血管内皮生长因子基因治疗肢体动脉梗塞病的实验研究
作者：盛琴慧 朱国英 周爱儒 高炜 霍勇 冷冰 朱小君 牛大地 马大龙 陈光慧 汤健
单位：100083 北京医科大学心血管研究所
关键词：基因疗法；内皮生长因子；外周血管疾病
中华医学杂志990216 【摘要】 目的 验证血管内皮生长因子(VEGF)基因治疗肢体动脉梗塞病的有效性和安全性。方法 构建重组VEGF基因的真核表达载体pcD2/VEGF。有效性试验：制备肢体动脉梗塞病的猴模型，通过肌肉基因缝线法和肌内多点注射法导入VEGF基因，对照组转等量空载质粒。安全性试验：将超剂量和治疗剂量的VEGF基因分别导入5只小鼠(1 000 μg，为小鼠治疗剂量20 μg的50倍)、10只大鼠(2 000 μg，为治疗剂量的10倍)和5只猴(2 000 μg，治疗剂量)体内观察其毒副作用，并采用PCR法和间接ELISA法进行分子遗传学和免疫学的评估。结果 转VEGF基因后1周血管造影即显示，结扎点附近有较多充盈小血管，远端动脉开始充盈，2周时更为明显，1月后新生小血管最为丰富，可见远端动脉明显充盈，血管计数显示VEGF组(1周时5/100 cm2、1月12/100 cm2)明显多于对照组(1周1/100 cm2、1月4/100 cm2)。生化等检查，证明VEGF基因对肝肾功能等无明显影响，未见肿瘤或其它病理变化。导入的VEGF基因可在局部肌肉组织中保存4个月以上，不累及其它各脏器组织，且无循环抗体产生。结论 肌肉导入VEGF基因治疗肢体动脉梗塞病是有效和安全的，通过药审后可用于临床试验。
, 百拇医药
Vascular endothelial growth factor gene therapy for peripheral artery disease：experimental study SHENG Qinhui, ZHU Guoying, ZHOU Airu, et al. Institute of Cardiovascular Research, Beijing Medical University, Beijing 100083
【Abstract】 Objective To Study experimentally VEGF gene for treatment of peripheral artery disease.Methods The human VEGF cDNA was cloned into the eukaryotic expression vector pcD2.Using gene suture, the recombinant plasmid was transferred into the hindlimbs′ adductor of Rhesus monkey, of which the distal end of the external iliac arteries were ligated and the femoral arteries were completely excised. With angiography, the biological effect of VEGF gene in experimental animals was investigated. Safey tests were analyzed by transferring of VEGF into mouse, rat, and Rhesus monkey, evaluated by biochemistry analysis, histopathological examination, PCR, and indirect ELISA.Results The transfer of VEGF gene stimulated the formation of focal microvessels, established collateral circulation, and augmented blood perfusion. The system had no adverse effect and remarkable pathological change in mouse, rat, and Rhesus monkey.Conclusion The experimental studies indicated that VEGF would be effective and safe for clinical trial after approval.
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【Key words】 Gene therapy Endothelial growth factor Peripheral vascular diseases
(Natl Med J China, 1999,79:129-132)
肢体动脉梗塞病是一类严重的血管病，目前尚无有效治疗方法，最终需行截肢手术，预后很差[1]。因此，研究新的治疗方法甚为迫切。我们用自行构建的重组人血管内皮生长因子(VEGF)基因，制备成基因缝线，证明可有效促进闭塞血管的侧支循环，通过小鼠、大鼠及猴的急慢性毒副作用试验，表明治疗基本安全，符合临床试验的要求。
材料和方法
一、材料
1.重组VEGF基因质粒：为进一步提高VEGF的表达效率，将我室构建的pcDNA3/VEGF质粒[2]再经BamHI和XbaI消化，连入同样酶切的pcD2高效真核表达载体，构建成pcD2/VEGF质粒，其中目的基因为可编码121个氨基酸的VEGF121，含有信号肽序列，构建路径见图1。采用碱裂解法提取质粒，经PEG-8000纯化后复溶于水备用。
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图1 pcD2/VEGF质粒的构建 2.VEGF基因缝线和基因转移：将一定长度的2号医用缝合线浸泡于适量1%鱼精蛋白的注射液中，晾干，反复多次，直到鱼精蛋白溶液全部吸附于缝线上，再反复涂抹所需量的质粒，晾干后备用，以上操作全部在无菌室内进行。体内基因转移采用肌肉内基因缝线法和肌肉内多点注射法。
3.肢体动脉梗塞病动物模型：健康雌性恒河猴5只，体重4～5 kg，由中国医学科学院猴饲养中心提供。应用肌内注射氯胺酮(10 mg/kg)麻醉。转基因前3天，于猴左侧大腿内侧肌群内多点注射肌内再生剂0.5%丁哌卡因，使局部肌肉再生，便于摄取外源基因。3天后，同侧下肢行髂外动脉远端和分支切断术，造成下肢闭塞性血管病模型。
二、方法
1.有效性试验：闭塞性血管病的猴模型，实验组(3只)转pcD2/VEGF基因(基因缝线1 200 μg，注射800 μg，总量为2 mg)，对照组(2只)同法转等量空载质粒pcD2。于基因转移前、基因转移后1周、2周、1月、3月、6月分别行髂动脉造影术(6F，cordis pigtail)，经右侧股动脉插管，导管头端置于腹主动脉，尾端连接高压注射器以注入76%泛影葡胺，采用连续电影摄影记录造影结果，以观察新生血管和侧支循环的形成情况。血管造影机为德国西门子公司，摄影速度为25祯/秒。
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2.安全性试验：(1)小鼠急性毒性试验：健康昆明小鼠5只，雄性，体重20 g左右。通过基因缝线和肌肉注射法向体内转移pcD2/VEGF基因1 000 μg(为小鼠基因治疗剂量20 μg的50倍)。缝线后连续10天观察小鼠有无死亡或异常表现。(2)大鼠毒副作用试验：正常Wistar雄性大鼠10只，体重200 g左右。随机分组，5只转移pcD2/VEGF基因2 000 μg(为大鼠基因治疗剂量200 μg的10倍)，5只为等量生理盐水对照组。1个月后断头处死动物，取血进行肝、肾功能等生化指标检测，另取脑、心、肝、脾、肺、肾、睾丸及缝线局部肌肉组织，作病理检查。(3)猴的毒副作用试验：材料和方法同有效性试验。于血管造影同时取血进行生化检测，6个月后行腹部B型超声、全身CT扫描及眼底检查，处死动物后行病理观察。
3.分子遗传学及免疫学评估：大鼠分别于肌内基因缝线转移pcD2/VEGF 200 μg，于缝线后1周、2周、1月、2月、4月分批处死动物，取血采用间接ELISA法检测有无VEGF抗体产生；同时分别提取缝线处肌肉及心、肝、肺、肾、脑、睾丸等脏器DNA，通过PCR法了解基因的分布情况和持续时间。
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结 果
一、有效性试验
于结扎当日血管造影，可见左侧股动脉分支结扎端闭塞，远端血管不能充盈，表明动脉闭塞模型制备成功。术后1周即显示，VEGF组猴的结扎点附近有较多充盈小血管，由于部分桥侧支循环的形成，断点远端的动脉开始充盈，而pcD2对照猴结扎点附近充盈小血管数量很少，新生血管计数VEGF组(5/100 cm2)明显多于对照组(1/100 cm2)。术后2周，VEGF组结扎点周围有丰富的充盈小血管，断点远端动脉充盈良好，而对照组仍无明显变化。1个月后，VEGF组结扎点周围的小血管更为丰富，远端动脉明显充盈，血管计数12/100 cm2。而对照组的结扎点附近虽有少量小血管生成，远端动脉也有一定充盈(代偿作用)，但很不充分，血管计数仅为4/100 cm2。明显差于同期的VEGF基因治疗组(图2，3)。此后随访3月与6月血管造影，VEGF基因组及pcD2对照组均不再有明显变化，且未见血管瘤生成。
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图2 转基因后2周血管造影.上图为对照(转pcD2)，可见闭塞血管近端至远端仅有少量新生血管形成；下图为转pcD2/VEGF基因，可见有较明显的新生血管和侧支循环形成.
图3 转基因后1月血管造影左图为对照(转pcD2)，示新生血管较对照2周时只有少许增加；中图为转pcD2/VEGF基因，显示明显增多的新生血管和侧支循环 右图为减影图
二、安全性试验
1.毒副作用试验：(1)小鼠连续观察10天，全部存活，无异常表现。(2)大鼠1个月内动物无异常表现，全部存活。1个月后肝肾功能检测未见异常(表1)，组织学观察，除肌肉组织血管分布VEGF组较对照组丰富，其它重要脏器均未见异常病理变化。(3)猴转基因前后不同时期转VEGF基因后，对肝、肾功能等也无明显影响(表2)；6月后眼底检查可见血管分布及形态正常，未见血管增生；全身CT、腹部超声及各脏器组织病理学检查，未见肿瘤及其它异常病理变化。以上结果说明，体内转移治疗剂量和超剂量的VEGF基因对小鼠、大鼠及猴均无明显毒副作用。
, 百拇医药
表1 超剂量VEGF基因转移后大鼠肝肾功能测定(
±s) 组别
鼠数
丙氨酸转氨酶
(U/L)
天冬氨酸转氨酶
(U/L)
总胆红素
(μmol/L)
尿素氮
(mmol/L)
肌酐
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(μmol/L)
对照组
5
74±9
296±70
0.93±0.25
7.7±0.7
68.3±0.6
VEGF组
5
68±9
220±18*
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1.10±0.43*
7.0±1.4*
67.6±4.2*
对照组比较 *P>0.05
表2 肌肉内转VEGF基因后猴血液生化指标测定(±s) 时间
猴数
ALT
(U/L)
AST
(U/L)
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L
(mmol/L)
TG
(mmol/L)
血糖
(mmol/L)
肌酐
(μmol/L)
尿素氮
(mmol/L)
0周
5
14.5±7.8
, 百拇医药
29.5±2.2
2.4±0.3
0.58±0.64
4.2±1.0
79±14
6.55±0.07
2周
5
11.8±3.8
33.3±17.5
3.1±0.8
0.49±0.10
, 百拇医药
4.1±0.8
73±28
6.03±1.20
1月
5
12.5±0.7
30.0±10.5
2.4±1.0
0.44±0.07
3.3±1.4
78±18
6.90±1.40
, 百拇医药
6月
5
18.0±4.2
34.5± 2.1
3.4±0.6
0.67±0.10
3.4±0.7
84±14
6.55±1.06
2.分子遗传学及免疫学评估：于1周、2周、1月、2月、4月均可在缝线处肌肉内检测到外源性VEGF基因的分布，而体内各脏器均未发现有该基因的分布。间接ELISA法测定显示于转基因后不同时期，血中VEGF抗体均为阴性(图4)。
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注：上图为转基因2周，下图为转基因4月，0为阴性对照：M为DNA标记物；1肌肉；2心；3肝；4肾；5肺；6脑；7睾丸
图4 转pcD2/VEGF基因后体内VEGF基因的分布
讨 论
肢体动脉梗塞病的治疗，临床上主要采用血管成形术或外科搭桥术，风险大，并发症多，疗效并不显著，基因治疗为其开辟了一条新的途径。美国Isner等[2]用phVEGF165基因的动脉内水凝胶球囊导管进行基因转移，治疗家兔肢体血管闭塞症获得成功，并已获准进行临床试验，取得了初步疗效[3，4]。但水凝胶易被血流冲散，在动脉粥样硬化血管内的转移效率极低。我们利用Bupivacaine刺激肌肉再生以提高基因转移的效率[5]，采用肌肉内基因缝线法导入基因，操作简便，且可达到有效的治疗目的。
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我们先在肢体动脉梗塞的大鼠和犬模型上，应用pcDNA3/VEGF165进行局部肌肉基因缝线，结果表明能显著促进患肢的新生血管和侧支循环，减轻肢体坏死，称之为“分子搭桥术”[6，7]。为了进一步提高VEGF的表达效率，在pcDNA3/VEGF基础上，我们新构建了pcD2/VEGF121基因质粒，除CMV启动子外，还有内含子，可以提高启动子的作用，含有V1、V2片段，从而减弱抑制子的作用。血管平滑肌细胞转染的结果显示，pcD2/VEGF的表达效率高于pcDNA3/VEGF(待发表)。用该基因质粒对动脉闭塞的猴模型进行了治疗，可促进新生血管形成和侧支循环的建立，经连续6个月观察，未见新生血管无限制生长。实验证明，通过基因缝线，在缺血部位转移VEGF基因，可使血流迅速恢复，改善局部血供，防止组织坏死。
对小鼠、大鼠、恒河猴毒副作用观察，发现血生化指标和组织病理均无异常，显示了VEGF基因在动物体内的安全性。由此可见，VEGF基因对肢体动脉梗塞症可达到安全有效的治疗目的，成为治疗缺血组织恢复血供的新途径。
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本课题为国家“八六三”计划生物技术资助项目(BH-03)
参考文献 1 European Working Group on Critical Ischemia. Second European consensus document on chronic critical leg ischemia. Circulation, 1991,84(suppl IV):IV1-IV26.
2 Isner JM, Walsh K, Symes J, et al. Clinical protocol: Arterial gene transfer for therapeutic angiogenesis in patients with peripheral artery disease. Hum Gene Ther 1996,7:959-988.
3 Isner JM, Pieczek A, Schainfeld R, et al. Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene transfer of phVEGF165 in patient with ischemic limb. Lancet, 1996,348:370-374.
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4 Baumgartner I, Pieczek A, Manor O, et al. Constitutive expression of phVEGF165 after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia. Circulation, 1998,97:1114-1123.
5 Danko I, Fritz JD, Jiao S, et al. Pharmacological enhancement of in vivo foreign gene expression in muscle. Gene Ther,1994,1:114-121.
6 周爱儒,郑卫,邢德智,等.分子搭桥术-VEGF基因治疗大鼠闭塞性血管病的实验研究,中华医学杂志,1996，76:662-666.
7 郑卫,霍勇,邢德智,等.血管内皮生长因子基因治疗犬闭塞性血管病的初步研究,中华心血管病杂志，1998，26:62-64.
(收稿：1998-02-19 修回：1998-11-28), 百拇医药
单位：100083 北京医科大学心血管研究所
关键词：基因疗法；内皮生长因子；外周血管疾病
中华医学杂志990216 【摘要】 目的 验证血管内皮生长因子(VEGF)基因治疗肢体动脉梗塞病的有效性和安全性。方法 构建重组VEGF基因的真核表达载体pcD2/VEGF。有效性试验：制备肢体动脉梗塞病的猴模型，通过肌肉基因缝线法和肌内多点注射法导入VEGF基因，对照组转等量空载质粒。安全性试验：将超剂量和治疗剂量的VEGF基因分别导入5只小鼠(1 000 μg，为小鼠治疗剂量20 μg的50倍)、10只大鼠(2 000 μg，为治疗剂量的10倍)和5只猴(2 000 μg，治疗剂量)体内观察其毒副作用，并采用PCR法和间接ELISA法进行分子遗传学和免疫学的评估。结果 转VEGF基因后1周血管造影即显示，结扎点附近有较多充盈小血管，远端动脉开始充盈，2周时更为明显，1月后新生小血管最为丰富，可见远端动脉明显充盈，血管计数显示VEGF组(1周时5/100 cm2、1月12/100 cm2)明显多于对照组(1周1/100 cm2、1月4/100 cm2)。生化等检查，证明VEGF基因对肝肾功能等无明显影响，未见肿瘤或其它病理变化。导入的VEGF基因可在局部肌肉组织中保存4个月以上，不累及其它各脏器组织，且无循环抗体产生。结论 肌肉导入VEGF基因治疗肢体动脉梗塞病是有效和安全的，通过药审后可用于临床试验。
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Vascular endothelial growth factor gene therapy for peripheral artery disease：experimental study SHENG Qinhui, ZHU Guoying, ZHOU Airu, et al. Institute of Cardiovascular Research, Beijing Medical University, Beijing 100083
【Abstract】 Objective To Study experimentally VEGF gene for treatment of peripheral artery disease.Methods The human VEGF cDNA was cloned into the eukaryotic expression vector pcD2.Using gene suture, the recombinant plasmid was transferred into the hindlimbs′ adductor of Rhesus monkey, of which the distal end of the external iliac arteries were ligated and the femoral arteries were completely excised. With angiography, the biological effect of VEGF gene in experimental animals was investigated. Safey tests were analyzed by transferring of VEGF into mouse, rat, and Rhesus monkey, evaluated by biochemistry analysis, histopathological examination, PCR, and indirect ELISA.Results The transfer of VEGF gene stimulated the formation of focal microvessels, established collateral circulation, and augmented blood perfusion. The system had no adverse effect and remarkable pathological change in mouse, rat, and Rhesus monkey.Conclusion The experimental studies indicated that VEGF would be effective and safe for clinical trial after approval.
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【Key words】 Gene therapy Endothelial growth factor Peripheral vascular diseases
(Natl Med J China, 1999,79:129-132)
肢体动脉梗塞病是一类严重的血管病，目前尚无有效治疗方法，最终需行截肢手术，预后很差[1]。因此，研究新的治疗方法甚为迫切。我们用自行构建的重组人血管内皮生长因子(VEGF)基因，制备成基因缝线，证明可有效促进闭塞血管的侧支循环，通过小鼠、大鼠及猴的急慢性毒副作用试验，表明治疗基本安全，符合临床试验的要求。
材料和方法
一、材料
1.重组VEGF基因质粒：为进一步提高VEGF的表达效率，将我室构建的pcDNA3/VEGF质粒[2]再经BamHI和XbaI消化，连入同样酶切的pcD2高效真核表达载体，构建成pcD2/VEGF质粒，其中目的基因为可编码121个氨基酸的VEGF121，含有信号肽序列，构建路径见图1。采用碱裂解法提取质粒，经PEG-8000纯化后复溶于水备用。
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图1 pcD2/VEGF质粒的构建 2.VEGF基因缝线和基因转移：将一定长度的2号医用缝合线浸泡于适量1%鱼精蛋白的注射液中，晾干，反复多次，直到鱼精蛋白溶液全部吸附于缝线上，再反复涂抹所需量的质粒，晾干后备用，以上操作全部在无菌室内进行。体内基因转移采用肌肉内基因缝线法和肌肉内多点注射法。
3.肢体动脉梗塞病动物模型：健康雌性恒河猴5只，体重4～5 kg，由中国医学科学院猴饲养中心提供。应用肌内注射氯胺酮(10 mg/kg)麻醉。转基因前3天，于猴左侧大腿内侧肌群内多点注射肌内再生剂0.5%丁哌卡因，使局部肌肉再生，便于摄取外源基因。3天后，同侧下肢行髂外动脉远端和分支切断术，造成下肢闭塞性血管病模型。
二、方法
1.有效性试验：闭塞性血管病的猴模型，实验组(3只)转pcD2/VEGF基因(基因缝线1 200 μg，注射800 μg，总量为2 mg)，对照组(2只)同法转等量空载质粒pcD2。于基因转移前、基因转移后1周、2周、1月、3月、6月分别行髂动脉造影术(6F，cordis pigtail)，经右侧股动脉插管，导管头端置于腹主动脉，尾端连接高压注射器以注入76%泛影葡胺，采用连续电影摄影记录造影结果，以观察新生血管和侧支循环的形成情况。血管造影机为德国西门子公司，摄影速度为25祯/秒。
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2.安全性试验：(1)小鼠急性毒性试验：健康昆明小鼠5只，雄性，体重20 g左右。通过基因缝线和肌肉注射法向体内转移pcD2/VEGF基因1 000 μg(为小鼠基因治疗剂量20 μg的50倍)。缝线后连续10天观察小鼠有无死亡或异常表现。(2)大鼠毒副作用试验：正常Wistar雄性大鼠10只，体重200 g左右。随机分组，5只转移pcD2/VEGF基因2 000 μg(为大鼠基因治疗剂量200 μg的10倍)，5只为等量生理盐水对照组。1个月后断头处死动物，取血进行肝、肾功能等生化指标检测，另取脑、心、肝、脾、肺、肾、睾丸及缝线局部肌肉组织，作病理检查。(3)猴的毒副作用试验：材料和方法同有效性试验。于血管造影同时取血进行生化检测，6个月后行腹部B型超声、全身CT扫描及眼底检查，处死动物后行病理观察。
3.分子遗传学及免疫学评估：大鼠分别于肌内基因缝线转移pcD2/VEGF 200 μg，于缝线后1周、2周、1月、2月、4月分批处死动物，取血采用间接ELISA法检测有无VEGF抗体产生；同时分别提取缝线处肌肉及心、肝、肺、肾、脑、睾丸等脏器DNA，通过PCR法了解基因的分布情况和持续时间。
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结 果
一、有效性试验
于结扎当日血管造影，可见左侧股动脉分支结扎端闭塞，远端血管不能充盈，表明动脉闭塞模型制备成功。术后1周即显示，VEGF组猴的结扎点附近有较多充盈小血管，由于部分桥侧支循环的形成，断点远端的动脉开始充盈，而pcD2对照猴结扎点附近充盈小血管数量很少，新生血管计数VEGF组(5/100 cm2)明显多于对照组(1/100 cm2)。术后2周，VEGF组结扎点周围有丰富的充盈小血管，断点远端动脉充盈良好，而对照组仍无明显变化。1个月后，VEGF组结扎点周围的小血管更为丰富，远端动脉明显充盈，血管计数12/100 cm2。而对照组的结扎点附近虽有少量小血管生成，远端动脉也有一定充盈(代偿作用)，但很不充分，血管计数仅为4/100 cm2。明显差于同期的VEGF基因治疗组(图2，3)。此后随访3月与6月血管造影，VEGF基因组及pcD2对照组均不再有明显变化，且未见血管瘤生成。
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图2 转基因后2周血管造影.上图为对照(转pcD2)，可见闭塞血管近端至远端仅有少量新生血管形成；下图为转pcD2/VEGF基因，可见有较明显的新生血管和侧支循环形成.
图3 转基因后1月血管造影左图为对照(转pcD2)，示新生血管较对照2周时只有少许增加；中图为转pcD2/VEGF基因，显示明显增多的新生血管和侧支循环 右图为减影图
二、安全性试验
1.毒副作用试验：(1)小鼠连续观察10天，全部存活，无异常表现。(2)大鼠1个月内动物无异常表现，全部存活。1个月后肝肾功能检测未见异常(表1)，组织学观察，除肌肉组织血管分布VEGF组较对照组丰富，其它重要脏器均未见异常病理变化。(3)猴转基因前后不同时期转VEGF基因后，对肝、肾功能等也无明显影响(表2)；6月后眼底检查可见血管分布及形态正常，未见血管增生；全身CT、腹部超声及各脏器组织病理学检查，未见肿瘤及其它异常病理变化。以上结果说明，体内转移治疗剂量和超剂量的VEGF基因对小鼠、大鼠及猴均无明显毒副作用。
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表1 超剂量VEGF基因转移后大鼠肝肾功能测定(
±s) 组别鼠数
丙氨酸转氨酶
(U/L)
天冬氨酸转氨酶
(U/L)
总胆红素
(μmol/L)
尿素氮
(mmol/L)
肌酐
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(μmol/L)
对照组
5
74±9
296±70
0.93±0.25
7.7±0.7
68.3±0.6
VEGF组
5
68±9
220±18*
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1.10±0.43*
7.0±1.4*
67.6±4.2*
对照组比较 *P>0.05
表2 肌肉内转VEGF基因后猴血液生化指标测定(
±s) 时间猴数
ALT
(U/L)
AST
(U/L)
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L
(mmol/L)
TG
(mmol/L)
血糖
(mmol/L)
肌酐
(μmol/L)
尿素氮
(mmol/L)
0周
5
14.5±7.8
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29.5±2.2
2.4±0.3
0.58±0.64
4.2±1.0
79±14
6.55±0.07
2周
5
11.8±3.8
33.3±17.5
3.1±0.8
0.49±0.10
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4.1±0.8
73±28
6.03±1.20
1月
5
12.5±0.7
30.0±10.5
2.4±1.0
0.44±0.07
3.3±1.4
78±18
6.90±1.40
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6月
5
18.0±4.2
34.5± 2.1
3.4±0.6
0.67±0.10
3.4±0.7
84±14
6.55±1.06
2.分子遗传学及免疫学评估：于1周、2周、1月、2月、4月均可在缝线处肌肉内检测到外源性VEGF基因的分布，而体内各脏器均未发现有该基因的分布。间接ELISA法测定显示于转基因后不同时期，血中VEGF抗体均为阴性(图4)。
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注：上图为转基因2周，下图为转基因4月，0为阴性对照：M为DNA标记物；1肌肉；2心；3肝；4肾；5肺；6脑；7睾丸
图4 转pcD2/VEGF基因后体内VEGF基因的分布
讨 论
肢体动脉梗塞病的治疗，临床上主要采用血管成形术或外科搭桥术，风险大，并发症多，疗效并不显著，基因治疗为其开辟了一条新的途径。美国Isner等[2]用phVEGF165基因的动脉内水凝胶球囊导管进行基因转移，治疗家兔肢体血管闭塞症获得成功，并已获准进行临床试验，取得了初步疗效[3，4]。但水凝胶易被血流冲散，在动脉粥样硬化血管内的转移效率极低。我们利用Bupivacaine刺激肌肉再生以提高基因转移的效率[5]，采用肌肉内基因缝线法导入基因，操作简便，且可达到有效的治疗目的。
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我们先在肢体动脉梗塞的大鼠和犬模型上，应用pcDNA3/VEGF165进行局部肌肉基因缝线，结果表明能显著促进患肢的新生血管和侧支循环，减轻肢体坏死，称之为“分子搭桥术”[6，7]。为了进一步提高VEGF的表达效率，在pcDNA3/VEGF基础上，我们新构建了pcD2/VEGF121基因质粒，除CMV启动子外，还有内含子，可以提高启动子的作用，含有V1、V2片段，从而减弱抑制子的作用。血管平滑肌细胞转染的结果显示，pcD2/VEGF的表达效率高于pcDNA3/VEGF(待发表)。用该基因质粒对动脉闭塞的猴模型进行了治疗，可促进新生血管形成和侧支循环的建立，经连续6个月观察，未见新生血管无限制生长。实验证明，通过基因缝线，在缺血部位转移VEGF基因，可使血流迅速恢复，改善局部血供，防止组织坏死。
对小鼠、大鼠、恒河猴毒副作用观察，发现血生化指标和组织病理均无异常，显示了VEGF基因在动物体内的安全性。由此可见，VEGF基因对肢体动脉梗塞症可达到安全有效的治疗目的，成为治疗缺血组织恢复血供的新途径。
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本课题为国家“八六三”计划生物技术资助项目(BH-03)
参考文献 1 European Working Group on Critical Ischemia. Second European consensus document on chronic critical leg ischemia. Circulation, 1991,84(suppl IV):IV1-IV26.
2 Isner JM, Walsh K, Symes J, et al. Clinical protocol: Arterial gene transfer for therapeutic angiogenesis in patients with peripheral artery disease. Hum Gene Ther 1996,7:959-988.
3 Isner JM, Pieczek A, Schainfeld R, et al. Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene transfer of phVEGF165 in patient with ischemic limb. Lancet, 1996,348:370-374.
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4 Baumgartner I, Pieczek A, Manor O, et al. Constitutive expression of phVEGF165 after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia. Circulation, 1998,97:1114-1123.
5 Danko I, Fritz JD, Jiao S, et al. Pharmacological enhancement of in vivo foreign gene expression in muscle. Gene Ther,1994,1:114-121.
6 周爱儒,郑卫,邢德智,等.分子搭桥术-VEGF基因治疗大鼠闭塞性血管病的实验研究,中华医学杂志,1996，76:662-666.
7 郑卫,霍勇,邢德智,等.血管内皮生长因子基因治疗犬闭塞性血管病的初步研究,中华心血管病杂志，1998，26:62-64.
(收稿：1998-02-19 修回：1998-11-28), 百拇医药