血管舒缓素对PDGF诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响
作者：谈世进 金立仁 陈万春
单位：200233 上海市第六人民医院心内科
关键词：血管舒缓素；血小板源性生长因子；血管平滑肌细胞；3H-胸腺嘧啶；原癌基因c-myc
上海医学990213 【摘要】 目的 探讨了血管舒缓素对血小板趋化生长因子(PDGF)诱导培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖的影响。方法 取SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞进行培养，传至5代后，分组观察PDGF、PDGF+血管舒缓素组、PDGF+血管舒缓素+缓激肽受体拮抗剂组等。干预因素作用于血管平滑肌细胞(VSMC)，对3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)的掺入及原癌基因c-myc mRNA表达的影响。结果 1.PDGF可促进VSMC 3H-TdR的掺入和c-myc mRNA表达，这种表达在2小时时达高峰。2. 血管舒缓素可抑制PDGF诱导的VSMC 3H-TdR的掺入和c-myc mRNA表达，这种抑制作用可被缓激肽受体拮抗剂所阻断。结论 血管舒缓素可抑制PDGF诱导的VSMC增殖作用。
, 百拇医药
Effect of kallikrein on PDGF-induced proliferation of cultured rat aortic vascular smooth muscle cells
TAN Shijin, JIN Liren, CHEN Wanchun
Department of Cardiology, Shanghai Sixth People' Hospital, Shanghai (200233)
【Abstract】 Objective The purpose of the present study was to explore the effect of Kallikrein on PDGF-induced proliferation of rat aortic vascular smooth muscle cells (VSMC).Methods In vitro cultured rat aortic VSMC model was established. Cells of 4-6 passages were used for the experiment. At was divided into four groups: (1). Control; (2). PDGF (50ng/ml); (3). PDGF+Kallikrein(10u/ml); (4).PDGF+Kallikrein+Bradykinin receptor antagonist HOE140(10-4M). Proliferation of VSMC in culture was measured by 3H-TdR incorporation into cell DNA. The expression of VSMC c-myc mRNA was determined by using the RT-PCR technique.Results (1). Compared with the control, PDGF significantly increased the 3H-TdR incorporation and the expression of c-myc mRNA in cultured VSMC, and the expression of c-myc mRNA peaked at 2h (P<0.05). (2). The action of PDGF was inhibited by kallikrein. The effect of kallikrein on PDGF can be blocked by HOE140.Conclusion These results suggest that kallikrein can inhibit the proliferation of cultured VSMC induced by PDGF.
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【Key words】 Kallikrein PDGF Rat aortic vascular smooth muscle cells c-myc mRNA
经皮冠状动脉扩张术(PTCA)的开展，给治疗冠心病又增加了新的手段。但临床观察表明，有30%～50%的患者在行PTCA术后3～6个月内，发生了冠脉再狭窄[1]。进一步研究发现，再狭窄的实质就是冠脉损伤后，血管平滑肌细胞(VSMC)过度的增殖[2]。如何预防VSMC的增殖，也成为预防再狭窄的关键。血管舒缓素(Kallikein)在临床中一般被用于扩张血管，降低血压的。据报道，它是通过一氧化氮(NO)而实施其生物活性的[3]。PDGF作为血清中主要的有丝分裂因子，能强烈地促进VSMC增殖[4]。原癌基因c-myc mRNA作为早期反应基因，具有转录、调控的功能，被认为是VSMC增殖的一个重要信号。本实验拟以体外培养的VSMC的模型，观察血管舒缓素对PDGF诱导的VSMC增殖的影响。
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材料与方法
一、材料与试剂
SD大鼠由上海市放射医学研究所提供。PDGF与缓激肽受体拮抗剂Hoe140系Sigma公司产品，M199培养基，反转录酶购自美国Gibco公司；TaqDNA聚合酶购自Promeg公司，3H-TdR购自上海原子核研究所，血管舒缓素为上海生化制药厂提供。根据文献[5]，c-myc,β-actin基因的引物由中科院细胞所合成，c-myc(203bp)上游：5′-TTCCACGGCCTTCTCTCC-3′，下游：5′-AGCCCGACTCCGACCTCT-3′；β-actin(540bp)上游：5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3′，下游：5′-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3′。
二、方法与步骤
, http://www.100md.com (一) 动脉血管平滑肌细胞(VSMC)培养 取250g左右的SD大鼠，雌雄不拘，经3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，开胸取胸主动脉，采用组织贴块法行中层VSMC培养，传第4～6代细胞用于实验。根据实验需要分成以下4组：(1). 对照组；(2). PDGF组(50ng/ml)；(3). PDGF+血管舒缓素组(10μ/ml)；(4). PDGF+血管舒缓素组+缓激肽受体拮抗剂Hoe140(10-4M)。
(二) 3H-TdR的掺入测定 细胞传至第5代，将细胞分装入24孔培养板(2×104个细胞/孔)，培养48小时后，待细胞生长稳定，根据分组分别加入各种干预因素，继续培养24小时后，分别加入3H-TdR(25μci/孔)，16小时后，分别用多头细胞收集器收集细胞，测定其掺入量。
(三) c-myc mRNA表达测定 参照文献[6]，采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定VSMC c-myc mRNA表达。即采用一步法抽提总RNA，经反转录后，行PCR，其反应的条件为：(1). 变性、退火和延伸的温度与时间分别为：94℃，1分钟、55℃，1分钟和72℃，2.5分钟，共35次循环。(2). β-actin：所需温度与时间分别为：94℃，45秒、60℃，1分钟和72℃，2. 5分钟，共进行30次循环。PCR首次循环为94℃、3分钟，结束前为72℃、20分钟。反应结束后，取10μl PCR反应液，在2%琼脂糖凝胶电泳(含0.5mg/ml的溴化乙锭)，以MG0782为分子量标准。电泳结束，紫外灯下摄片，光密度扫描。统计学处理：数据以
±s表示，两组间比较采用配对t检验，P<0.05有显著性差异。
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结果
一、血管舒缓素对PDGF诱导的血管平滑肌细胞3H-TdR掺入的影响
见图1。
图1 血管舒缓素对PDGF诱导的血管平滑肌细胞3H-TdR掺入的影响。*P<0.01，与对照组相比。
从图中可看出，血管舒缓素可抑制PDGF对血管平滑肌细胞3H-TdR的摄取，这种抑制作用可被缓激肽受体拮抗剂Hoe 140阻断。
二、PDGF诱导血管平滑肌细胞原癌基因c-myc mRNA表达的时间关系
见图2。
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图2 PCR结果(上图)与直条图(下图)显示PDGF诱导血管平滑肌细胞原癌基因c-myc表达的时间关系。* P<0.01,**P<0.05，与对照组相比。
从结果中可看出，PDGF作用于血管平滑肌细胞2小时时，c-myc mRNA表达达高峰，以后随着时间的增加，表达逐渐减少。
三、血管舒缓素及Hoe 140对PDGF诱导的血管平滑肌细胞c-myc mRNA表达的影响
见图3。
1： Mark: MG0782 2：静止对照组
3： PDGF+血管舒缓素 4： PDGF
, 百拇医药
5： PDGF+血管舒缓素+Hoe 140
图3 PCR结果(上图)与直条图(下图)显示血管舒缓素及Hoe 140对PDGF诱导的血管平滑肌细胞c-myc mRNA表达的影响，* P<0.05，与对照组相比。
从照片中，我们看到，PDGF作用于血管平滑肌细胞2小时时，表达较对照组明显增高，这种作用可被血管舒缓素所抑制，而血管舒缓素的抑制效应又被Hoe 140阻断。
讨论
PTCA术后冠脉再狭窄是困扰心脏介入治疗多年的一个难题。再狭窄的发生除了血小板激活、侵袭，白细胞趋化之外，实质就是VSMC的过度增生和迁移，如何抑制VSMC的增生，已成为预防再狭窄发生的关键。
血小板趋化生长因子(PDGF)作为一种致分裂原，可启动VSMC的增殖，促进VSMC的迁移。其存在于血小板、内皮细胞、平滑肌细胞等之中。血管损伤后从这些细胞内释放出来，参与再狭窄的发生[4]。血管舒缓素在以往的临床中多作为扩血管、降低血压的药物。本文探讨了血管舒缓素与PDGF作用于培养的VSMC，结果发现，PDGF促进VSMC对3H-TdR的摄取，诱导c-myc mRNA表达，且表达在2小时时达高峰。血管舒缓素可抑制PDGF的作用，这种抑制作用可被缓激肽受体拮抗剂Hoe 140阻断。结果提示，血管舒缓素可抑制PDGF诱导的VSMC增殖的作用。
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c-myc原癌基因是一种早期反应基因，可编码DNA结合蛋白，参与转录调控，调节细胞增殖与分化[7]。体外与体内多项实验均证实，c-myc mRNA表达与VSMC增殖密切相关。PDGF可启动c-myc等早期转录基因，使细胞进入细胞周期，促进细胞生长与分裂。本实验发现PDGF促进3H-TdR的掺入，也证实了以往的报道。血管舒缓素通过何种机制抑制VSMC增殖及c-myc原癌基因表达，目前尚不清楚。本实验发现，血管舒缓素的作用可被缓激肽受体拮抗剂所阻断，提示血管舒缓素可能是通过缓激肽受体起作用的，据报道，血管舒缓素可以被降解为缓激肽，而缓激肽可产生重要的生物活性物质一氧化氮(NO)[3]，而NO具有抑制VSMC的增殖与迁移的作用[8]。因此血管舒缓素抑制PDGF诱导的VSMC增殖是否与NO有关，有待进一步探讨。
本课题获1996年上海市卫生局青年科研基金立项(96-16Y)。
, 百拇医药 参考文献
[1] Faxon DP, Currier JW. Prevention of post-PTCA restenosis. Ann NY Acad Scie, 1995,748:419-427.
[2] Forrester JS, Fishbein M, Helfant R, et al. A paradigm for restenosis based on cell biology: cluses for the development of new preventive therapies. J Am Coll Cardiol, 1991,17:758-769.
[3] Zhang X, Scicli GA, Xu XB, et al. Role of endothelial kinins in control of coronary nitric oxide production. Hypertension, 1997;30:1105-1111.
, 百拇医药
[4] Ross R, Raines EW, Bowen-Pope DF. The biology of platelet derived growth factor. Cell, 1986,46:155-169.
[5] Ogawa Y, Saibara T, Terashima M, et al. Suquential alteration of Proto-Oncogene expression in liver, spleen, kidney and brain of mice subjected to whole body irradiation. Oncology, 1996,53:412-416.
[6] 赵涵芳，程枫，章有章.用RT-PCR方法检测烧伤愈合时生长因子的表达.上海第二医科大学学报，1995，15(增刊)：37-41.
[7] Gadeau AP, Campan PM, Desgranges C. Indution of cell cycle-dependent genes during cell cycle progression of arterial smooth muscle cells in culture. J Cell Physsion, 1991,146:356-361.
[8] Sarker R, Meinberg EG, Stanley SC, et al. Nitric oxide reversibly inhibits the migration of cultured vascular smooth muscle cells. Cirl Res, 1996,78:225-230.
(收稿：1998-08-14 修回：1998-12-16), 百拇医药
单位：200233 上海市第六人民医院心内科
关键词：血管舒缓素；血小板源性生长因子；血管平滑肌细胞；3H-胸腺嘧啶；原癌基因c-myc
上海医学990213 【摘要】 目的 探讨了血管舒缓素对血小板趋化生长因子(PDGF)诱导培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖的影响。方法 取SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞进行培养，传至5代后，分组观察PDGF、PDGF+血管舒缓素组、PDGF+血管舒缓素+缓激肽受体拮抗剂组等。干预因素作用于血管平滑肌细胞(VSMC)，对3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)的掺入及原癌基因c-myc mRNA表达的影响。结果 1.PDGF可促进VSMC 3H-TdR的掺入和c-myc mRNA表达，这种表达在2小时时达高峰。2. 血管舒缓素可抑制PDGF诱导的VSMC 3H-TdR的掺入和c-myc mRNA表达，这种抑制作用可被缓激肽受体拮抗剂所阻断。结论 血管舒缓素可抑制PDGF诱导的VSMC增殖作用。
, 百拇医药
Effect of kallikrein on PDGF-induced proliferation of cultured rat aortic vascular smooth muscle cells
TAN Shijin, JIN Liren, CHEN Wanchun
Department of Cardiology, Shanghai Sixth People' Hospital, Shanghai (200233)
【Abstract】 Objective The purpose of the present study was to explore the effect of Kallikrein on PDGF-induced proliferation of rat aortic vascular smooth muscle cells (VSMC).Methods In vitro cultured rat aortic VSMC model was established. Cells of 4-6 passages were used for the experiment. At was divided into four groups: (1). Control; (2). PDGF (50ng/ml); (3). PDGF+Kallikrein(10u/ml); (4).PDGF+Kallikrein+Bradykinin receptor antagonist HOE140(10-4M). Proliferation of VSMC in culture was measured by 3H-TdR incorporation into cell DNA. The expression of VSMC c-myc mRNA was determined by using the RT-PCR technique.Results (1). Compared with the control, PDGF significantly increased the 3H-TdR incorporation and the expression of c-myc mRNA in cultured VSMC, and the expression of c-myc mRNA peaked at 2h (P<0.05). (2). The action of PDGF was inhibited by kallikrein. The effect of kallikrein on PDGF can be blocked by HOE140.Conclusion These results suggest that kallikrein can inhibit the proliferation of cultured VSMC induced by PDGF.
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【Key words】 Kallikrein PDGF Rat aortic vascular smooth muscle cells c-myc mRNA
经皮冠状动脉扩张术(PTCA)的开展，给治疗冠心病又增加了新的手段。但临床观察表明，有30%～50%的患者在行PTCA术后3～6个月内，发生了冠脉再狭窄[1]。进一步研究发现，再狭窄的实质就是冠脉损伤后，血管平滑肌细胞(VSMC)过度的增殖[2]。如何预防VSMC的增殖，也成为预防再狭窄的关键。血管舒缓素(Kallikein)在临床中一般被用于扩张血管，降低血压的。据报道，它是通过一氧化氮(NO)而实施其生物活性的[3]。PDGF作为血清中主要的有丝分裂因子，能强烈地促进VSMC增殖[4]。原癌基因c-myc mRNA作为早期反应基因，具有转录、调控的功能，被认为是VSMC增殖的一个重要信号。本实验拟以体外培养的VSMC的模型，观察血管舒缓素对PDGF诱导的VSMC增殖的影响。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、材料与试剂
SD大鼠由上海市放射医学研究所提供。PDGF与缓激肽受体拮抗剂Hoe140系Sigma公司产品，M199培养基，反转录酶购自美国Gibco公司；TaqDNA聚合酶购自Promeg公司，3H-TdR购自上海原子核研究所，血管舒缓素为上海生化制药厂提供。根据文献[5]，c-myc,β-actin基因的引物由中科院细胞所合成，c-myc(203bp)上游：5′-TTCCACGGCCTTCTCTCC-3′，下游：5′-AGCCCGACTCCGACCTCT-3′；β-actin(540bp)上游：5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3′，下游：5′-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3′。
二、方法与步骤
, http://www.100md.com (一) 动脉血管平滑肌细胞(VSMC)培养 取250g左右的SD大鼠，雌雄不拘，经3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，开胸取胸主动脉，采用组织贴块法行中层VSMC培养，传第4～6代细胞用于实验。根据实验需要分成以下4组：(1). 对照组；(2). PDGF组(50ng/ml)；(3). PDGF+血管舒缓素组(10μ/ml)；(4). PDGF+血管舒缓素组+缓激肽受体拮抗剂Hoe140(10-4M)。
(二) 3H-TdR的掺入测定 细胞传至第5代，将细胞分装入24孔培养板(2×104个细胞/孔)，培养48小时后，待细胞生长稳定，根据分组分别加入各种干预因素，继续培养24小时后，分别加入3H-TdR(25μci/孔)，16小时后，分别用多头细胞收集器收集细胞，测定其掺入量。
(三) c-myc mRNA表达测定 参照文献[6]，采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定VSMC c-myc mRNA表达。即采用一步法抽提总RNA，经反转录后，行PCR，其反应的条件为：(1). 变性、退火和延伸的温度与时间分别为：94℃，1分钟、55℃，1分钟和72℃，2.5分钟，共35次循环。(2). β-actin：所需温度与时间分别为：94℃，45秒、60℃，1分钟和72℃，2. 5分钟，共进行30次循环。PCR首次循环为94℃、3分钟，结束前为72℃、20分钟。反应结束后，取10μl PCR反应液，在2%琼脂糖凝胶电泳(含0.5mg/ml的溴化乙锭)，以MG0782为分子量标准。电泳结束，紫外灯下摄片，光密度扫描。统计学处理：数据以
±s表示，两组间比较采用配对t检验，P<0.05有显著性差异。, http://www.100md.com
结果
一、血管舒缓素对PDGF诱导的血管平滑肌细胞3H-TdR掺入的影响
见图1。
图1 血管舒缓素对PDGF诱导的血管平滑肌细胞3H-TdR掺入的影响。*P<0.01，与对照组相比。
从图中可看出，血管舒缓素可抑制PDGF对血管平滑肌细胞3H-TdR的摄取，这种抑制作用可被缓激肽受体拮抗剂Hoe 140阻断。
二、PDGF诱导血管平滑肌细胞原癌基因c-myc mRNA表达的时间关系
见图2。
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图2 PCR结果(上图)与直条图(下图)显示PDGF诱导血管平滑肌细胞原癌基因c-myc表达的时间关系。* P<0.01,**P<0.05，与对照组相比。
从结果中可看出，PDGF作用于血管平滑肌细胞2小时时，c-myc mRNA表达达高峰，以后随着时间的增加，表达逐渐减少。
三、血管舒缓素及Hoe 140对PDGF诱导的血管平滑肌细胞c-myc mRNA表达的影响
见图3。
1： Mark: MG0782 2：静止对照组
3： PDGF+血管舒缓素 4： PDGF
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5： PDGF+血管舒缓素+Hoe 140
图3 PCR结果(上图)与直条图(下图)显示血管舒缓素及Hoe 140对PDGF诱导的血管平滑肌细胞c-myc mRNA表达的影响，* P<0.05，与对照组相比。
从照片中，我们看到，PDGF作用于血管平滑肌细胞2小时时，表达较对照组明显增高，这种作用可被血管舒缓素所抑制，而血管舒缓素的抑制效应又被Hoe 140阻断。
讨论
PTCA术后冠脉再狭窄是困扰心脏介入治疗多年的一个难题。再狭窄的发生除了血小板激活、侵袭，白细胞趋化之外，实质就是VSMC的过度增生和迁移，如何抑制VSMC的增生，已成为预防再狭窄发生的关键。
血小板趋化生长因子(PDGF)作为一种致分裂原，可启动VSMC的增殖，促进VSMC的迁移。其存在于血小板、内皮细胞、平滑肌细胞等之中。血管损伤后从这些细胞内释放出来，参与再狭窄的发生[4]。血管舒缓素在以往的临床中多作为扩血管、降低血压的药物。本文探讨了血管舒缓素与PDGF作用于培养的VSMC，结果发现，PDGF促进VSMC对3H-TdR的摄取，诱导c-myc mRNA表达，且表达在2小时时达高峰。血管舒缓素可抑制PDGF的作用，这种抑制作用可被缓激肽受体拮抗剂Hoe 140阻断。结果提示，血管舒缓素可抑制PDGF诱导的VSMC增殖的作用。
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c-myc原癌基因是一种早期反应基因，可编码DNA结合蛋白，参与转录调控，调节细胞增殖与分化[7]。体外与体内多项实验均证实，c-myc mRNA表达与VSMC增殖密切相关。PDGF可启动c-myc等早期转录基因，使细胞进入细胞周期，促进细胞生长与分裂。本实验发现PDGF促进3H-TdR的掺入，也证实了以往的报道。血管舒缓素通过何种机制抑制VSMC增殖及c-myc原癌基因表达，目前尚不清楚。本实验发现，血管舒缓素的作用可被缓激肽受体拮抗剂所阻断，提示血管舒缓素可能是通过缓激肽受体起作用的，据报道，血管舒缓素可以被降解为缓激肽，而缓激肽可产生重要的生物活性物质一氧化氮(NO)[3]，而NO具有抑制VSMC的增殖与迁移的作用[8]。因此血管舒缓素抑制PDGF诱导的VSMC增殖是否与NO有关，有待进一步探讨。
本课题获1996年上海市卫生局青年科研基金立项(96-16Y)。
, 百拇医药 参考文献
[1] Faxon DP, Currier JW. Prevention of post-PTCA restenosis. Ann NY Acad Scie, 1995,748:419-427.
[2] Forrester JS, Fishbein M, Helfant R, et al. A paradigm for restenosis based on cell biology: cluses for the development of new preventive therapies. J Am Coll Cardiol, 1991,17:758-769.
[3] Zhang X, Scicli GA, Xu XB, et al. Role of endothelial kinins in control of coronary nitric oxide production. Hypertension, 1997;30:1105-1111.
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[4] Ross R, Raines EW, Bowen-Pope DF. The biology of platelet derived growth factor. Cell, 1986,46:155-169.
[5] Ogawa Y, Saibara T, Terashima M, et al. Suquential alteration of Proto-Oncogene expression in liver, spleen, kidney and brain of mice subjected to whole body irradiation. Oncology, 1996,53:412-416.
[6] 赵涵芳，程枫，章有章.用RT-PCR方法检测烧伤愈合时生长因子的表达.上海第二医科大学学报，1995，15(增刊)：37-41.
[7] Gadeau AP, Campan PM, Desgranges C. Indution of cell cycle-dependent genes during cell cycle progression of arterial smooth muscle cells in culture. J Cell Physsion, 1991,146:356-361.
[8] Sarker R, Meinberg EG, Stanley SC, et al. Nitric oxide reversibly inhibits the migration of cultured vascular smooth muscle cells. Cirl Res, 1996,78:225-230.
(收稿：1998-08-14 修回：1998-12-16), 百拇医药