引物介导的原位标记技术在分析染色体13、16、18、X和Y中的应用
作者：李峰 方伟岗 王家锦 由江峰 宋桂宁 钟镐镐 吴秉铨
单位：100083 北京医科大学病理学系(李峰、方伟岗、由江峰、钟镐镐、吴秉铨)；北京医科大学人民医院医学遗传科(王家锦、宋桂宁)
关键词：
中华医学杂志990225 引物介导的原位标记技术(primed in situ labeling , PRINS)是由Koch等[1]1989年建立的一项新的分子生物学技术，它的出现为快速分析染色体数目畸变提供了一个新途径。我们利用PRINS分别对13、16、18、X和Y染色体的引物在中期染色体和间期细胞核上进行了分析。
一、对象与方法
1.对象：33例成年人各取其外周血2 ml，其中0.5 ml按常规培养制备染色体，余1.5 ml用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，经0.075 mol/L KCl低渗37 ℃，20分钟，用甲醇：冰醋酸为3∶1的溶液固定，制备间期细胞核。对11例疑有异常妊娠的孕妇经腹取羊水30 ml，其中27 ml按常规培养制备染色体，3 ml离心收集细胞，原位低渗固定制备间期细胞核。
, http://www.100md.com
2.PRINS反应：引物由本室合成(表1)。PRINS反应：中期染色体和间期细胞核同时进行PRINS反应[2]。33例血标本中分别有10、5、5、7和6例进行13、16、18、X和Y染色体分析；11例羊水标本中分别有4、2、2和3例进行13、16、18和Y染色体分析。
表1 寡核苷酸引物序列和使用条件 靶染色体
引物序列[3]
退火温度(℃)
引物浓度(pmol/L)
13
5′TGATGTGTGTACCCAGCT3′
60.5
, 百拇医药
200
16
5′TTCTTTTCATACCGCATTCT3′
53.5
200
18
5′AGTTGTGTCTCAACTAAAG3′
65.5
200
X
5′GTTCAGCTCTGTGAGTGAAA3′
68.5
, http://www.100md.com
100
Y
5′CTTGGAGACCTTTGTGGAAG3′
56.5
250
3.G显带核型分析：33例血标本和11例羊水标本均按常规进行G带染色分析核型。
二、结果
1.血淋巴细胞染色体分析结果：PRINS检测13、16及18号染色体，间期细胞核上显示2个荧光信号；检测X染色体，女性标本间期核显示 2个荧光信号，男性标本间期核显示1个荧光信号；检测Y染色体，男性标本间期核显示1个荧光信号，女性标本间期核显示荧光信号的细胞核数小于1%。在中期染色体片上，所有靶染色体均为着丝粒被特异标记。33例标本的PRINS结果均与核型分析结果一致，见表2。 表2 应用PRINS对外周血淋巴细胞染色体的分析结果 染色体
, 百拇医药
例数
未培养间期细胞核
中期染色体
核型
13
10
95.2%的细胞
显示2个信号
13号染色体着丝粒
被特异标记
46，-*
16
5
, http://www.100md.com
87.7%的细胞
显示2个信号
16号染色体着丝粒
被特异标记
46，-*
18
5
89.5%的细胞
显示2个信号
18号染色体着丝粒
被特异标记
46，-*
, http://www.100md.com X
4(f)
94.4%的细胞
显示2个信号
X染色体着丝粒
被特异标记
46,XX
3(m)
86.6%的细胞
显示1个信号
X染色体着丝粒
被特异标记
46,XY
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Y
3(m)
90.2%的细胞
显示1个信号
Y染色体着丝粒
被特异标记
46,XY
3(f)
<1%的细胞
显示荧光信号
无染色体
被特异标记
46,XX
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注：f:女性；m:男性；-* 为XX或XY(表3同)
2.羊水细胞染色体分析结果：如表3示，用PRINS方法检测13、16及18号染色体，羊水细胞间期核均显示2个荧光信号，经羊水核型分析证实胎儿确为正常二倍体；检测X染色体，1例羊水细胞间期核显示2个荧光信号，核型分析证实胎儿为女性；2例羊水细胞间期核显示1个荧光信号，核型分析证实胎儿为男性。
表3 应用PRINS对羊水细胞染色体的分析结果 靶染色体
例数
未培养间期细胞核
核型
13
4
, 百拇医药
90.2%的细胞显示2个荧光信号
46，-*
16
2
86.8%的细胞显示2个荧光信号
46，-*
18
2
95.1%的细胞显示2个荧光信号
46，-*
X
1
, http://www.100md.com 76.8%的细胞显示2个荧光信号
46,XX
X
2
76.7%的细胞显示1个荧光信号
46,XY
三、讨论
我们在未培养的淋巴细胞和羊水细胞间期核上进行13、16、18、X和Y染色体的PRINS，均获得了正确的染色体计数。如在常染色体13、16及18的分析中，间期细胞核86.8%以上均显示2个荧光信号，虽然有个别非特异标记，但不存在对染色体数目进行判断分析的困难；在同时进行的中期染色体PRINS，分别可见一对同源靶染色体的着丝粒被特异标记，说明间期核和中期染色体的PRINS结果完全符合，进一步做核型分析也证实这些标本(包括成年人和胎儿)均为二倍体。在性染色体的研究中，PRINS检测X染色体，女性血标本的间期核均显示2个荧光信号，男性血标本间期核均显示1个荧光信号；同时进行的中期染色体PRINS，在女性标本2条带黄绿色荧光标记的X染色体清晰可见，而男性标本仅见1条着丝粒被特异标记的X染色体；PRINS检测Y染色体，女性间期淋巴细胞核不显示荧光信号，男性间期淋巴细胞核均显示一个荧光信号，中期染色体片Y染色体着丝粒被特异标记，经核型分析上述结果完全正确。对羊水细胞检测X染色体，其中1例羊水细胞间期核显示2个荧光信号，羊水核型分析证实胎儿为女性46,XX；2例羊水细胞间期核均显示1个荧光信号，羊水核型分析证实胎儿为男性46,XY。本结果说明用针对13、16、18、X和Y染色体的引物，PRINS可以不经培养制备中期染色体，直接在淋巴细胞间期核或羊水细胞间期核上对这5条染色体进行计数分析。只要根据不同染色体正确设计特异的引物，严格掌握引物退火温度，其他所有的染色体亦可用此法进行染色体数目分析。
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本课题为国家“九五”科技攻关资助项目(96-904-06-09)
参考文献
1 Koch J, Kovraa S, Petersen K, et al. Oligonucleotide-priming methods for the chromosome-specific labelling of alpha satellite DNA in situ. Chromosoma，1989, 98: 259-265.
2 李峰，钟镐镐，由江峰.引物介导的原位标记技术在染色体计数分析中的应用.中华病理学杂志，1998， 27：233-234.
3 Pellestor F, Girardet A, Lefort G, et al. Use of the primed in situ labelling (PRINS)technique for a rapid detection of chromosome 13, 16, 18, 21, X and Y. Hum Genet， 1995, 95:12-17.
(收稿：1998-03-24 修回：1998-09-01), 百拇医药
单位：100083 北京医科大学病理学系(李峰、方伟岗、由江峰、钟镐镐、吴秉铨)；北京医科大学人民医院医学遗传科(王家锦、宋桂宁)
关键词：
中华医学杂志990225 引物介导的原位标记技术(primed in situ labeling , PRINS)是由Koch等[1]1989年建立的一项新的分子生物学技术，它的出现为快速分析染色体数目畸变提供了一个新途径。我们利用PRINS分别对13、16、18、X和Y染色体的引物在中期染色体和间期细胞核上进行了分析。
一、对象与方法
1.对象：33例成年人各取其外周血2 ml，其中0.5 ml按常规培养制备染色体，余1.5 ml用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，经0.075 mol/L KCl低渗37 ℃，20分钟，用甲醇：冰醋酸为3∶1的溶液固定，制备间期细胞核。对11例疑有异常妊娠的孕妇经腹取羊水30 ml，其中27 ml按常规培养制备染色体，3 ml离心收集细胞，原位低渗固定制备间期细胞核。
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2.PRINS反应：引物由本室合成(表1)。PRINS反应：中期染色体和间期细胞核同时进行PRINS反应[2]。33例血标本中分别有10、5、5、7和6例进行13、16、18、X和Y染色体分析；11例羊水标本中分别有4、2、2和3例进行13、16、18和Y染色体分析。
表1 寡核苷酸引物序列和使用条件 靶染色体
引物序列[3]
退火温度(℃)
引物浓度(pmol/L)
13
5′TGATGTGTGTACCCAGCT3′
60.5
, 百拇医药
200
16
5′TTCTTTTCATACCGCATTCT3′
53.5
200
18
5′AGTTGTGTCTCAACTAAAG3′
65.5
200
X
5′GTTCAGCTCTGTGAGTGAAA3′
68.5
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100
Y
5′CTTGGAGACCTTTGTGGAAG3′
56.5
250
3.G显带核型分析：33例血标本和11例羊水标本均按常规进行G带染色分析核型。
二、结果
1.血淋巴细胞染色体分析结果：PRINS检测13、16及18号染色体，间期细胞核上显示2个荧光信号；检测X染色体，女性标本间期核显示 2个荧光信号，男性标本间期核显示1个荧光信号；检测Y染色体，男性标本间期核显示1个荧光信号，女性标本间期核显示荧光信号的细胞核数小于1%。在中期染色体片上，所有靶染色体均为着丝粒被特异标记。33例标本的PRINS结果均与核型分析结果一致，见表2。 表2 应用PRINS对外周血淋巴细胞染色体的分析结果 染色体
, 百拇医药
例数
未培养间期细胞核
中期染色体
核型
13
10
95.2%的细胞
显示2个信号
13号染色体着丝粒
被特异标记
46，-*
16
5
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87.7%的细胞
显示2个信号
16号染色体着丝粒
被特异标记
46，-*
18
5
89.5%的细胞
显示2个信号
18号染色体着丝粒
被特异标记
46，-*
, http://www.100md.com X
4(f)
94.4%的细胞
显示2个信号
X染色体着丝粒
被特异标记
46,XX
3(m)
86.6%的细胞
显示1个信号
X染色体着丝粒
被特异标记
46,XY
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Y
3(m)
90.2%的细胞
显示1个信号
Y染色体着丝粒
被特异标记
46,XY
3(f)
<1%的细胞
显示荧光信号
无染色体
被特异标记
46,XX
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注：f:女性；m:男性；-* 为XX或XY(表3同)
2.羊水细胞染色体分析结果：如表3示，用PRINS方法检测13、16及18号染色体，羊水细胞间期核均显示2个荧光信号，经羊水核型分析证实胎儿确为正常二倍体；检测X染色体，1例羊水细胞间期核显示2个荧光信号，核型分析证实胎儿为女性；2例羊水细胞间期核显示1个荧光信号，核型分析证实胎儿为男性。
表3 应用PRINS对羊水细胞染色体的分析结果 靶染色体
例数
未培养间期细胞核
核型
13
4
, 百拇医药
90.2%的细胞显示2个荧光信号
46，-*
16
2
86.8%的细胞显示2个荧光信号
46，-*
18
2
95.1%的细胞显示2个荧光信号
46，-*
X
1
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46,XX
X
2
76.7%的细胞显示1个荧光信号
46,XY
三、讨论
我们在未培养的淋巴细胞和羊水细胞间期核上进行13、16、18、X和Y染色体的PRINS，均获得了正确的染色体计数。如在常染色体13、16及18的分析中，间期细胞核86.8%以上均显示2个荧光信号，虽然有个别非特异标记，但不存在对染色体数目进行判断分析的困难；在同时进行的中期染色体PRINS，分别可见一对同源靶染色体的着丝粒被特异标记，说明间期核和中期染色体的PRINS结果完全符合，进一步做核型分析也证实这些标本(包括成年人和胎儿)均为二倍体。在性染色体的研究中，PRINS检测X染色体，女性血标本的间期核均显示2个荧光信号，男性血标本间期核均显示1个荧光信号；同时进行的中期染色体PRINS，在女性标本2条带黄绿色荧光标记的X染色体清晰可见，而男性标本仅见1条着丝粒被特异标记的X染色体；PRINS检测Y染色体，女性间期淋巴细胞核不显示荧光信号，男性间期淋巴细胞核均显示一个荧光信号，中期染色体片Y染色体着丝粒被特异标记，经核型分析上述结果完全正确。对羊水细胞检测X染色体，其中1例羊水细胞间期核显示2个荧光信号，羊水核型分析证实胎儿为女性46,XX；2例羊水细胞间期核均显示1个荧光信号，羊水核型分析证实胎儿为男性46,XY。本结果说明用针对13、16、18、X和Y染色体的引物，PRINS可以不经培养制备中期染色体，直接在淋巴细胞间期核或羊水细胞间期核上对这5条染色体进行计数分析。只要根据不同染色体正确设计特异的引物，严格掌握引物退火温度，其他所有的染色体亦可用此法进行染色体数目分析。
, http://www.100md.com
本课题为国家“九五”科技攻关资助项目(96-904-06-09)
参考文献
1 Koch J, Kovraa S, Petersen K, et al. Oligonucleotide-priming methods for the chromosome-specific labelling of alpha satellite DNA in situ. Chromosoma，1989, 98: 259-265.
2 李峰，钟镐镐，由江峰.引物介导的原位标记技术在染色体计数分析中的应用.中华病理学杂志，1998， 27：233-234.
3 Pellestor F, Girardet A, Lefort G, et al. Use of the primed in situ labelling (PRINS)technique for a rapid detection of chromosome 13, 16, 18, 21, X and Y. Hum Genet， 1995, 95:12-17.
(收稿：1998-03-24 修回：1998-09-01), 百拇医药