋亡与激素、细胞毒药物或细胞分离过程无关，本文资料亦发现SLE活动期较非活动期凋亡率增加，而活动期与非活动期患者在药物治疗方面并无差别，因此，活动期患者凋亡增加, 推测与激素或细胞毒药物无关，而与SLE患者淋巴细胞本身异常有关。
SLE患者PBL体外凋亡增加是否具特异性或仅与慢性炎症有关？为此我们同时检测RA患者淋巴细胞凋亡，结果显示: RA组与正常组相比，两组淋巴细胞凋亡率无明显差异(P>0.05)，提示SLE 患者淋巴细胞凋亡的变化至少部分具有特异性。
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本组资料表明:凋亡率与疾病活动性明显相关(r=0.866,P<0.001)凋亡越明显，疾病越活跃。淋巴细胞凋亡率增高与SLE等自身免疫性疾病的发病有何关系？细胞凋亡特点是染色质浓集、核碎裂，形成凋亡小体，此类小体常含有数目不定的核小体、细胞器及核物质，在生理条件下，凋亡小体迅速被吞噬细胞吞噬或自然脱落离开生物体，由于此种死亡过程并不导致溶酶体及细胞膜破裂，故无细胞内容物外泄，不能激活免疫活性细胞[4]，但当凋亡率增加，吞噬细胞不能迅速吞噬凋亡小体时，凋亡小体膜破裂，细胞内显现出凋亡DNA片段，并作为非自身抗原被免疫活性细胞识别，导致形成抗胞内成分，如dsDNA的自身抗体，此类抗体即可促发SLE或加速其进展。Casciola-Rosen等[5]亦证实：由紫外线诱导角化细胞形成的凋亡气泡中含有胞核及胞浆抗原。Emlen等认为：凋亡时，核小体可进入细胞外基质，核小体刺激淋巴细胞，增加DNA及免疫球蛋白合成。因此，凋亡越多，提供核抗原越多，更进一步增加疾病的活动性。
综上所述，SLE患者PBL凋亡率增加说明体内凋亡或凋亡相关性免疫机制失调，在SLE发病机制中起一定作用，凋亡率的变化有可能作为评估SLE病情的一种指标。
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5 参考文献
1 Bombardier C, Gladman DD, Urowitz MB, et al. Derivation of the SLEDAI. A disease activity index for lupus patients. Arthri Rheuma, 1992;35:630～40.
2 Bell DA, Morrison B, VandenBygaart P. Immunogenic DNA- related factors. Nucleosomes spontaneously released from normal murine lymphoid cells stimulate proliferation and immunoglobulin synthesis of normal mouse lymphocytes, J Clin Invest, 1990; 85:1487～1496.
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3 Emlen W, Niebur J, Kadera R. Accelerated in vitro apoptosis of lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus. J Immunol,1994;152:3685～3692.
4 Mountz JD, Wu J, Cheng J, et al. Autoimmune disease a problem of defective apoptosis. Arthri Rheuma, 1994;37:1415～1420.
5 Casciola-Rosen CA, Anhalt G, Rosen A. Autoantigens targeted in spstemic lupus erythematosus are clustered in two populations of surface structure on apoptotic keratinocytes. J Exp Med, 1994;179:1317～1330.
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